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Articolo metodologico

Visualizzazione della prossimità indotta da caspasi infiammatorie nei macrofagi derivati da monociti umani

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DOI:

10.3791/63162

⸱

6 aprile 2022

 , 
1Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology, Department of Molecular and Cellular Biology, Texas Children’s Hospital William T. Shearer Center for Human Immunobiology, Baylor College of Medicine

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive il flusso di lavoro per ottenere macrofagi derivati da monociti (MDM) da campioni di sangue umano, un metodo semplice per introdurre in modo efficiente i reporter della complementazione di fluorescenza bimolecolare della caspasi infiammatoria (BiFC) nell'MDM umano senza compromettere la vitalità e il comportamento cellulare e un approccio basato sull'imaging per misurare l'attivazione della caspasi infiammatoria nelle cellule viventi.

Abstract

Le caspasi infiammatorie includono caspasi-1, -4, -5, -11 e -12 e appartengono al sottogruppo delle caspasi iniziatrici. La caspasi-1 è necessaria per garantire una corretta regolazione della segnalazione infiammatoria ed è attivata dalla dimerizzazione indotta dalla prossimità in seguito al reclutamento agli inflammasomi. La caspasi-1 è abbondante nel lignaggio delle cellule monocitiche e induce la maturazione delle citochine pro-infiammatorie interleuchina (IL)-1β e IL-18 alle molecole secrete attive. Le altre caspasi infiammatorie, caspasi-4 e -5 (e la loro caspasi omologa murina-11) promuovono il rilascio di IL-1β inducendo la piroptosi. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) è uno strumento utilizzato per misurare la prossimità indotta da caspasi infiammatoria come lettura dell'attivazione della caspasi. Il prodominio caspasi-1, -4 o -5, che contiene la regione che si lega all'inflammasoma, è fuso a frammenti non fluorescenti della proteina fluorescente gialla Venere (Venus-N [VN] o Venus-C [VC]) che si associano per riformare il complesso fluorescente di Venere quando le caspasi subiscono una vicinanza indotta. Questo protocollo descrive come introdurre questi reporter nei macrofagi primari derivati dai monociti umani (MDM) usando la nucleofezione, trattare le cellule per indurre l'attivazione della caspasi infiammatoria e misurare l'attivazione della caspasi usando la fluorescenza e la microscopia confocale. Il vantaggio di questo approccio è che può essere utilizzato per identificare i componenti, i requisiti e la localizzazione del complesso di attivazione della caspasi infiammatoria nelle cellule viventi. Tuttavia, è necessario considerare controlli accurati per evitare di compromettere la vitalità e il comportamento delle cellule. Questa tecnica è un potente strumento per l'analisi delle interazioni dinamiche della caspasi a livello di inflammasoma e per l'interrogazione delle cascate di segnalazione infiammatoria in MDM viventi e monociti derivati da campioni di sangue umano.

Introduzione

Le caspasi sono una famiglia di proteasi aspartato di cisteina che possono essere raggruppate in caspasi iniziatrici e caspasi boia. Le caspasi del boia comprendono caspasi-3, -6 e -7. Si trovano naturalmente nelle cellule come dimeri e vengono scissi dalle caspasi iniziatrici per eseguire l'apoptosi1. Le caspasi iniziatrici includono caspasi umane-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 e -12. Si trovano come zimogeni inattivi (pro-caspasi) che vengono attivati dalla dimerizzazione indotta dalla prossimità e stabilizzati dalla scissione autoproteolitica 2,3. Le caspasi infiammatorie sono un sottoinsieme delle caspasi iniziatrici2 e comprendono caspasi-1, -4, -5 e -12 negli esseri umani e caspasi-1, -11 e -12 nel topo 4,5. Piuttosto che un ruolo apoptotico, svolgono un ruolo centrale nell'infiammazione. Mediano l'elaborazione proteolitica e la secrezione di pro-interleuchina (IL)-1β e pro-IL-18 6,7, che sono le prime citochine ad essere rilasciate in risposta agli invasori patogeni 8,9. Caspase-1 viene attivato al momento del reclutamento sulla sua piattaforma di attivazione; un grande complesso proteico a peso molecolare chiamato inflammasoma (Figura 1A)10. La dimerizzazione della caspasi-4, -5 e -11 avviene indipendentemente da queste piattaforme attraverso una via infiammatoria non canonica11,12.

Gli inflammasomi canonici sono complessi proteici multimerici citosolici costituiti da una proteina sensore inflammasoma, la proteina adattatrice ASC (proteina simile allo speck associata all'apoptosi contenente una CARD) e la proteina effettrice caspasi-110. Gli inflammasomi canonici più studiati sono la famiglia di recettori NOD-like contenente un dominio pirinico (NLRP), NLRP1 e NLRP3, la famiglia NLR contenente un CARD (NLRC), NLRC4 e l'assente nel melanoma 2 (AIM2). Ognuno di essi contiene un dominio pyrin, una CARD o entrambi i domini. Il dominio CARD media l'interazione tra le caspasi contenenti CARD e i loro attivatori a monte. Pertanto, la molecola di impalcatura ASC, che è composta da un dominio di pirina N-terminale (PYD) e un motivo CARD C-terminale 13,14, è necessaria per il reclutamento di caspasi-1 agli inflammasomi NLRP1 10, NLRP315 e AIM216.

