DetectSyn: un metodo fluorescente rapido e imparziale per rilevare i cambiamenti nella densità delle sinapsi

Le sinapsi sono l'unità fondamentale della comunicazione tra i neuroni¹. Molte sinapsi tra neuroni all'interno delle stesse regioni danno origine a circuiti che mediano il comportamento². Le sinapsi sono costituite da un terminale presinaptico di un neurone che rilascia neurotrasmettitori o neuropeptidi che trasmettono informazioni ai recettori postsinaptici di un altro neurone. La somma dei segnali presinaptici determina se il neurone postsinaptico attiverà un potenziale d'azione e propagherà il messaggio ad altri neuroni.

La sinaptopatologia, la rottura delle sinapsi, si manifesta in malattie e disturbi caratterizzati da diminuzione del volume neurale, come il morbo di Alzheimer e il disturbo depressivo maggiore, con conseguente circuiti che non funzionano più in modo ottimale ^3,4,5. Il ripristino della densità delle sinapsi probabilmente è alla base dell'efficacia dei potenziali trattamenti per questi disturbi. Ad esempio, è stato recentemente dimostrato che l'aumento delle sinapsi è alla base dell'efficacia comportamentale degli antidepressivi rapidi⁶. Per esaminare rapidamente possibili trattamenti sinaptopatologici, i ricercatori richiedono tecniche che identifichino rapidamente i cambiamenti nei numeri delle sinapsi.

Le metodologie attuali sono lunghe e costose (microscopia elettronica, tomografia ad array), oppure esaminano solo i cambiamenti postsinaptici senza incorporare l'impegno presinaptico (analisi della colonna vertebrale, immunofluorescenza / colocalizzazione). Coloranti come DiI o proteine fluorescenti come GFP aiutano a visualizzare i neuroni e caratterizzano le spine postsinaptiche. Tuttavia, l'analisi della colonna vertebrale utilizza rapporti definiti dal ricercatore per determinare la morfologia, che può ridurre la riproducibilità⁷. Inoltre, il modo in cui le diverse classi della colonna vertebrale si riferiscono alle sinapsi funzionali è ancora in fase di scoperta⁸. La formazione della colonna vertebrale può essere transitoria e può riflettere la plasticità postsinaptica, ma queste spine potrebbero essere eliminate prima di stabilizzarsi in una sinapsi con un neurone presinaptico⁹.

La colocalizzazione fornisce un proxy migliore per le sinapsi rispetto all'analisi della colonna vertebrale perché si può immunostain per le proteine presinaptiche e postsinaptiche. Tuttavia, le proteine sinaptiche possono produrre bassi valori di colocalizzazione perché le proteine sono giustapposte e potrebbero non sovrapporsi in modo coerente. Pertanto, poiché le proteine non sono completamente sovrapposte, le tecniche di colocalizzazione potrebbero non misurare con precisione i cambiamenti nella formazione delle sinapsi a causa di queste informazioni mancanti. Infine, sebbene sia la microscopia elettronica (EM) che la tomografia array forniscano immagini ad alta risoluzione delle sinapsi, richiedono molto tempo. EM richiede inoltre attrezzature specializzate e i ricercatori sono limitati a piccoli volumi di tessuto per ogni dato esperimento. Mentre la tomografia ad array fornisce elegantemente la possibilità di selezionare molte proteine su sezioni ultrasottili e può essere combinata con EM¹⁰, questa tecnica può essere troppo laboriosa e al di là dello scopo degli esperimenti che devono eseguire rapidamente la scansione per i cambiamenti nella formazione delle sinapsi.

