Questo protocollo descrive un test di immunoassorbimento enzimatico a sandwich per rilevare gli sporozoiti delle ghiandole salivari nelle zanzare. Utilizzando anticorpi monoclonali facilmente disponibili, il metodo consente di rilevare in modo economico e ad alto rendimento le zanzare portatrici di Plasmodium falciparum o Plasmodium vivax. Il metodo è adatto per la ricerca sulla trasmissione della malaria, comprese le indagini sui vettori.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Rilevamento di Plasmodium Sporozoites nelle zanzare Anopheles utilizzando un test di immunoassorbimento enzimatico
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli sporozoiti del Plasmodium sono lo stadio infettivo dei parassiti della malaria che infettano l'uomo. Gli sporozoiti che risiedono nelle ghiandole salivari delle femmine di zanzara Anopheles vengono trasmessi all'uomo attraverso le punture di zanzara durante l'alimentazione del sangue. La presenza di sporozoiti nelle ghiandole salivari delle zanzare definisce quindi l'infettività delle zanzare. Per determinare se una zanzara Anopheles è portatrice di Plasmodium sporozoites, il metodo ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) è stato lo strumento standard per rilevare la proteina Plasmodium circumsporozoite (CSP), la principale proteina di superficie degli sporozoiti. In questo metodo, la testa insieme al torace di ciascuna zanzara viene separata dall'addome, omogeneizzata e sottoposta a un ELISA a sandwich per rilevare la presenza di CSP specifico per Plasmodium falciparum e ciascuno dei due sottotipi, VK210 e VK247, di Plasmodium vivax. Questo metodo è stato utilizzato per studiare la trasmissione della malaria, comprese le dinamiche stagionali dell'infezione da zanzare e le specie dei principali vettori di malaria nei siti di studio.
Introduzione
Gli sporozoiti Plasmodium sono lo stadio infettivo dei parassiti della malaria nelle zanzare. Gli sporozoiti vengono consegnati all'uomo tramite punture di zanzara. Nella zanzara, gli sporozoiti si formano prima all'interno delle oocisti sulla parete dell'intestino medio. Una volta pronti, vengono rilasciati nell'emocele e viaggiano verso le ghiandole salivari delle zanzare. Lì, maturano e diventano pronti per la trasmissione all'uomo durante l'alimentazione del sangue. Nell'uomo, gli sporozoiti si depositano nel derma. Quindi, entrano nel vaso sanguigno e viaggiano lungo la circolazione sanguigna per raggiungere il fegato e stabilire l'infezione negli epatoc....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Preparazione dei reagenti
NOTA: Fare riferimento alla Tabella dei materiali per un elenco di apparecchiature, reagenti e altri materiali di consumo utilizzati in questo protocollo e alla Tabella 1 per un elenco delle soluzioni e della loro composizione.
- Cattura e anticorpi monoclonali coniugati con perossidasi
- Per ricostituire l'anticorpo monoclonale, risospendere l'anticorpo monoclonale liofilizzato in una miscela 1:1 di acqua distillata:glicerolo a 0,5 mg/mL. Preparare le aliquote secondo necessità per evitare ripetuti congelamenti-scongelamenti e conservarle a -20 °C.....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
I risultati ELISA rappresentativi sono mostrati nella Figura 2. In questo esperimento, l'ELISA di P. falciparum ha rilevato un'infezione da sporozoiti nel pozzetto A7. Il pozzo positivo potrebbe essere rilevato visivamente dal suo debole colore verde (Figura 2A). Il valore di assorbanza di questo pozzetto era superiore alla soglia di cut-off (il doppio del valore medio dei quattro pozzetti di controllo negativo) (Figura 2B).......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il CSP-ELISA fornisce un metodo altamente specifico ed economico per rilevare il CSP del Plasmodium. Permette la discriminazione tra gli sporozoiti di P. falciparum e P. vivax, nonché tra i due sottotipi, VK210 e VK247, di P vivax11,13,14,15. Alcuni punti critici dovrebbero essere considerati per ottenere risultati affidabili e riproducibili. Tutte le soluzio.