Ogni inflammasoma prende il nome dalla sua unica proteina sensore che riconosce distinti stimoli pro-infiammatori (Figura 1B). Gli attivatori di questo percorso sono chiamati stimoli canonici. Gli inflammasomi fungono da sensori per i componenti microbici e lo stress tissutale e si assemblano per innescare una robusta risposta infiammatoria attraverso l'attivazione delle caspasi infiammatorie17. L'assemblaggio dell'inflammasoma avvia l'attivazione della caspasi-1 per mediare la maturazione e la secrezione dei suoi principali substrati pro-IL-1β e pro-IL-18. Questo processo avviene tramite un meccanismo in due fasi. In primo luogo, uno stimolo primordiale sovraregola l'espressione di alcune proteine inflammasoma e pro-IL-1β attraverso l'attivazione della via NF-κB. In secondo luogo, uno stimolo intracellulare (canonico) induce l'assemblaggio dell'inflammasoma e il reclutamento della procaspasi-1 6,7.

Caspase-4 e caspasi-5 sono gli ortologhi umani della caspasi murina-1111. Sono attivati in modo indipendente dall'inflammasoma dal lipopolisaccaride intracellulare (LPS), una molecola presente nella membrana esterna dei batteri Gram-negativi 18,19,20, e dall'eme extracellulare, un prodotto dell'emolisi dei globuli rossi21. È stato proposto che LPS si leghi direttamente al motivo CARD di queste proteine e induca la loro oligomerizzazione20. L'attivazione della caspasi-4 o della caspasi-5 promuove il rilascio di IL-1β inducendo una forma infiammatoria di morte cellulare chiamata piroptosi attraverso la scissione della proteina gasdermina D (GSDMD)18,19. Inoltre, l'efflusso di ioni potassio derivanti dalla morte piroptotica mediata da caspasi-4 e GSDMD induce l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 e la successiva attivazione della caspasi-122,23. Pertanto, caspasi-4, -5 e -11 sono considerati sensori intracellulari per LPS che sono in grado di indurre l'attivazione della piroptosi e della caspasi-1 in risposta a stimoli specifici11,24.

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Figura 1: Caspasi infiammatorie e test della complementazione di fluorescenza caspasi-bimolecolare (BiFC). (A) Diagramma che mostra il sistema caspasi-BiFC, in cui due prodomini caspasi-1 (C1-pro) legati a ciascun frammento non fluorescente di Venere (Venere-C o Venere-N) vengono reclutati nella piattaforma di attivazione NLRP3, costringendo Venere a ripiegarsi e fluorescere. Questo complesso appare come una macchia verde al microscopio e funge da lettura per la prossimità indotta da caspasi infiammatoria, che è il primo passo nell'attivazione della caspasi iniziatrice. (B) Schema che mostra l'organizzazione del dominio dei componenti inflammasoma e delle caspasi infiammatorie. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Misurare l'attivazione di caspasi iniziatrici specifiche è difficile e non ci sono molti metodi disponibili per farlo con approcci di imaging. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) può essere utilizzato per visualizzare l'attivazione della caspasi infiammatoria direttamente nelle cellule viventi (Figura 1A)25. Questa tecnica è stata recentemente adattata per l'uso in macrofagi derivati da monociti umani (MDM)21. Caspasi BiFC misura il primo passo nell'attivazione della caspasi infiammatoria, la vicinanza indotta per facilitare la dimerizzazione. Viene utilizzata l'espressione di plasmidi che codificano il prodominio caspasi contenente CARD fuso a frammenti non fluorescenti della proteina fluorescente gialla fotostabile Venere (Venus-C [VC]) e Venere-N [VN]). Quando i due prodomini della caspasi vengono reclutati sulla loro piattaforma di attivazione o subiscono una vicinanza indotta, le due metà di Venere vengono portate in prossimità e costrette a ripiegarsi e fluorescere (vedi Figura 1A,B). Ciò fornisce una lettura in tempo reale dell'attivazione di caspasi infiammatorie specifiche.

L'MDM umano esprime abbondantemente geni inflammasoma e recettori di riconoscimento dei modelli che identificano segnali di pericolo e prodotti patogeni. Ciò fornisce un tipo di cellula ideale per l'interrogazione delle vie infiammatorie della caspasi. Inoltre, possono essere derivati dal sangue periferico e persino da campioni di pazienti per valutare l'attivazione della caspasi infiammatoria in uno specifico stato patologico. Questo protocollo descrive come introdurre i reporter della caspasi BiFC nell'MDM usando la nucleofezione, un metodo di trasfezione basato sull'elettroporazione, come trattare le cellule per indurre l'attivazione della caspasi infiammatoria e come visualizzare i complessi di caspasi attivi utilizzando approcci microscopici. Inoltre, questa metodologia può essere adattata per determinare la composizione molecolare di questi complessi, la localizzazione subcellulare, la cinetica e le dimensioni di queste strutture altamente ordinate 25,26,27.