DetectSyn è un'applicazione specifica del Duolink Proximity Ligation Assay. Il test PLA consente la rilevazione generale delle interazioni proteina-proteina. DetectSyn collega le misure postsinaptiche proxy amplificando un segnale fluorescente emesso da proteine pre- e postsinaptiche taggate entro 40 nm l'una dall'altra. Se le proteine sinaptiche sono entro 40 nm, come all'interno di una fessura sinaptica, allora gli anticorpi secondari, che contengono sonde di DNA, si ibridano in DNA circolare. Questo DNA circolare ibridato esprime una sonda fluorescente, che viene poi amplificata e rilevata con tecniche standard di microscopia fluorescente (vedi Figura 1). Fondamentalmente, a differenza della tomografia EM e array, questa tecnica non richiede attrezzature specializzate e richiede circa la stessa quantità di tempo dell'immunoistochimica standard. L'accessibilità di questa tecnica, quindi, consente ai ricercatori al di fuori delle istituzioni ad alta intensità di ricerca di partecipare alla ricerca sinaptopatologica. Inoltre, questa tecnica può esaminare i cambiamenti della densità sinaptica in più regioni del cervello all'interno di un singolo esperimento, offrendo una rappresentazione più olistica dei cambiamenti sinaptici dovuti a malattie o trattamenti.

L'isolamento di cellule e tessuti dagli animali è stato conforme alla Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali di Wake Forest

NOTA: Questo protocollo viene utilizzato su campioni già trattati e fissati secondo specifici paradigmi e requisiti sperimentali. A scopo dimostrativo, la formazione di sinapsi dovuta al rapido trattamento antidepressivo viene utilizzata per evidenziare questa tecnica di rilevamento delle sinapsi⁶. I neuroni precedentemente coltivati su coverslip, trattati, fissati in paraformaldeide al 4% (PFA) e conservati in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) saranno utilizzati per evidenziare le procedure in vitro. Il tessuto ippocampale precedentemente affettato (spesso 25 μm) da topi trattati, perfuso transcardialmente con PBS ghiacciato e PFA al 4% e quindi conservato in crioprotettore sarà utilizzato per evidenziare le procedure della fetta. Si prega di vedere ^11,12 per ulteriori informazioni su come coltivare neuroni o perfondere transcardialmente i roditori. Vedere la Figura 1 per una rappresentazione grafica di questa procedura.

Figura 1: Rappresentazione grafica del test DetectSyn. Dopo aver permeabilizzato le membrane cellulari, gli anticorpi primari per Synapsin1 e PSD95 si legano a queste proteine sinaptiche. I secondari con tag oligonucleotidici si legano quindi agli anticorpi primari. Se Synapsin1 e PSD95 sono entro 40 nm, come in una sinapsi, allora gli oligonucleotidi interagiscono e un tag fluorescente viene amplificato. Questo segnale fluorescente può quindi essere ripreso tramite microscopia standard e analizzato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Risciacquare i campioni

1. Risciacquare i campioni con 500 μL di 1x PBS + 0,75% glicina per 5 min 3 volte con agitazione delicata su uno shaker orbitale per rimuovere PFA residuo o crioprotettore.

2. Blocca e permeabilizza i campioni

1. Preparare la soluzione di blocco e permeabilizzazione (10% di siero d'asino normale, 0,25% Tween 20) in 1x PBS. Preparare abbastanza da usare per il blocco, le incubazioni primarie e secondarie.
2. Ai campioni (ad esempio, coverslips o fette fluttuanti) in 24 piastre di pozzetto, aggiungere 500 μL di soluzione di blocco e permeabilizzazione. Assicurarsi che ogni pozzetto contenga un campione diverso e sia opportunamente etichettato per evitare che i campioni vengano scambiati.
3. Incubare i campioni a temperatura ambiente (RT) per 60 minuti per le cellule in coltura o 2 ore per il tessuto affettato. Utilizzare uno shaker orbitale per un'agitazione delicata.

