Visualizzazione della prossimità indotta da caspasi infiammatorie nei macrofagi derivati da monociti umani

Beatriz E. Bolívar; Lisa Bouchier-Hayes

doi:10.3791/63162

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Articolo metodologico

Visualizzazione della prossimità indotta da caspasi infiammatorie nei macrofagi derivati da monociti umani

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DOI:

10.3791/63162

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6 aprile 2022

Beatriz E. Bolívar¹ , Lisa Bouchier-Hayes¹

¹Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology, Department of Molecular and Cellular Biology, Texas Children’s Hospital William T. Shearer Center for Human Immunobiology, Baylor College of Medicine

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive il flusso di lavoro per ottenere macrofagi derivati da monociti (MDM) da campioni di sangue umano, un metodo semplice per introdurre in modo efficiente i reporter della complementazione di fluorescenza bimolecolare della caspasi infiammatoria (BiFC) nell'MDM umano senza compromettere la vitalità e il comportamento cellulare e un approccio basato sull'imaging per misurare l'attivazione della caspasi infiammatoria nelle cellule viventi.

Abstract

Le caspasi infiammatorie includono caspasi-1, -4, -5, -11 e -12 e appartengono al sottogruppo delle caspasi iniziatrici. La caspasi-1 è necessaria per garantire una corretta regolazione della segnalazione infiammatoria ed è attivata dalla dimerizzazione indotta dalla prossimità in seguito al reclutamento agli inflammasomi. La caspasi-1 è abbondante nel lignaggio delle cellule monocitiche e induce la maturazione delle citochine pro-infiammatorie interleuchina (IL)-1β e IL-18 alle molecole secrete attive. Le altre caspasi infiammatorie, caspasi-4 e -5 (e la loro caspasi omologa murina-11) promuovono il rilascio di IL-1β inducendo la piroptosi. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) è uno strumento utilizzato per misurare la prossimità indotta da caspasi infiammatoria come lettura dell'attivazione della caspasi. Il prodominio caspasi-1, -4 o -5, che contiene la regione che si lega all'inflammasoma, è fuso a frammenti non fluorescenti della proteina fluorescente gialla Venere (Venus-N [VN] o Venus-C [VC]) che si associano per riformare il complesso fluorescente di Venere quando le caspasi subiscono una vicinanza indotta. Questo protocollo descrive come introdurre questi reporter nei macrofagi primari derivati dai monociti umani (MDM) usando la nucleofezione, trattare le cellule per indurre l'attivazione della caspasi infiammatoria e misurare l'attivazione della caspasi usando la fluorescenza e la microscopia confocale. Il vantaggio di questo approccio è che può essere utilizzato per identificare i componenti, i requisiti e la localizzazione del complesso di attivazione della caspasi infiammatoria nelle cellule viventi. Tuttavia, è necessario considerare controlli accurati per evitare di compromettere la vitalità e il comportamento delle cellule. Questa tecnica è un potente strumento per l'analisi delle interazioni dinamiche della caspasi a livello di inflammasoma e per l'interrogazione delle cascate di segnalazione infiammatoria in MDM viventi e monociti derivati da campioni di sangue umano.

Introduzione

Le caspasi sono una famiglia di proteasi aspartato di cisteina che possono essere raggruppate in caspasi iniziatrici e caspasi boia. Le caspasi del boia comprendono caspasi-3, -6 e -7. Si trovano naturalmente nelle cellule come dimeri e vengono scissi dalle caspasi iniziatrici per eseguire l'apoptosi¹. Le caspasi iniziatrici includono caspasi umane-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 e -12. Si trovano come zimogeni inattivi (pro-caspasi) che vengono attivati dalla dimerizzazione indotta dalla prossimità e stabilizzati dalla scissione autoproteolitica ^2,3. Le caspasi infiammatorie sono un sottoin....