Gli arti ricombinanti sono un potente modello sperimentale che consente di studiare il processo di differenziazione cellulare e la generazione di modelli sotto l'influenza di segnali embrionali. Questo protocollo presenta un metodo dettagliato per generare arti ricombinanti con cellule mesodermiche di pollo, adattabili ad altri tipi di cellule ottenute da organismi diversi.
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Articolo metodologico
Test degli arti ricombinanti di pollo per comprendere la morfogenesi, i modelli e i primi passi nella differenziazione cellulare
In questo articolo
Sommario
Abstract
La differenziazione cellulare è il processo messo a punto dell'impegno cellulare che porta alla formazione di diversi tipi di cellule specializzate durante la creazione di tessuti e organi in via di sviluppo. Questo processo viene mantenuto attivamente in età adulta. La differenziazione cellulare è un processo continuo durante lo sviluppo e l'omeostasi degli organi. Comprendere le prime fasi della differenziazione cellulare è essenziale per conoscere altri processi complessi come la morfogenesi. Pertanto, gli arti di pollo ricombinanti sono un modello sperimentale che consente lo studio della differenziazione cellulare e della generazione di modelli sotto segnali di pattern embrionali. Questo modello sperimentale imita un ambiente in vivo ; assembla cellule riaggregate in una copertura ectodermica ottenuta da una gemma precoce dell'arto. Successivamente, gli ectodermi vengono trasferiti e impiantati in un recettore dell'embrione di pulcino per consentirne lo sviluppo. Questo test è stato utilizzato principalmente per valutare le cellule delle gemme mesodermiche degli arti; tuttavia, può essere applicato ad altre cellule staminali o progenitrici di altri organismi.
Introduzione
L'arto vertebrato è un modello formidabile per studiare la differenziazione cellulare, la proliferazione cellulare, la morte cellulare, la formazione di pattern e la morfogenesi 1,2. Durante lo sviluppo, gli arti emergono come rigonfiamenti dalle cellule derivate dal mesoderma1 della piastra laterale. Le gemme degli arti sono costituite da un nucleo centrale di cellule mesodermiche coperte da un ectoderma. Da questa struttura iniziale, emerge un arto intero e ben formato. Dopo che il bocciolo dell'arto si presenta, vengono riconosciuti tre assi: (1) l'asse prossima-distale ([PD] spalla ....
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Protocollo
Questa ricerca è stata esaminata e approvata dall'Institutional Review Board for the Care and Use of Laboratory Animals dell'Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Città del Messico, Messico). Un diagramma di flusso schematico dei passaggi generali di questo protocollo è mostrato nella Figura 1A.
1. Incubazione embrionale e determinazione della vitalità
- Incubare le uova di gallina fecondate a 38 °C e al 60% di umidità relativa per circa tre giorni e mezzo fino a raggiungere lo stadio 22 HH (secondo Hamilton e Hamburger, 1951)
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Risultati
Riconoscere un arto ricombinante ben eseguito
Dopo l'innesto, gli embrioni manipolati sono stati restituiti all'incubatrice per consentire allo sviluppo della RL. Il tempo di incubazione è correlato ai requisiti dell'esperimento. Tuttavia, l'RL può essere facilmente distinto dopo 12 ore dall'impianto. Per determinare se l'impianto fosse adeguato, la RL è stata osservata come una protuberanza che era saldamente attaccata alla parete mesodermica dell'embrione donatore (Figura 2A
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Discussione
In generale, il protocollo RL può essere suddiviso in cinque fasi: (1) incubazione embrionale, (2) ottenimento di cellule mesodermiche degli arti per riempire gli ectodermi, (3) ottenimento degli ectodermi, (4) assemblaggio di cellule mesodermiche all'interno delle coperture ectodermiche e (5) trapianto degli ectodermi riempiti negli embrioni ospiti. Il principale limite della tecnica RL è il protocollo lungo e dettagliato, che ha molti punti critici che richiedono pazienza per essere eseguiti in modo appropriato. Per co.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Estefania Garay-Pacheco per le immagini in Figura 2 e Maria Valeria Chimal-Montes de Oca per l'opera d'arte. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [numeri di sovvenzione IN211117 e IN213314] e dal Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [numero di sovvenzione 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] assegnato a JC-M. JC M-L ha ricevuto una borsa di studio post-dottorato dal Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| Coltello a fessura angolato | Alcon | 2,75 mm DB | |
| Pinza smussata | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Collagenasi tipo IV | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| Incubatrice per uova | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Siero fetale bovino | Gibco | 16000069 | |
| Pinze chirurgiche fini | Strumenti di scienza | 9115-10 | |
| Hanks Soluzione salina bilanciata | Sigma | H6648 | |
| Microcentrifuga | Eppendorf | 5417R | |
| NA | |||
| Filo di palladio | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| Piastra di Petri | Nest | 705001 | |
| Pippette | crmglobe | PF1016 | |
| Stereomicroscopio | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA Tripsina | |
| suina | Merck | 9002 07-7 | |
| Ago di tungsteno | GoodFellow | E74-15096/01 |
Riferimenti
- Malashichev, Y., Christ, B., Pröls, F. Avian pelvis originates from lateral plate mesoderm and its development requires signals from both ectoderm and paraxial mesoderm. Cell and Tissue Research. 331 (3), 595-604 (2008).
- Mahmood, R., et al.
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Ristampe e permessi