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il signor Kirakorn Kiatibutr, MVRU, per la formazione e l'orientamento. Ringraziamo anche la Sig.ra Pinyapat Kongngen, MVRU, per la sua assistenza tecnica nella preparazione della Figura 2. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione dell'Istituto Nazionale per le Allergie e le Malattie Infettive e dell'Istituto Nazionale della Sanità (U19 AI089672).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Lettore di piastre ELISA | BioTek Instrument, Inc. | Synergy H1 | viene misurata utilizzando la modalità di rilevamento dell'assorbanza UV-VIS |
| Pestello per smerigliatrice | Axygen | PES-15-B-SI | Per l'omogeneizzazione della testa della zanzara/torace |
| Reagenti | |||
| Substrato ABTS a 2 componenti | KPL | 50-62-00 | Per il rilevamento guidato dalla perossidasi |
| Tampone di blocco (BB) | Nota: soluzione | ||
| Cattura e anticorpi monoclonali coniugati con perossidasi (mAb) | Nota: gli anticorpi monoclonali possono essere ottenuti in forma liofilizzata come parte dei kit di reagenti ELISA per sporozoite (MRA-890 per P. falciparum e MRA-1028K per P. vivax) di BEI Resources (https://www.beiresources.org.) | ||
| Caseina | Sigma aldrich | 9000-71-9 | Per la preparazione del tampone di blocco |
| Tampone di macinazione (GB) | Nota: soluzione | ||
| Igepal CA-630 | Sigma aldrich | 9002-93-1 | Per la preparazione del tampone di macinazione |
| KCl | Sigma aldrich | 7447-40-7 | Per la preparazione salina del tampone fosfato |
| KH2PO4 | Sigma aldrich | 7778-77-0 | Per la preparazione salina del tampone fosfato |
| Na2HPO4 | Sigma aldrich | 7558-79-4 | Per la preparazione salina del tampone fosfato |
| NaCl | Sigma aldrich | 7647-14-5 | Per la preparazione della soluzione salina del tampone fosfato |
| NaOH | Sigma aldrich | 1310-73-2 | Per la preparazione del tampone bloccante |
| PBS-Tween | |||
| Pf capture mAb | CDC | Pf-CAP | Per la cattura di Pf proteina circumsporozoite |
| Pf perossidasi mAb | CDC | Pf-HRP | Per la rilevazione di Pf proteina circumsporozoite |
| Pf controllo positivo | CDC | Pf-PC | Pf controllo positivo |
| Phenol red | Sigma aldrich | 143-74-8 | Per il blocco della preparazione del tampone |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Nota: soluzione | ||
| Controlli | Nota: soluzione | ||
| Pv210 cattura mAb | CDC | Pv210-CAP | Per la cattura di Pv210 proteina circumsporozoite |
| Pv210 perossidasi mAb | CDC | Pv210-HRP | Per la rilevazione di Pv210 proteina circonsporozoite |
| Pv210 controllo positivo | CDC | Pv210-PC | Pv210 controllo positivo |
| Pv247 cattura mAb | CDC | Pv247-CAP | Per catturare Pv247 proteina circumsporozoite |
| Pv247 perossidasi mAb | CDC | Pv247-HRP | Per rilevare Pv247 proteina circonsporozoite |
| Pv247 controllo positivo | CDC | Pv247-PC | Pv247 controllo positivo |
| Tween20 | Sigma aldrich | 9005-64-5 | Per la preparazione PBS-Tween |
| Materiali di consumo | |||
| Serbatoi di pipettaggio monouso | Generico | Per reagenti di lavoro | |
| Piastre ELISA: 96 pozzetti a fondo tondo trasparente PVS | Corning Life Science | 2797 | Per ELISA |
| Guanti: guanti monouso e guanti da congelatore | Generico | Per protezione personale | |
| Camice da laboratorio | Generico | per la protezione personale | |
| Pipetta multicanale P30-300 | Generica | Per il trasferimento di soluzioni | |
| Set di pipette, P2, P20, P200 e P1000 | Generica | Per il trasferimento di soluzioni | |
| Puntali per pipette 10 &; L, 200 & micro; L, e 1000 µ L | Generico | Per trasferimento di soluzioni | |
| Pipette sierologiche 5 mL, 10 mL | Generico | Per trasferimento | |
| di soluzione Pipette di trasferimento Generico | Per il trasferimento di soluzioni |
Riferimenti
- Bray, R. S., Garnham, P. C. The life-cycle of primate malaria parasites. British Medical Bulletin. 38 (2), 117-122 (1982).
- Held, J. R. Primate malaria. Annals of the New York Academy of Sciences. 162 (1), 587-593 (1969).
- World Health Organization.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