3. Incubare campioni in anticorpi primari

1. Preparare gli anticorpi primari nel tampone di blocco:
   1. Preparare densità postsinaptica 95 (PSD95; 1:500, policlonale di coniglio), Synapsin1 (1:500, monoclonale di topo), MAP2 (1:400, policlonale di pollo)
   2. Preparare un'aliquota di controllo negativa che ometta una delle coppie sinaptiche (ad esempio, senza PSD95)
2. Rimuovere con attenzione la soluzione di blocco con una pipetta Pasteur di plastica. Cerca di rimuovere il più possibile senza disturbare le cellule o strappare il tessuto.
3. Per le cellule coltivate:
   1. Foderare una grande capsula di Petri di plastica con parafilm. Trasferire con cura le coperture sul parafilm usando una pinza.
   2. Aggiungere con attenzione 60 μL della soluzione anticorpale primaria nella parte superiore dei coverslip. Assicurarsi di non versare la soluzione anticorpale primaria sul lato del coverslip.
   3. Per fornire umidità ed evitare che i campioni si secchino durante il periodo di incubazione, aggiungere acqua ultrapura a una capsula di Petri più piccola e disporre con cura la piccola capsula di Petri attorno alle coperture.
   4. Coprire la grande capsula di Petri e incubare le cellule coltivate per 1 ora a RT.
4. Per il tessuto affettato:
   1. Aggiungere con attenzione 250 μL della soluzione anticorpale primaria alle fette fluttuanti in una piastra a 24 pozzetti.
   2. Coprire la piastra e incubare il tessuto durante la notte a 4 °C con una delicata agitazione su uno shaker orbitale.

4. Lavare i campioni, quindi incubare in anticorpi secondari

1. Preparare gli anticorpi secondari nel tampone bloccante:
   1. Prepara Asino anti-mouse (1:5), asino anti-coniglio (1:5), asino anti-pollo (1:400).
   2. In questa fase, è possibile ottenere ulteriori controlli tecnici preparando un'aliquota secondaria che omette il secondario anti-topo o anti-coniglio.
2. Per le cellule coltivate:
   1. Usando una pinza, toccare con attenzione la soluzione primaria dalle coperture su un tovagliolo di carta
   2. Utilizzando una pinza, trasferire con cura le coperture alla loro piastra originale a 24 pozzetti riempita con 500 μL di 1x PBS.
3. Per il tessuto affettato:
   1. Rimuovere con attenzione la soluzione anticorpale primaria con una pipetta pasteur di plastica. Cerca di rimuovere il più possibile senza strappare il tessuto.
   2. Aggiungere 500 μL di 1x PBS
4. Lavare i campioni per 10 min 3 volte in 1x PBS con agitazione delicata su uno shaker orbitale. Durante questo periodo, portare tutti i tamponi di lavaggio a RT.
   1. Durante questo periodo, cambia il parafilm nella grande capsula di Petri
5. Per le cellule coltivate:
   1. Usando la pinza, trasferire con cura le coperture sulla grande capsula di Petri parafilmata
   2. Aggiungere con attenzione 40 μL della soluzione anticorpale secondaria nella parte superiore dei coverslip. Assicurarsi di non versare la soluzione anticorpale secondaria sul lato del coperchio.
   3. Se necessario, aggiungere più acqua ultrapura a una capsula di Petri più piccola e disporre con cura la piccola capsula di Petri attorno alle coperture.
   4. Coprire la grande capsula di Petri
6. Per il tessuto affettato:
   1. Aggiungere con attenzione 250 μL della soluzione anticorpale secondaria alle fette fluttuanti in una piastra a 24 pozzetti.
   2. Coprire il piatto
      NOTA: Da qui in poi, proteggere i campioni dalla luce avvolgendo le parti superiori delle piastre con un foglio.
7. Incubare i campioni a 37 °C per 1 ora