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Protocollo

Questo protocollo segue le linee guida del comitato etico di ricerca umana del Baylor College of Medicine per la manipolazione di campioni umani. I campioni di sangue vengono gestiti seguendo le linee guida istituzionali sulla sicurezza per i campioni umani. I campioni di sangue sono ottenuti presso una banca del sangue regionale, dove vengono raccolti con la soluzione di citrato fosfato destrosio (CPD). Tuttavia, il sangue raccolto con altri anticoagulanti come eparina di sodio, eparina di litio o EDTA può essere utilizzato anche per questo protocollo28,29.

1. Isolamento dei monociti umani e differenziazione in macrofagi

  1. Ottenere sangue anticoagulato da individui sani non identificati presso una banca del sangue regionale e isolare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) come indicato di seguito.
    NOTA: Eseguire tutte le fasi in una cappa a flusso laminare per colture tissutali. Utilizzare solo tubi sterili e indossare guanti. Aggiungere il 10% di candeggina a tutti i prodotti correlati al sangue durante lo smaltimento. PBS sterile (1x) o DPBS (senza Ca2+ e Mg2+) può essere utilizzato in modo intercambiabile.
    1. Preparare il tampone di diluizione: Integrare 1x PBS sterile con 2% FBS e 0,5 mM EDTA.
    2. Preparare il terreno di coltura: Integrare il terreno RPMI-1640 con FBS (10% (v / v)), glutamax (2 mM) e penicillina / streptomicina (50 U.I./50 μg/mL)
    3. Preraffreddare il buffer di funzionamento (Tabella dei materiali) secondo il protocollo del produttore.
    4. Diluire il sangue intero con due volumi di tampone di diluizione. Utilizzando un pipetto sierologico, trasferire 15 mL di sangue anticoagulato in un tubo da 50 mL contenente 30 mL del tampone di diluizione. Mescolare delicatamente per inversione.
    5. Per ogni 10 mL di sangue intero o 30 mL di sangue diluito, aggiungere 15 mL del gradiente di densità medio a un tubo vuoto da 50 mL.
    6. Sovrapporre il mezzo gradiente di densità dal punto 1.1.5 con 30 mL di sangue diluito lentamente e costantemente utilizzando un pipetto sierologico da 25 mL. Tenere la punta del pipetto contro la parete del tubo e il tubo ad angolo inclinato.
    7. Trasferire con cura i tubi in una centrifuga a benna oscillante. Evitare di disturbare le due fasi. Centrifugare i tubi a 400 x g a temperatura ambiente (RT) per 25 min con accelerazione e decelerazione impostate al valore minimo.
    8. Rimuovere con attenzione lo strato di plasma superiore (trasparente) utilizzando un pipetto da 10 ml e smaltire in un contenitore con candeggina (10%).
    9. Raccogliere lo strato interfase (bianco) di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC, Figura 2) con un pipetto da 10 ml e trasferirlo in un tubo fresco da 50 ml. Combinare lo strato bianco di diversi tubi dello stesso donatore in un tubo da 50 ml fino a 30 ml.
    10. Portare ogni tubo ad un volume totale di 50 ml con il tampone di diluizione dal punto 1.1.1 e centrifugare a 300 x g e 4 °C per 10 minuti. Rimuovere il surnatante con un pipetto da 10 ml e smaltirlo in un contenitore con candeggina (10%).
    11. Risospesare ogni pellet di cella in 1 mL del buffer di funzionamento pre-raffreddato dal passaggio 1.1.3 utilizzando una micropipetta p1000. Combinare le sospensioni cellulari dello stesso donatore in un nuovo tubo da 15 ml. Portare il volume di ciascun tubo a 15 ml con buffer di funzionamento pre-raffreddato e mescolare bene per inversione.
    12. Prendere un'aliquota di 20 μL della sospensione cellulare dal punto 1.1.11 e preparare una diluizione 1:100 usando 1x PBS sterile. Determinare il numero di cellulare utilizzando un emocitometro.
    13. Centrifugare la sospensione cellulare dal punto 1.1.11 a 300 x g e 4 °C per 10 minuti e rimuovere il surnatante con un pipetto da 10 mL. Se necessario, utilizzare una micropipetta p200 per rimuovere completamente il surnatante.
    14. Sospendere i PBMC isolati in 80 μL di buffer MACS pre-raffreddato per ogni 1 x 107 celle, aggiungendo fino a un massimo di 800 μL del buffer.
    15. Aggiungere 20 μL di MicroBead CD14 anti-umani per ogni 1 x 107 cellule o fino a 100 μL per campione di sangue (~ 100 mL di sangue non diluito). Mescolare bene per inversione e posizionare su un rotatore a tubo per 20 minuti con miscelazione continua a 4 °C.
    16. Rimuovere i campioni dal rotatore del tubo, aggiungere 10 ml di tampone di scorrimento pre-raffreddato a ciascun tubo e centrifugare a 300 x g (accelerazione = 5, decelerazione = 5) e 4 °C per 10 minuti.
    17. Rimuovere il surnatante con un pipetto da 10 mL e risospesciare fino a 1 x 108 celle in 500 μL di tampone di funzionamento pre-raffreddato (2 x 108/mL).
    18. Eseguire l'isolamento delle celle CD14-positive mediante smistamento delle celle magnetiche utilizzando un sistema manuale o automatizzato (Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
    19. Prendere un'aliquota di 20 μL della sospensione cellulare dal punto 1.1.18 dopo la selezione CD14-positiva e preparare una diluizione 1:100 usando 1x PBS sterile. Determinare il numero di cellule contando le cellule su un emocitometro.
    20. Centrifugare le cellule CD14-positive a 300 x g e RT per 10 min. Rimuovere il surnatante utilizzando un pipetto da 10 ml o un sistema a vuoto.
    21. Sospendere il pellet di cella dal punto 1.1.20 del terreno di coltura preriscaldato dal punto 1.1.2 a una densità cellulare finale di 1 x 107 celle/mL.
  2. Seminare i monociti CD14-positivi isolati ad una densità cellulare di 5 x 106 cellule.
    1. Su un piatto di coltura tissutale di 10 cm, aggiungere 10 mL di terreno di coltura dal punto 1.1.2 integrato con 50 ng / mL di fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF).
    2. Aggiungere 0,5 mL di sospensione cellulare dal punto 1.1.21 al terreno di coltura a goccia e ruotare delicatamente la piastra. Incubare le cellule in un incubatore di colture tissutali umidificate (37 °C, 5% CO2) durante la notte.
    3. Il giorno successivo, aspirare il mezzo utilizzando un sistema di vuoto per rimuovere le celle che non si sono attaccate durante la notte. Aggiungere 10 mL di terreno di coltura fresco integrato GM-CSF (50 ng/mL) e incubare le cellule in un incubatore di colture tissutali umidificate (37 °C, 5% CO2) per 7 giorni per consentire la completa differenziazione (vedere figura 3A per la comparsa di monociti CD14+ in vari stadi di differenziazione in GM-CSF ). Scambiare il terreno di coltura ogni 2-3 giorni e integrare con GM-CSF fresco (50 ng / mL) ogni volta.

