Preparazione biologica e tecnica meccanica per la determinazione delle proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari

Summary

Il protocollo descrive un metodo per lo studio della viscoelasticità della matrice extracellulare e della sua dipendenza dalla composizione proteica o da fattori ambientali. Il sistema di matrice bersaglio è la zonula del topo. Le prestazioni del metodo sono dimostrate confrontando il comportamento viscoelastico delle fibre zonulari wild-type con quelle prive di glicoproteina-1 associata alle microfibrille.

Abstract

L'elasticità è essenziale per la funzione di tessuti come vasi sanguigni, muscoli e polmoni. Questa proprietà deriva principalmente dalla matrice extracellulare (ECM), la rete proteica che lega insieme cellule e tessuti. Come le proprietà elastiche di una rete ECM si relazionano alla sua composizione, e se le proprietà di rilassamento dell'ECM svolgono un ruolo fisiologico, sono domande che devono ancora essere completamente affrontate. Parte della sfida risiede nella complessa architettura della maggior parte dei sistemi ECM e nella difficoltà di isolare i componenti ECM senza comprometterne la struttura. Un'eccezione è la zonule, un sistema ECM che si trova nell'occhio dei vertebrati. La zonula comprende fibre da centinaia a migliaia di micrometri di lunghezza che coprono lo spazio privo di cellule tra la lente e la parete oculare. In questo rapporto, descriviamo una tecnica meccanica che sfrutta la struttura altamente organizzata della zonula per quantificare le sue proprietà viscoelastiche e per determinare il contributo dei singoli componenti proteici. Il metodo prevede la dissezione di un occhio fisso per esporre la lente e la zonula e impiega una tecnica di pull-up che allunga le fibre zonulari allo stesso modo mentre la loro tensione viene monitorata. La tecnica è relativamente economica ma abbastanza sensibile da rilevare alterazioni nelle proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari in topi privi di proteine zonulari specifiche o con l'invecchiamento. Sebbene il metodo qui presentato sia progettato principalmente per studiare lo sviluppo e la malattia oculare, potrebbe anche servire come modello sperimentale per esplorare domande più ampie riguardanti le proprietà viscoelastiche degli ECM elastici e il ruolo di fattori esterni come la concentrazione ionica, la temperatura e le interazioni con le molecole di segnalazione.

Introduction

L'occhio di un vertebrato contiene una lente ottica vivente che aiuta a mettere a fuoco le immagini sulla ^retina1. La lente è sospesa sull'asse ottico da un sistema di fibre delicate e orientate radialmente, come illustrato nella Figura 1A. Ad un'estremità, le fibre si attaccano all'equatore della lente e, all'altra, alla superficie del corpo ciliare. Le loro lunghezze coprono distanze che vanno da 150 μm nei topi a 1 mm negli esseri umani. Collettivamente, queste fibre sono conosciute come la zonula di ^Zinn2, la zonula ciliare o semplicemente la zonula. Traumi oculari, malattie e alcune mal....

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato per gli studi sugli animali della Washington University e hanno aderito alla Dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva.

1. Fabbricazione di parti specializzate e costruzione di apparecchi

1. Fabbricazione di parti specializzate
   1. Fabbricazione di sonde. Tenere un capillare di vetro ad angolo, come mostrato nel pannello di sinistra della Figura 2A. Posizionare una fiamma da un accendisigari a circa 2 cm da un'estremità e tenerla lì fino a quando l'estremità si piega di 90°, come m....

Results

La tecnica di pull-up qui descritta fornisce un approccio semplice per determinare le proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari nei topi. In breve, l'occhio del topo viene prima preservato mediante iniezione di un fissativo alla pressione intraoculare fisiologica. Questo approccio mantiene l'inflazione naturale dell'occhio e mantiene le fibre correttamente pretensionate (la fissazione è stata ritenuta accettabile dopo che esperimenti preliminari hanno dimostrato che non alterava significativamente l'elasticità o la f.......

Discussion

La zonula è un insolito sistema ECM in cui le fibre sono disposte simmetricamente e possono essere manipolate in modo identico spostando la lente dell'occhio lungo l'asse ottico. Lo spazio può anche essere facilmente accessibile senza interruzioni cellulari, consentendo alle fibre di essere studiate in un ambiente vicino al loro stato nativo. La tecnica pull-up sfrutta questa presentazione ECM per manipolare le fibre delicate dei topi, un sistema geneticamente trattabile, e quantificare con precisione le loro proprietà m.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Viti esagonali da 1/4-20 lunghe 3/4 di pollice	Thorlabs	SH25S075
dado da 1/4-20			ferramenta
	Anycubic	Photon
4-40 viti lunghe 3/8 di pollice, 2	negozi
, OD 1,2 mm e 3 pollici di lunghezza, senza filamento	WPI	1B120-3
Cianoacrilato (super) colla	Loctite
Scala digitale con precisione fino a 0,01 g	Vernier	OHAUS Scout 220
Excel	Microsoft		Spreadsheet
Accendisigari
Microscopio per ispezione/dissezione		Amscope SKU: SM-4NTP	Distanza di lavoro ~ 15 cm
Micromanipolatore, Economy 4 assi	WPI	Kite-L
Micrometro motorizzato	Thorlabs	Z812B
Lente cilindrica negativa	Thorlabs		LK1431L1-75 mm lunghezza focale
Piastre di Petri, 50 mm
	Thorlabs	PH3
Post, 4 pollici	Thorlabs	TR4
Software di registrazione della scala	Vernier	LoggePro
Servomotore controller	Thorlabs	KDC101
Software del servomotore	Thorlabs	APT
Base scanalata, 1	Thorlabs	BA1S
Basi scanalate, 2	Thorlabs	BA2
Supporto per micromanipolatore	WPI	M-10
USB-camera per microscopio	Amscope	SKU: MD500
Colla attivata UV con sorgente UV	Amazon