5. Legatura

1. Mescolare il calcio di legatura 1:5 in acqua di grado molecolare.
2. Come nel paragrafo 4, trasferire con cura i coverslip e rimuovere la miscela secondaria dal tessuto affettato.
3. Lavare i campioni in 500 μL di tampone di lavaggio A
   1. Per le cellule coltivate, lavare 2 volte per 5 minuti. Per il tessuto affettato, lavare 2 volte per 10 minuti. Utilizzare un'agitazione delicata su uno shaker orbitale per entrambi.
   2. Durante questo periodo, cambia il parafilm nella grande capsula di Petri
4. Mantenendo la ligasi su un blocco freddo, diluire la ligasi 1:40 nel calcio di legatura dal passaggio 5.1. Eseguire questa diluizione immediatamente prima di aggiungere la ligasi ai campioni.
5. Come nel paragrafo 4, rimuovere il più possibile il tampone di lavaggio A dai campioni prima di aggiungere la ligasi.
6. Per le cellule in coltura: trasferire le coperture alla capsula di Petri parafilmata. Aggiungere 40 μL della miscela di legatura alle coperture, disporre piccole piastre di Petri piene d'acqua attorno alle coperture e coprire la grande capsula di Petri.
7. Per il tessuto affettato: aggiungere 250 μL della miscela di legatura dal passaggio 5.4 a ciascun pozzetto e coprire la piastra.
8. Incubare i campioni per 30 minuti a 37 °C.

6. Amplificazione

1. Mescolare lo stock di amplificazione 1:5 in acqua di grado molecolare.
2. Come nella sezione 4, trasferire con attenzione le coperture e rimuovere la miscela di legatura dal tessuto affettato.
3. Lavare i campioni in 500 μL di tampone di lavaggio A
   1. Per le cellule coltivate, lavare 2 volte per 2 minuti. Per il tessuto affettato, lavare 2 volte per 10 minuti. Utilizzare un'agitazione delicata su uno shaker orbitale per entrambi.
   2. Durante questo periodo, cambia il parafilm nella grande capsula di Petri
4. Eseguire questa diluizione immediatamente prima di aggiungere la polimerasi ai campioni. Mantenendo la polimerasi su un blocco freddo, diluire la polimerasi
   1. Per le cellule in coltura, diluire la polimerasi 1:80 nello stock di amplificazione dal punto 6.1.
   2. Per il tessuto affettato, diluire la polimerasi 1:40 nel materiale di amplificazione dal punto 6.1.
5. Come nel passaggio 4, rimuovere il più possibile il tampone di lavaggio A dai campioni prima di aggiungere la polimerasi.
6. Per le cellule in coltura: trasferire i coverslip nella capsula di Petri parafilmata. Aggiungere 40 μL della miscela di amplificazione dal passaggio 6.4.1 alle coperture, disporre piccole piastre di Petri piene d'acqua attorno alle coperture e coprire la grande capsula di Petri. Incubare i campioni per 100 minuti a 37 °C.
7. Per il tessuto affettato: aggiungere 250 μL della miscela di amplificazione dal punto 6.4.2 a ciascun pozzetto e coprire la piastra. Incubare i campioni per 2 ore a 37 °C.
   NOTA: durante questo periodo, preparare ed etichettare le diapositive.

7. Montaggio

1. Come nel passaggio 4, trasferire con cura i coverslip e rimuovere la miscela di amplificazione dal tessuto affettato.
2. Lavare i campioni in 500 μL di tampone di lavaggio B 2 volte per 10 minuti con una leggera agitazione su uno shaker orbitale.
3. Lavare i campioni in 500 μL di tampone di lavaggio B all'1% per 1 minuto con agitazione delicata su uno shaker orbitale.
4. Per le cellule coltivate:
   1. Caduta di 3 μL di supporto di montaggio su una slitta
   2. Toccare il tampone di lavaggio in eccesso dal coperchio e quindi posizionare il coperchio (con le celle rivolte verso il basso) nel supporto di montaggio. Sigillare i lati con una piccola quantità di smalto trasparente per sigillare il coperchio in posizione.
5. Per il tessuto affettato:
   1. Trasferire con cura una fetta di tessuto sul vetrino preparato e disporla, in modo che la fetta sia piatta. Caduta tra 5-10 μL di supporto di montaggio (la quantità dipenderà dalle dimensioni della fetta) sulla fetta di tessuto
   2. Posizionare con cura una copertura di vetro sulla fetta di tessuto e sigillare con una piccola quantità di smalto trasparente lungo il bordo per sigillare la copertina in posizione.
6. Attendere almeno 15 minuti prima di analizzare al microscopio o conservare a -20 °C.