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Figura 2: Panoramica schematica del flusso di lavoro sperimentale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Preparazione dei componenti elettroporativi

NOTA: questo protocollo è progettato per una punta neon da 10 μL (Table of Materials). Per ogni trasfezione, utilizzare 1-2 x 105 celle. Si raccomanda di seminare cellule trasfettate su una piastra a 48 pozzetti o una piastra a camera a 8 pozzetti (cellule trasfettate da 10 μL per pozzetto). 1x DPBS sterile (senza Ca2+ e Mg2+) può essere utilizzato al posto di PBS.

  1. Il giorno 7, preparare un mezzo privo di antibiotici integrando il mezzo RPMI-1640 con FBS (10 % (v / v)) e glutamax (2 mM).
  2. Introdurre il mezzo RPMI-1640 senza siero, la soluzione di tripsina-EDTA (0,25%), 1 PBS sterile (senza Ca2+ e Mg2+) e il terreno di coltura completo dal punto 1.1.2 in un bagno d'acqua a 37 °C.
  3. Se si utilizzano piatti con fondo di vetro (per microscopia confocale) rivestire i piatti con bromuro di poli-D-lisina.
    1. Rivestire una 8 motrici ben camerate con 200 μL di poli-D-lisina bromidrato (0,1 mg/mL in 1x PBS sterile) e incubare per 5 minuti a RT.
    2. Aspirare la soluzione di poli-D-lisina e lavare il vetro una volta con 1x PBS sterile. Aspirare il PBS e procedere con il passaggio 2.4.
  4. Aggiungere 200 μL di terreno privo di antibiotici per pozzetto della piastra a 48 pozzetti o 8 piatti ben camerati e pre-incubare in un incubatore di colture tissutali umidificate (37 °C, 5% CO2) fino a quando non sarà pronto per placcare le cellule trasfettate.

3. Preparazione delle celle per l'elettroporazione

NOTA: La resa di MDM da un piatto di 10 cm alla fine del periodo di differenziazione di 7 giorni è di circa 1,5 x 106 celle. 1x DPBS sterile (senza Ca2+ e Mg2+) può essere utilizzato al posto di PBS. Questo protocollo è stato ottimizzato in modo che la maggior parte dei macrofagi siano staccati dalla piastra con il mantenimento della vitalità e dell'integrità cellulare. Gli MDM sono difficili da staccare dalle piastre di coltura cellulare. Pertanto, potrebbe essere necessario eseguire i passaggi 3.2 e 3.3 due volte per dissociare le cellule. Assicurarsi che ogni tempo di incubazione con tripsina-EDTA (0,25%) non superi i 5 minuti.

