Il protocollo descrive un metodo semplice di resezione di un fegato di topo intatto per studi metabolici attraverso la perfusione della vena porta.
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Articolo metodologico
Ex Vivo Perfusione epatica attraverso la vena porta nel topo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le malattie metaboliche come il diabete, il pre-diabete, la steatosi epatica non alcolica (NAFLD) e la steatoepatite non alcolica (NASH) stanno diventando sempre più comuni. Le perfusioni epatiche ex vivo consentono un'analisi completa del metabolismo epatico utilizzando la risonanza magnetica nucleare (NMR), in condizioni nutrizionali che possono essere rigorosamente controllate. Poiché le simulazioni in silico rimangono un mezzo principalmente teorico per valutare le azioni ormonali e gli effetti dell'intervento farmaceutico, il fegato perfuso rimane uno dei banchi di prova più preziosi per comprendere il metabolismo epatico. Poiché questi studi guidano le intuizioni di base sulla fisiologia epatica, i risultati devono essere accurati e riproducibili. Il più grande fattore nella riproducibilità della perfusione epatica ex vivo è la qualità della chirurgia. Pertanto, abbiamo introdotto un metodo organizzato e semplificato per eseguire perfusioni epatiche di topo ex vivo nel contesto di esperimenti NMR in situ . Descriviamo anche un'applicazione unica e discutiamo i problemi comuni riscontrati in questi studi. Lo scopo generale è quello di fornire una guida semplice a una tecnica che abbiamo perfezionato nel corso di diversi anni che riteniamo il golden standard per ottenere risultati riproducibili in resezioni epatiche e perfusioni nel contesto di esperimenti NMR in situ . La distanza dal centro del campo per il magnete e l'inaccessibilità del tessuto all'intervento durante l'esperimento NMR rende i nostri metodi nuovi.
Introduzione
Le perfusioni ex vivo sono cruciali nello studio del metabolismo epatico e la perfusione attraverso la vena porta è lo standard per questi studi. Per studiare il metabolismo epatico in isolamento, il fegato deve essere resecato dal corpo per evitare complicazioni derivanti dal metabolismo in altri organi (cioè il metabolismo di tutto il corpo) e per esercitare il controllo sulla disponibilità ormonale (insulina, glucagone, ecc.). Questo approccio può essere essenziale per comprendere gli effetti di malattie come il diabete, la NAFLD e la NASH sul metabolismo epatico e sui meccanismi di azione dei farmaci. Questo articolo serve come guida per la resezione epat....
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Protocollo
Gli esperimenti che hanno coinvolto topi sono stati gestiti in conformità con il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Florida (numero di protocollo n. 201909320). Il ceppo di topo utilizzato era C57BL/6J; tutti i topi erano maschi. Questo metodo è generalmente applicabile anche per gli studi che utilizzano altri ceppi di topo standard. Questo intervento chirurgico viene eseguito in modo ottimale da due individui che lavorano insieme.
1. Configurazione iniziale
- Perfusare fegati con perfusato contenente elettroliti Krebs-Henseleit6 (25 mM NaHCO3<....
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Risultati
La funzionalità epatica è valutata principalmente dal consumo di ossigeno e dalla portata. Una portata di 4-8 ml/min e un consumo di ossigeno di 1 μmol/min.g sono tipici. Queste misure varieranno a seconda delle specifiche condizioni sperimentali e delle differenze biologiche.
La quantità esatta di isoflurano utilizzata dipenderà dal tipo di sistema di anestesia utilizzato, nonché dall'ambiente e dall'età/peso del mouse. Durante l'intervento chirurgico, l'isoflurano e il gas di mandata non cam.......
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Discussione
Questa procedura chirurgica è impegnativa e richiede una pratica approfondita per ottenere risultati riproducibili. L'isoflurano e il gas di trasporto devono essere regolati secondo necessità per mantenere la vitalità dell'animale attraverso la maggior parte della procedura chirurgica possibile. L'ambiente, l'ora del giorno, l'età, il peso e molti altri fattori influenzeranno l'anestesia. Il peso, la dieta, il ceppo dei topi e l'età potrebbero influenzare la chirurgia poiché l'accumulo di grasso può interferire con la vi.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio; nella raccolta, analisi o interpretazione dei dati; nella stesura del manoscritto; o nella decisione di pubblicare i risultati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del National Institutes of Health (R01-DK105346, P41-GM122698, 5U2C-DK119889). Una parte di questo lavoro è stata eseguita nel McKnight Brain Institute presso la National High Magnetic Field Laboratory's Advanced Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy (AMRIS) Facility, che è supportata dal National Science Foundation Cooperative Agreement No. DMR-1644779 e lo Stato della Florida.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringa monouso sterile monouso Luer-Lock da 1 mL | N/A | N/A | Marca non specifica |
| Colonna di vetro rivestita d'acqua da 100 cm | N/A | N/A | |
| Sutura di seta 2-0 | su misura Braintree Scientific | N/A | |
| Catherter calibro 22 da 1 pollice. Senza sicurezza | Terumo | SRFF2225 | |
| 23 G 0,75 in. Aghi ipodermici Exel | International | 26407 | |
| 27 G 1,5 pollici. Aghi ipodermici | Exel International | 26426 | |
| 4x4 in. Piattaforma chirurgica | N/A | N/A | |
| Salvietta imbevuta di alcol al 70% | su misura N/A | N/A | circolante di marca non specifica |
| MS Lauda | N/A | Modello non più prodotto | |
| Applicatore con punta in cotone | N/A | N/A Forbici | |
| ; Diritto; Acuto-tagliente; Lunghezza lama 30 mm; 4 3/4 " | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5/45 Pinze | Fine Scientific Tools | 11251-35 | |
| Dumont #7 - Pinza Fine Strumenti | Fine Scientific | 11274-20 | |
| Emostatici | Fine Scientific Tools | 13015-14 | |
| Eparina Sodio Iniettabile 1000 unità/mL | RX Generici | 71288-0402-02 | |
| Isoflurano | Patterson Veterinary | 14043-0704-06 | |
| Lidocaina HCl 2% | VEDCO Inc. | 50989-0417-12 | |
| Ossigenatore a membrana a strato sottile | Radnoti | N/A | |
| Metzenbaum Forbici; Curvo; Spuntato; Lunghezza lama 27 mm; Sistema | Roboz | RS-6013 | |
| Hanstech Instruments Ltd. | N/A | ||
| Soluzione salina allo 0,9% | N/A | N/A | La soluzione salina è prodotta in laboratorio |
| Scala | N/A | N/A | Marca non specifica |
| Sistemi di pompe analogici a console a velocità variabile | Cole Palmer | N/A | I modelli sono personalizzati per applicazione |
| Pesare le barche | N/A | N/A | Marca non specifica |
Riferimenti
- Ragavan, M., McLeod, M. A., Giacalone, A. G., Merritt, M. E. Hyperpolarized Dihydroxyacetone Is a Sensitive Probe of Hepatic Gluconeogenic State. Metabolites. 11 (7), 441(2021).
- Lumata, L. Hyperpolarized (13)C....
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Ristampe e permessi