8. Ottenere immagini digitali con un microscopio confocale

1. Ottimizza le impostazioni di acquisizione (ad esempio, potenza laser, guadagno, offset) su campioni di tutti i trattamenti. Assicurarsi che l'ottimizzazione includa la riduzione del rumore di fondo e il miglioramento del segnale senza sovrasaturare l'intensità dei segnali fluorescenti. Una volta determinate le impostazioni, applicare le stesse impostazioni di acquisizione a tutte le immagini ottenute.
   NOTA: i seguenti dettagli di acquisizione possono essere utilizzati con un microscopio confocale Nikon A1 e il software Nikon NIS AR Elements.
2. Impostare la diapositiva con il campione sul palco e trovare il piano focale per il campione utilizzando DAPI attraverso l'oculare.
3. Spegnere la porta dell'occhio facendo clic su Porta occhio e scegliere un pulsante di configurazione ottica per regolare le impostazioni.
4. Regola il guadagno, l'offset e la potenza laser per ciascun canale fluorescente per ridurre il rumore di fondo e migliorare il segnale fluorescente. Assicurarsi che il segnale fluorescente non diventi troppo saturo come indicato nei passaggi 8.5-8.6.
5. Monitorare la sovrasaturazione utilizzando uno pseudocolore per il segnale fluorescente. Nella parte inferiore dell'immagine live, fai clic con il pulsante destro del mouse sulla scheda etichettata con il canale fluorescente attualmente in uso.
6. Quindi, scegli Colorazione canale e scegli uno pseudocolore come Rainbow Dark per visualizzare l'intensità della fluorescenza in uno pseudocolore simile a una mappa di calore. In Rainbow Dark, i colori più freddi indicano un'intensità meno fluorescente e i colori più caldi indicano un'intensità più fluorescente.
7. Una volta ottimizzati tutti i canali fluorescenti, fare clic con il pulsante destro del mouse sul pulsante di configurazione ottica precedentemente scelto e scegliere Assegna impostazione corrente fotocamera per questo pulsante.
8. Verificare che le impostazioni scelte siano sufficienti per un campione casuale di ciascun gruppo di trattamento. Se le impostazioni scelte sovrasaturano uno di questi campioni, ripetere il passaggio 8.4 per eliminare la sovrasaturazione.
9. Per i neuroni in coltura, seguire i passaggi 8.10-8.16.
10. Usando la porta dell'occhio, cerca un neurone con dendriti che hanno una sovrapposizione minima con altri dendriti.
11. Spegnere la porta dell'occhio e utilizzare il canale DAPI per visualizzare il corpo cellulare del neurone scelto. Fare doppio clic sul centro del soma per centrare il neurone al centro del campo visivo.
12. Utilizzando il canale MAP2, trova il miglior piano di messa a fuoco per il segnale MAP2 con la scansione dal vivo.
13. Nella scheda Acquisizione ND , fare clic su Salva su file e scegliere un file in cui salvare l'immagine in Sfoglia. Quindi, inserisci il nome del file.
14. Nella scheda Z selezionare l'opzione Modalità simmetrica definita da Intervallo . Impostare lo stato attivo sul piano MAP2 migliore e fare clic sul pulsante Relativo per impostare questo piano focale come centro dello z-stack.
15. Impostare l'intervallo su 5 μm con passi di 1 μm e assicurarsi di selezionare Chiudi otturatore attivo durante il movimento Z. Nella scheda Lunghezza d'onda selezionare il nome del pulsante ottico con le impostazioni di acquisizione configurate in precedenza in Conf ottico. Quindi, fai clic su Esegui ora.
16. Ripetere i passaggi 8.1.10-8.1.15 per circa 10 neuroni per coverslip/trattamento.
17. Per il tessuto affettato, seguire i passaggi 8.18-8.22.
18. Usando la porta dell'occhio, cerca la regione di interesse. Ad esempio, individuare CA1 dell'ippocampo.
19. Spegnere la porta oculare e utilizzare il canale MAP2 per trovare il miglior piano di messa a fuoco per il segnale MAP2 con la scansione dal vivo.
20. Nel menu Acquisisci , scegliere Scansione immagine di grandi dimensioni. Quindi, selezionare il nome del pulsante ottico con le impostazioni di acquisizione configurate in precedenza nel pannello Acquisizione dal pannello che si apre. Inoltre, assicurati di selezionare l'obiettivo corretto in questo pannello.
21. Sotto il pannello Area e l'oculare, usate i tasti freccia per impostare i confini della regione di interesse. Quindi, fai clic su Salva immagine di grandi dimensioni su file e crea un nome file del percorso di salvataggio per l'immagine.
22. Nel pannello Configurazione, assicurarsi che Acquisizione multicanale sia selezionata, quindi scegliere il nome del pulsante ottico con le impostazioni di acquisizione configurate in precedenza in Conf ottico.
    NOTA: è possibile uno z-stack per un'immagine di grandi dimensioni, ma aumenterà il tempo di scansione.