  1. Aspirare il mezzo da macrofagi completamente differenziati su piatti da 10 cm e lavare il monostrato cellulare con un mezzo RPMI-1640 caldo senza siero. Assicurati di rimuovere completamente il supporto.
  2. Raccogliere le cellule aggiungendo 2 ml di soluzione calda di tripsina-EDTA (0,25%) per piatto da 10 cm e incubare in un incubatore di colture tissutali umidificate (37 °C, 5% CO2) per 5 min.
  3. Completare il distacco cellulare pipettando delicatamente la soluzione di tripsina-EDTA (0,25%) su e giù su tutta l'area del piatto utilizzando una micropipetta p1000. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mL contenente 5 mL di terreno di coltura completo caldo dal punto 1.1.2.
  4. Porta il piatto su un microscopio a campo luminoso e controlla il distacco cellulare in vari campi visivi. Se c'è una notevole quantità di cellule ancora attaccate, ripetere i passaggi 3.2-3.3.
  5. Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 min a RT.
  6. Aspirare il mezzo e risospesciare le cellule in 10 ml di 1x PBS sterile preriscaldato a 37 °C. Prendi un'aliquota di 20 μL per determinare il numero di cellule usando un emocitometro.
  7. Prendere 1-2 x 105 cellule per trasfezione prevista e metterle in un tubo da 15 ml. Portare ad un volume finale di 15 ml con PBS sterile preriscaldato 1x. Centrifuga a 250 x g per 5 min a RT.
  8. Aspirare il PBS e centrifugare ancora una volta per 1 minuto a 250 x g. Rimuovere eventuali PBS residui dal pellet di cella utilizzando una micropipetta p200.

4. Nucleofezione di componenti della caspasi BiFC in macrofagi derivati da monociti umani

NOTA: questa sezione del protocollo viene eseguita utilizzando il sistema di trasfezione al neon (Tabella dei materiali). Questo protocollo delinea i passaggi per trasfettare 1-2 x 105 celle utilizzando una punta al neon da 10 μL (Table of Materials). Se si utilizza una punta neon da 100 μL, scalare di conseguenza. Evitare di esporre le cellule al tampone di risospensione R per più di 15 minuti, in quanto ciò potrebbe ridurre la vitalità cellulare e l'efficienza di trasfezione.

