Articolo metodologico

Visualizzazione della prossimità indotta da caspasi infiammatorie nei macrofagi derivati da monociti umani

DOI:

10.3791/63162

⸱

6 aprile 2022

 , 
1Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology, Department of Molecular and Cellular Biology, Texas Children’s Hospital William T. Shearer Center for Human Immunobiology, Baylor College of Medicine

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive il flusso di lavoro per ottenere macrofagi derivati da monociti (MDM) da campioni di sangue umano, un metodo semplice per introdurre in modo efficiente i reporter della complementazione di fluorescenza bimolecolare della caspasi infiammatoria (BiFC) nell'MDM umano senza compromettere la vitalità e il comportamento cellulare e un approccio basato sull'imaging per misurare l'attivazione della caspasi infiammatoria nelle cellule viventi.

Abstract

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Le caspasi infiammatorie includono caspasi-1, -4, -5, -11 e -12 e appartengono al sottogruppo delle caspasi iniziatrici. La caspasi-1 è necessaria per garantire una corretta regolazione della segnalazione infiammatoria ed è attivata dalla dimerizzazione indotta dalla prossimità in seguito al reclutamento agli inflammasomi. La caspasi-1 è abbondante nel lignaggio delle cellule monocitiche e induce la maturazione delle citochine pro-infiammatorie interleuchina (IL)-1β e IL-18 alle molecole secrete attive. Le altre caspasi infiammatorie, caspasi-4 e -5 (e la loro caspasi omologa murina-11) promuovono il rilascio di IL-1β inducendo la piroptosi. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) è uno strumento utilizzato per misurare la prossimità indotta da caspasi infiammatoria come lettura dell'attivazione della caspasi. Il prodominio caspasi-1, -4 o -5, che contiene la regione che si lega all'inflammasoma, è fuso a frammenti non fluorescenti della proteina fluorescente gialla Venere (Venus-N [VN] o Venus-C [VC]) che si associano per riformare il complesso fluorescente di Venere quando le caspasi subiscono una vicinanza indotta. Questo protocollo descrive come introdurre questi reporter nei macrofagi primari derivati dai monociti umani (MDM) usando la nucleofezione, trattare le cellule per indurre l'attivazione della caspasi infiammatoria e misurare l'attivazione della caspasi usando la fluorescenza e la microscopia confocale. Il vantaggio di questo approccio è che può essere utilizzato per identificare i componenti, i requisiti e la localizzazione del complesso di attivazione della caspasi infiammatoria nelle cellule viventi. Tuttavia, è necessario considerare controlli accurati per evitare di compromettere la vitalità e il comportamento delle cellule. Questa tecnica è un potente strumento per l'analisi delle interazioni dinamiche della caspasi a livello di inflammasoma e per l'interrogazione delle cascate di segnalazione infiammatoria in MDM viventi e monociti derivati da campioni di sangue umano.

Introduzione

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Le caspasi sono una famiglia di proteasi aspartato di cisteina che possono essere raggruppate in caspasi iniziatrici e caspasi boia. Le caspasi del boia comprendono caspasi-3, -6 e -7. Si trovano naturalmente nelle cellule come dimeri e vengono scissi dalle caspasi iniziatrici per eseguire l'apoptosi1. Le caspasi iniziatrici includono caspasi umane-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 e -12. Si trovano come zimogeni inattivi (pro-caspasi) che vengono attivati dalla dimerizzazione indotta dalla prossimità e stabilizzati dalla scissione autoproteolitica 2,3. Le caspasi infiammatorie sono un sottoin....

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Protocollo

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Questo protocollo segue le linee guida del comitato etico di ricerca umana del Baylor College of Medicine per la manipolazione di campioni umani. I campioni di sangue vengono gestiti seguendo le linee guida istituzionali sulla sicurezza per i campioni umani. I campioni di sangue sono ottenuti presso una banca del sangue regionale, dove vengono raccolti con la soluzione di citrato fosfato destrosio (CPD). Tuttavia, il sangue raccolto con altri anticoagulanti come eparina di sodio, eparina di litio o EDTA può essere utilizzato anche per questo protocollo28,29.

1. Isolamento dei ....

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Risultati

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Lo schema mostrato nella Figura 2 fornisce una panoramica di come ottenere, trasfettare e visualizzare l'MDM umano. Dopo l'incubazione dei monociti CD14+ selezionati con GM-CSF per 7 giorni, la morfologia cellulare cambia nel corso del periodo di differenziazione (Figura 3A), passando dalle cellule in sospensione sferica a spinose e completamente attaccate (giorni 3 e 4), e infine a cellule più diffuse quando completamente differenziate (giorno 7). Le cellule c.......

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Discussione

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Questo protocollo descrive il flusso di lavoro per ottenere macrofagi da monociti isolati da campioni di sangue umano e un metodo per introdurre in modo efficiente i reporter BiFC della caspasi infiammatoria nell'MDM umano senza compromettere la vitalità e il comportamento cellulare.