9. Analisi

1. Analogamente alle impostazioni di acquisizione, utilizzare i campioni di tutti i trattamenti per ottimizzare le impostazioni di soglia. Assicurarsi che l'ottimizzazione della soglia si concentri sulla riduzione del rumore di fondo e sul miglioramento del segnale senza sovrasaturare l'intensità dei segnali fluorescenti. Una volta determinate queste impostazioni, applicare le stesse impostazioni di soglia a tutte le immagini utilizzate per l'analisi come descritto nei passaggi 9.2-9.3.
2. In ImageJ, l'opzione di soglia si trova sotto il menu Immagine > Regola > soglia. Scegli l'opzione Sfondo scuro se l'immagine ha uno sfondo scuro.
3. Quindi, regola i limiti superiore e inferiore della soglia per le impostazioni di soglia ottimizzate precedentemente determinate, quindi fai clic su Applica.
4. Per le cellule coltivate, utilizzare il canale MAP2 e uno strumento di regione di interesse a mano libera (ROI) per disegnare un ROI per ciascun neurone, inclusi dendriti e soma. Per il tessuto affettato, disegna un ROI a mano libera all'interno dell'immagine della fetta che incapsula l'area di interesse (ad esempio, strato radiato del CA1 all'interno dell'ippocampo).
5. Ottenere l'area del ROI. In ImageJ, misurare l'area nel menu Analizza > Misura.
6. Rileva il numero di puncta all'interno di ciascun ROI utilizzando uno strumento di rilevamento automatico come Analisi delle particelle in ImageJ seguendo i passaggi 9.7-9.9.
7. Trova l'opzione Analisi particelle nel menu Analizza > analizza particelle. Innanzitutto, definisci il diametro della dimensione del punto, in genere 0,1-3 μm2.
8. Quindi, scegli l'opzione Maschere sovrapposte dal menu a discesa Mostra e seleziona l'opzione Visualizza risultati. Quindi, fare clic su OK.
9. Se i puncta non vengono rilevati con l'intervallo di diametro scelto, regolare l'intervallo fino a quando tutti i puncta non vengono rilevati con questa analisi. Assicurati di utilizzare le stesse impostazioni di analisi delle particelle per tutte le immagini.
10. Dividere il numero di puncta per l'area di una singola regione di interesse seguendo i passaggi 9.11-9.13.
11. Copia e incolla i risultati per ogni immagine dal popup Risultati da ImageJ in un foglio di calcolo.
12. Innanzitutto, identificare da quale file e campione sono stati ottenuti i dati. Quindi, dividi l'area del ROI per il numero di puncta.
13. Quindi, cancella i dati dal popup Risultati e ripeti i passaggi 9.2-9.12.
14. Normalizzare i risultati per controllare i campioni: media dei risultati (numero di aree puncta/ROI) per i campioni di controllo. Quindi, dividere i risultati ottenuti di tutti i campioni per la media del controllo per ottenere i risultati normalizzati. La nuova media dei campioni di controllo dovrebbe essere pari a 1.