  1. Diluire il plasmide reporter (ad esempio, mCherry o dsRedmito a 100 ng / μL) in acqua priva di nucleasi o tampone TE 0,5x per visualizzare le cellule trasfettate.
  2. Diluire i plasmidi BiFC della caspasi ad una concentrazione appropriata in acqua priva di nucleasi o tampone TE 0,5x, in modo che il volume totale dei plasmidi non superi il 30% del volume totale di trasfezione di 10 μL (cioè 300 ng/μL di C1 Pro-VC e 300 ng/μL di C1 Pro-VN).
  3. Preparare un microtubo sterile da 1,5 mL per trasfezione prevista e aggiungere la quantità appropriata di plasmide reporter (cioè 50 ng o 0,5 μL) e caspasi BiFC plasmidi (cioè 300 ng o 1 μL di C1 Pro-VC e 300 ng o 1 μL di frammento C1 Pro-VN). Tenere i microtubi nel cofano in ogni momento.
  4. Posizionare la stazione della pipetta, il dispositivo, le punte, i tubi elettroporati e la pipetta in una cappa a flusso laminare sterile.
    NOTA: la stazione pipetta, il dispositivo, le punte, i tubi elettroporati e la pipetta sono inclusi nel sistema di trasfezione al neon.
  5. Collegare il connettore ad alta tensione e sensore sulla stazione pipetta alle porte posteriori del dispositivo secondo le istruzioni del produttore. Tenere la stazione pipetta vicino al dispositivo.
  6. Collegare il cavo di alimentazione all'ingresso CA posteriore e procedere a collegare il dispositivo alla presa elettrica. Premere l'interruttore di alimentazione per accendere il dispositivo.
  7. Immettere i parametri di trasfezione nella schermata di avvio visualizzata quando il dispositivo è acceso e collegato in modo appropriato. Premere su Tensione, immettere 1000 e premere fatto per impostare la tensione su 1000 V. Premere su Larghezza, immettere 40 e premere su Fine per impostare la durata dell'impulso su 40 ms. Infine, premere su # Impulsi, immettere 2 e premere su Fine per impostare il numero di impulsi elettrici su 2.
  8. Prendere uno dei tubi di elettroporazione (forniti nel kit) e riempirlo con 3 mL di tampone elettrolitico E (per punte da 10 μL e fornito nel kit) a RT. Inserire il tubo di elettroporazione nel supporto della pipetta sulla stazione della pipetta. Assicurarsi che l'elettrodo sul lato del tubo sia rivolto verso l'interno e che si senta un suono di clic quando il tubo viene inserito.
  9. Prendere il pellet di cella dal punto 3.8 e aggiungere 10 μL di tampone R di risospensione preriscaldato (fornito nel kit) per ogni 1-2 x 105 celle. Mescolare delicatamente con una micropipetta p20. Aggiungere 10 μL di sospensione cellulare a ciascun tubo impostato nel punto 4.3 e mescolare delicatamente con una micropipetta p20.
  10. Prendi la pipetta e inserisci una punta premendo il pulsante Push fino alla seconda fermata. Assicurarsi che il morsetto raccolga completamente lo stelo di montaggio del pistone nella punta e che non si osservi alcuno spazio nella testa superiore della pipetta.
  11. Per aspirare il campione, premere il pulsante sulla pipetta fino alla prima fermata e immergersi nel primo tubo contenente la miscela di DNA cellulare/plasmide. Aspirare lentamente la miscela nella punta della pipetta.
    NOTA: evitare le bolle d'aria in quanto possono causare l'arco durante l'elettroporazione e, se rilevate dal dispositivo, possono impedire l'erogazione dell'impulso elettrico. Se si osservano bolle d'aria, rilasciare il contenuto nel tubo e provare ad aspirare di nuovo.
  12. Inserire la pipetta con il campione con molta attenzione nel supporto della pipetta. Assicurarsi che la pipetta faccia clic e che sia posizionata correttamente.
  13. Premere Start sul touchscreen e attendere fino all'erogazione degli impulsi elettrici. Un messaggio sullo schermo indicherà il completamento.
  14. Rimuovere lentamente la pipetta dalla stazione e aggiungere immediatamente la sospensione cellulare trasfetta nel pozzetto corrispondente con mezzo privo di antibiotici preriscaldato dal passaggio 2.4 premendo lentamente il pulsante alla prima fermata.
    NOTA: Questa punta può essere riutilizzata fino a tre volte per lo stesso plasmide; in caso contrario, scartarlo in un contenitore per rifiuti a rischio biologico premendo il pulsante Push fino alla seconda fermata.
  15. Ripetere i passaggi 4.10-4.14 per ogni tubo contenente una miscela di DNA cellulare/plasmide.
  16. Scuotere delicatamente la piastra con cellule trasfettate e incubare per 1-3 ore in un incubatore di colture tissutali umidificate (37 °C, 5% CO2).
  17. Aggiungere ad ogni pozzetto 200 μL di terreno di coltura preriscaldato (mezzo completo) dal punto 1.1.2. Riposizionare il piatto nell'incubatore di colture tissutali umidificate (37 °C, 5% CO2). Consentire almeno 24 ore per l'espressione genica.
  18. Il giorno successivo, ispezionare la vitalità cellulare e l'efficienza di trasfezione utilizzando un microscopio a epifluorescenza.
    1. Accendere il microscopio a epifluorescenza e la scatola della sorgente luminosa fluorescente secondo le istruzioni del produttore e posizionare la parabola di coltura sul palco del microscopio.
    2. Selezionare l'obiettivo 10x o 20x e il filtro 568 nm (RFP).
    3. Per stimare la vitalità della cella, premere il pulsante TL (Transmitted Light LED) per visualizzare tutte le celle nel campo selezionato. Mentre si esamina l'oculare del microscopio, ruotare la manopola di messa a fuoco fino a quando le cellule non vengono osservate e verificare l'attacco della cellula nel campo selezionato.
      NOTA: le celle completamente attaccate rappresentano le celle vitali mentre le celle flottanti rappresentano le celle non vitali. Se la confluenza del pozzo è elevata, la presenza di cellule non attaccate potrebbe essere il risultato di una sovrastima del numero di cellule e non il risultato di una bassa vitalità. Tuttavia, una bassa confluenza accompagnata da un alto contenuto di cellule galleggianti significa bassa vitalità che può derivare dall'arco durante l'elettroporazione, dalla tossicità del plasmide o dalla sovraesposizione al tampone R di risospensione. Non utilizzare pozzetti che mostrano quest'ultimo comportamento.
    4. Per stimare l'efficienza della trasfezione, concentrarsi sulle cellule nel campo selezionato sotto la luce trasmessa come descritto sopra. Contare il numero totale di celle nel campo selezionato. Con il LED a luce trasmessa (TL) spento, premere il pulsante LED a luce riflessa (RL) per accenderlo.
    5. Concentrarsi sulla fluorescenza del gene reporter (globuli rossi) e contare il numero totale di cellule fluorescenti rosse. Ripetere questi passaggi (4.18.4-4.18.5) per almeno altri due campi per pozzetto.