Questo protocollo sfrutta la tecnica BiFC35 per etichettare le caspasi infiammatorie nel dominio di reclutamento della caspasi (CARD) con frammenti non fluorescenti della proteina fluoresce.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Ringraziamo i membri del laboratorio LBH passati e presenti che hanno contribuito allo sviluppo di questa tecnica. Questo laboratorio è supportato da NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH/NIDDK F32DK121479 (BEB), NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH). La Figura 2 è stata disegnata utilizzando il software Biorender.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Coltura tissutale a 48 pozzettiPiastre 2:34Genesee Scientific25-108
Piastre per coltura tissutale da 10 cmVWR25382-166
2 Mercaptoetanolo 1000xThermo Fisher Scientific21985023
Coverglass a 8 pozzetti con coverglass da 1,5 HPColonne AutoMACS
Miltenyi (Biotec)130-021-101Per la separazione automatizzata utilizzando solo AutoMACS Pro Separator
AutoMACS ProMiltenyi (Biotec)130-092-545Per la separazione automatizzata utilizzando solo AutoMACS Pro Separator AutoMACS Pro
Soluzione di lavaggio Miltenyi(Biotec)130-092-987Per la separazione automatizzata utilizzando solo AutoMACS Pro Separator
AutoMACS Soluzione di risciacquoMiltenyi (Biotec)130-091-222Per la separazione automatizzata utilizzando solo AutoMACS Pro Separator
AutoMacs running bufferMiltenyi (Biotec)130-091-221Per la separazione manuale o automatizzata con QuadroMACS o AutoMACS pro Separator
Axio Observer Z1 microscopio invertito motorizzato dotato di un'unità disco rotante CSU-X1A 5000ZeissÈ possibile utilizzare qualsiasi microscopio confocale dotato di un modulo laser dotato di linee laser di lunghezze d'onda di 568 nm (RFP) e 488 o 512 nm (GFP o YFP)
AxioObserver A1, Research Grade Inverted MicroscopeZeissQualsiasi microscopio a epifluorescenza con filtri a fluorescenza in grado di eccitare lunghezze d'onda di 568 nm (RFP) e 488 o 512 nm (GFP o YFP) può essere utilizzato
CD14+ MICROBEADSMiltenyi (Biotec)130-050-201Per la separazione manuale o automatizzata con QuadroMACS o AutoMACS pro Separator
DPBS senza cloruro di calcio e cloruro di magnesioSigmaD8537-6x500ML
DsRed mito plasmideClontech632421Plasmidi simili che possono essere utilizzati come reporter fluorescenti si trovano su Addgene
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific10437028
Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mLSigmaGE17-1440-02
GlutaMAX Integratore (100x)Thermo Fisher Scientific35050079
GM-CSFThermo Fisher ScientificPHC2011
Hemin BioXtra, da Porcine, ≥ 96,0% (HPLC)Sigma51280-1G
HEPESThermo Fisher Scientific 15630106
Caspasi infiammatorie PlasmidiDisponibile su richiesta presso il laboratorio LBH
LPS-EB UltrapureInvivogenTLRL-3PELPS
LS ColonneMiltenyi (Biotec)130-042-401Per la separazione manuale utilizzando solo il separatore QuadroMACS
Rack per provette MACS da 15 mLMiltenyi (Biotec)130-091-052Per la separazione manuale con QuadroMACS Solo separatore
MACS MACS MultiStandMiltenyi (Biotec)130-042-303Per la separazione manuale con QuadroMACS Solo separatore
mCherry PlasmidiYungpeng Wang LabPlasmidi simili che possono essere utilizzati come reporter fluorescenti possono essere trovati su Addgene
Neon Transfection SystemThermo Fisher ScientificMPK5000Include dispositivo di elettroporazione al neon, pipetta e stazione di pipettazione
Sistema di trasfezione al neon 10 &; L KitThermo Fisher ScientificMPK1096Include tampone di risospensione R, tampone di risospensione T, tampone elettrolitico E, 96 x 10 µ L Punte al neon e tubi per elettroporazione al neon
Sale sodico di nigericina, soluzione prontaSigmaSML1779-1ML
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Poli-D-lisina bromidratoSigmaP7280-5mg
Separatore QuadroMACSMiltenyi (Biotec)130-090-976Per la separazione manuale utilizzando Solo separatore QuadroMACS
qVD-OPhFisher (ApexBio)50-101-3172
RPMI 1640 MediumThermo Fisher Scientific11875119
Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenoloThermo Fisher Scientific25200072
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher Scientific15575020
Zeiss Zen 2.6 (blue edition) softwareZeissQualsiasi software utilizzato per utilizzare il microscopio confocale di scelta
BiFC

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Molecular Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
  2. Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2....

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Caspase ActivationCaspase BiFCInflammasome VisualizationNucleofection TechniqueConfocal MicroscopyPyroptosis InductionCytokine MaturationFluorescence Microscopy

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