I dati modificati da Heaney et al.6 sono presentati per dimostrare un esperimento in cui è previsto un aumento della formazione di sinapsi (vedere6 per ulteriori informazioni e una discussione più approfondita del meccanismo). In precedenza, è stato dimostrato che gli antidepressivi rapidi richiedono l'attivazione del recettore metabotropico inibitorio, GABAB (sottotipo di acido gamma-aminobutirrico B), per essere efficace13. Inoltre, i dati precedenti hanno indicato che gli antidepressivi rapidi aumentano i marcatori postsinaptici14; pertanto, DetectSyn è stato utilizzato per testare l'ipotesi che gli antidepressivi rapidi aumentino il numero di sinapsi per essere efficaci.

Nei neuroni in coltura, vengono testate quattro condizioni. In primo luogo, nel pannello superiore della Figura 2A, i neuroni in coltura sono stati trattati con il veicolo nelle stesse condizioni del controllo sperimentale. Tuttavia, l'anticorpo primario PSD95 viene omesso per fornire un controllo tecnico per il test DetectSyn (vedere la Figura 1 per il modo in cui ciascun componente contribuisce al segnale). Successivamente, nel pannello di controllo, i neuroni vengono nuovamente trattati con il veicolo ma ricevono sia PSD95 che Synapsin1 primari. Successivamente, i neuroni coltivati vengono trattati solo con l'antidepressivo rapido Ro-25-6981 (Ro) o Ro più l'agonista GABAB, baclofen (Bac). Come precedentemente dimostrato13, sia l'antidepressivo rapido Ro-25-6981 che il baclofene agonista GABAB sono necessari per l'efficacia in vitro di Ro-25-6981. Pertanto, un aumento della formazione di sinapsi è dimostrato da un aumento della puncta bianca (Figura 2A). Senza baclofene, non si osserva alcun aumento della formazione di sinapsi in vitro .

In vivo, i livelli basali di GABA sono sufficienti affinché l'antidepressivo rapido funzioni13, quindi solo l'antidepressivo rapido Ro-25-6981 viene somministrato tramite iniezione intraperitoneale ai topi (Figura 2B). Il pannello di sinistra della Fig. 2B rappresenta un altro controllo tecnico per il test DetectSyn. Il tessuto ippocampale di un topo trattato con soluzione salina è stato sondato con entrambi i primari per PSD95 e Synapsin1, ma uno dei secondari è stato omesso. Un aumento della formazione di sinapsi dovuto al trattamento con l'antidepressivo rapido Ro-25-6981 rispetto ai topi trattati con soluzione salina è dimostrato nei pannelli centrale e destro della Figura 2B.

Vengono mostrate immagini rappresentative per controlli tecnici in vitro ed ex vivo. Nella Figura 2A, una delle primarie per le coppie sinaptiche è omessa (cioè PSD95) e nella Figura 2B viene omessa una delle secondarie. Mentre alcuni puncta appaiono nelle immagini di controllo tecnico, generalmente non hanno le stesse dimensioni, come dimostrato dal puntino bianco nel pannello superiore della Figura 2A rispetto al grande puncta negli altri pannelli. Inoltre, questi puncta non si trovano nella stessa posizione del puncta quantificato, come dimostrato da alcuni puncta che appaiono all'interno del soma del controllo tecnico nella Figura 2B. Tipicamente, i puncta non specifici si verificano all'interno dei nuclei, forse a causa della presenza di DNA.