5. Trattamento dell'acquisizione dati MDM e Caspasi BiFC trasfettati

NOTA: Se si prevede di visualizzare le cellule utilizzando un microscopio a epifluorescenza o confocale, si consiglia il trattamento con qVD-OPh (20 μM) per 1 ora di trattamento precedente con lo stimolo scelto per prevenire la morte cellulare caspasi-dipendente (prevalentemente apoptosi). Questo viene utilizzato nell'imaging per impedire alle cellule di sollevarsi a causa dell'apoptosi, rendendole molto difficili da visualizzare mentre si spostano fuori dal piano focale. Si noti che il reclutamento della caspasi nella piattaforma di attivazione e nella caspasi Associata BiFC non dipende dall'attività catalitica della caspasi e, di conseguenza, l'inibizione della caspasi non influirà su questo passaggio.

  1. Trattare con lo stimolo scelto circa 24 ore dopo la trasfezione e incubare per tutto il tempo necessario per ciascun farmaco.
    1. Preparare il mezzo di imaging integrando il terreno di coltura dal punto 1.1.2 con Hepes (20 mM, pH 7,2-7,5) e 2-mercaptoetanolo (55 μM).
    2. Aggiungere la concentrazione di stimolo desiderata al mezzo di imaging preriscaldato e mescolare delicatamente.
    3. Rimuovere accuratamente il fluido dalle cellule con una micropipetta p1000 e aggiungere 500 μL della soluzione di stimolo dal passaggio 5.1.2 lungo il lato del pozzo.
    4. Per eseguire pozzetti di controllo non trattati, aggiungere il mezzo di imaging senza lo stimolo.
    5. Incubare le cellule in un incubatore di colture tissutali umidificate (37 °C, 5% CO2) per tutto il tempo indicato per ciascun trattamento.
  2. Visualizza le cellule usando un microscopio a epifluorescenza o confocale.
    1. Accendere il microscopio e la sorgente luminosa fluorescente, seguendo le istruzioni del produttore.
    2. Selezionare l'obiettivo 10x o 20x e posizionare il piatto di coltura sul palco del microscopio.
    3. Utilizzando l'oculare del microscopio, trovare le cellule sotto il filtro a 568 nm e concentrarsi sulle cellule che esprimono il reporter dsRedmito/mCherry (globuli rossi).
    4. Conta tutte le celle rosse nel campo visivo e registra il numero.
    5. Mentre nello stesso campo visivo, passa al filtro 488 o 512 (GFP o YFP), procedi a contare il numero di globuli rossi che sono anche verdi (Venus-positive o BiFC-positive) e registra il numero.
    6. Contare almeno 100 cellule dsRedmito/mCherry -positive da un minimo di tre singoli campi visivi.
    7. Calcola la percentuale di cellule trasfettate positive a Venere per campo visivo e media le percentuali risultanti per ogni trattamento (bene) per ottenere la deviazione standard.
  3. Immagine delle cellule usando un microscopio a epifluorescenza o confocale
    NOTA: Per acquisire immagini confocali utilizzando un obiettivo 20x o un ingrandimento maggiore, le cellule devono essere placcate su piatti di vetro a meno che il microscopio non sia dotato di un obiettivo a lungo passaggio.
    1. Seguire i passaggi 5.2.1-5.2.3. Se si utilizza un microscopio confocale con l'obiettivo olio 40x, 60x o 63x, posizionare una goccia d'olio sull'obiettivo.
    2. Visualizza l'immagine dal vivo delle celle sullo schermo del computer acquisita dalla fotocamera. Utilizzare la sorgente luminosa a epifluorescenza per le immagini fluorescenti o passare la sorgente luminosa ai laser per le immagini confocali.
    3. Ottimizza la messa a fuoco e la posizione delle celle utilizzando il controllo del joystick e la rotellina di messa a fuoco.
    4. Impostare la potenza laser percentuale e il tempo di esposizione per i laser a 512 nm o 488 nm (YFP o GFP) e 568 nm (RFP) in modo che il segnale nell'immagine abbia un bell'aspetto e non raggiunga la saturazione.
    5. Attiva l'acquisizione dal vivo ed esamina l'immagine risultante. Assicurarsi che venga visualizzato un picco distinto per ogni fluor negli istogrammi di visualizzazione per entrambi i canali.
    6. Regolare la potenza del laser e il tempo di esposizione in base alle esigenze. Mantieni questi valori il più bassi possibile pur essendo in grado di rilevare entrambi i segnali fluorescenti (RFP e GFP / YFP).
    7. Durante la visualizzazione dell'immagine live delle celle, acquisire più immagini rappresentative di un campo che contiene una o più celle che esprimono il reporter mCherry/dsRedmito per ciascun pozzetto della piastra e salvare i dati.

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Risultati

Lo schema mostrato nella Figura 2 fornisce una panoramica di come ottenere, trasfettare e visualizzare l'MDM umano. Dopo l'incubazione dei monociti CD14+ selezionati con GM-CSF per 7 giorni, la morfologia cellulare cambia nel corso del periodo di differenziazione (Figura 3A), passando dalle cellule in sospensione sferica a spinose e completamente attaccate (giorni 3 e 4), e infine a cellule più diffuse quando completamente differenziate (giorno 7). Le cellule c...