Per analizzare i risultati rappresentativi nella Figura 2A, i dendriti (visualizzati dalla colorazione MAP2 e rappresentati qui in un contorno grigio) sono stati tracciati utilizzando uno strumento di disegno a mano libera per creare regioni di interesse (ROI). In primo luogo, l'area dei ROI MAP2 è stata ottenuta utilizzando la funzione Elementi NIS, Dati ROI nella scheda Risultati di misurazione automatizzati . Successivamente, i puncta sono stati rilevati utilizzando la funzione Thresholding in NIS Elements. Questa funzione crea una maschera binaria di oggetti che rientrano in una soglia di intensità definita. Quindi, il numero di oggetti binari all'interno dei ROI MAP2 è stato rilevato utilizzando la funzione Elementi NIS, Binario nel ROI, nella scheda Risultati misurazione automatizzati . I dati presentati nel grafico a destra della Figura 2A sono i valori normalizzati del puncta divisi per l'area del ROI.

Per analizzare i risultati rappresentativi nella Figura 2B, lo strato radiato del CA1 è stato tracciato utilizzando uno strumento di disegno a mano libera per creare un ROI. In primo luogo, l'area del ROI è stata ottenuta utilizzando la funzione di dati ROI, come descritto nel paragrafo precedente. Successivamente, i puncta sono stati rilevati utilizzando la funzione Spot Detection - Bright Spots , situata nel menu Binario . Successivamente, i valori di diametro e contrasto sono stati scelti in base all'ispezione visiva di più fette di tutti i trattamenti. Una volta decisi questi valori, sono stati applicati in modo uniforme su tutte le immagini analizzate. La funzione Spot Detection crea maschere binarie di oggetti all'interno del diametro definito e dei parametri di contrasto impostati. Quindi, il numero di oggetti binari all'interno dei ROI MAP2 è stato rilevato utilizzando la funzione Elementi NIS, Binario nel ROI, nella scheda Risultati misurazione automatizzati . I dati presentati nel grafico a destra della Figura 2B sono i valori normalizzati del puncta divisi per l'area del ROI.

Figura 2: Rilevamento delle sinapsi mediante il test DetectSyn. I puncta bianchi rappresentano le sinapsi rilevate con il test di legatura di prossimità DetectSyn PSD95-Synapsin1 (punte di freccia gialle) in (A) neuroni primari ippocampali in coltura in vitro e (B) esc vivo CA1 strato radiato. In (A), il contorno grigio rappresenta la colorazione MAP2. In (A), il pannello superiore etichettato come controllo PLA rappresenta campioni trattati con il solo veicolo, come il controllo. Tuttavia, la PSD95 primaria non è stata inclusa nella reazione. Negli ultimi due pannelli, i neuroni sono stati trattati con l'antidepressivo rapido Ro-25-6981 (Ro, 10 μM) o Ro più il baclofene agonista GABAB (Bac, 50 μM) per 90 min. L'aumento del numero di puncta (identificate con punte di freccia gialle) indica che in vitro, la formazione di sinapsi aumenta solo quando l'antidepressivo rapido Ro-25-6981 viene somministrato con l'agonista GABAB. In (B), il verde rappresenta i dendriti colorati con MAP2 e il blu rappresenta i nuclei colorati con DAPI. I singoli dendriti, delineati in rettangoli gialli nelle immagini unite, sono isolati sotto immagini rappresentative per dimostrare che i puncta si localizzano in dendriti. Gli animali sono stati trattati con Ro-25-6981 (10 mg/kg) e il tessuto è stato raccolto 45 minuti dopo il trattamento. L'aumento del numero di puncta (identificato da punte di freccia gialle) indica che in vivo, il numero di sinapsi aumenta con la segnalazione gaba basale e l'antidepressivo rapido Ro-25-6981. La quantificazione dei risultati rappresentativi è rappresentata dai grafici a barre e indica il numero medio di punti DetectSyn divisi per l'area MAP2. I risultati sono normalizzati al controllo sperimentale. Le immagini sono state ottenute utilizzando un microscopio confocale Nikon A1plus. Barre di scala = (A) 10 μm; (B, superiore) 50 μm; (B, in basso) 5 μm. Le barre rappresentano l'errore standard medio +/- della media. Risultati analizzati da ANOVA unidirezionale: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001 mediante analisi post-hoc. La figura è stata modificata da Heaney et al.6. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non segnalano alcun conflitto di interessi.