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Discussione

Questo protocollo descrive il flusso di lavoro per ottenere macrofagi da monociti isolati da campioni di sangue umano e un metodo per introdurre in modo efficiente i reporter BiFC della caspasi infiammatoria nell'MDM umano senza compromettere la vitalità e il comportamento cellulare.

Questo protocollo sfrutta la tecnica BiFC35 per etichettare le caspasi infiammatorie nel dominio di reclutamento della caspasi (CARD) con frammenti non fluorescenti della proteina fluoresce...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Ringraziamo i membri del laboratorio LBH passati e presenti che hanno contribuito allo sviluppo di questa tecnica. Questo laboratorio è supportato da NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH/NIDDK F32DK121479 (BEB), NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH). La Figura 2 è stata disegnata utilizzando il software Biorender.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Coltura tissutale a 48 pozzettiPiastre 2:34Genesee Scientific25-108
Piastre per coltura tissutale da 10 cmVWR25382-166
2 Mercaptoetanolo 1000xThermo Fisher Scientific21985023
Coverglass a 8 pozzetti con coverglass da 1,5 HPColonne AutoMACS
Miltenyi (Biotec)130-021-101Per la separazione automatizzata utilizzando solo AutoMACS Pro Separator
AutoMACS ProMiltenyi (Biotec)130-092-545Per la separazione automatizzata utilizzando solo AutoMACS Pro Separator AutoMACS Pro
Soluzione di lavaggio Miltenyi(Biotec)130-092-987Per la separazione automatizzata utilizzando solo AutoMACS Pro Separator
AutoMACS Soluzione di risciacquoMiltenyi (Biotec)130-091-222Per la separazione automatizzata utilizzando solo AutoMACS Pro Separator
AutoMacs running bufferMiltenyi (Biotec)130-091-221Per la separazione manuale o automatizzata con QuadroMACS o AutoMACS pro Separator
Axio Observer Z1 microscopio invertito motorizzato dotato di un'unità disco rotante CSU-X1A 5000ZeissÈ possibile utilizzare qualsiasi microscopio confocale dotato di un modulo laser dotato di linee laser di lunghezze d'onda di 568 nm (RFP) e 488 o 512 nm (GFP o YFP)
AxioObserver A1, Research Grade Inverted MicroscopeZeissQualsiasi microscopio a epifluorescenza con filtri a fluorescenza in grado di eccitare lunghezze d'onda di 568 nm (RFP) e 488 o 512 nm (GFP o YFP) può essere utilizzato
CD14+ MICROBEADSMiltenyi (Biotec)130-050-201Per la separazione manuale o automatizzata con QuadroMACS o AutoMACS pro Separator
DPBS senza cloruro di calcio e cloruro di magnesioSigmaD8537-6x500ML
DsRed mito plasmideClontech632421Plasmidi simili che possono essere utilizzati come reporter fluorescenti si trovano su Addgene
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific10437028
Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mLSigmaGE17-1440-02
GlutaMAX Integratore (100x)Thermo Fisher Scientific35050079
GM-CSFThermo Fisher ScientificPHC2011
Hemin BioXtra, da Porcine, ≥ 96,0% (HPLC)Sigma51280-1G
HEPESThermo Fisher Scientific 15630106
Caspasi infiammatorie PlasmidiDisponibile su richiesta presso il laboratorio LBH
LPS-EB UltrapureInvivogenTLRL-3PELPS
LS ColonneMiltenyi (Biotec)130-042-401Per la separazione manuale utilizzando solo il separatore QuadroMACS
Rack per provette MACS da 15 mLMiltenyi (Biotec)130-091-052Per la separazione manuale con QuadroMACS Solo separatore
MACS MACS MultiStandMiltenyi (Biotec)130-042-303Per la separazione manuale con QuadroMACS Solo separatore
mCherry PlasmidiYungpeng Wang LabPlasmidi simili che possono essere utilizzati come reporter fluorescenti possono essere trovati su Addgene
Neon Transfection SystemThermo Fisher ScientificMPK5000Include dispositivo di elettroporazione al neon, pipetta e stazione di pipettazione
Sistema di trasfezione al neon 10 &; L KitThermo Fisher ScientificMPK1096Include tampone di risospensione R, tampone di risospensione T, tampone elettrolitico E, 96 x 10 µ L Punte al neon e tubi per elettroporazione al neon
Sale sodico di nigericina, soluzione prontaSigmaSML1779-1ML
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Poli-D-lisina bromidratoSigmaP7280-5mg
Separatore QuadroMACSMiltenyi (Biotec)130-090-976Per la separazione manuale utilizzando Solo separatore QuadroMACS
qVD-OPhFisher (ApexBio)50-101-3172
RPMI 1640 MediumThermo Fisher Scientific11875119
Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenoloThermo Fisher Scientific25200072
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher Scientific15575020
Zeiss Zen 2.6 (blue edition) softwareZeissQualsiasi software utilizzato per utilizzare il microscopio confocale di scelta
BiFC

Riferimenti

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