Una solida piattaforma di scoperta per l'identificazione di nuovi mediatori delle metastasi del melanoma

Summary

Questo articolo descrive un flusso di lavoro di tecniche impiegate per testare nuovi potenziali mediatori di metastasi del melanoma e i loro meccanismi d'azione.

Abstract

Le metastasi sono un processo complesso, che richiede alle cellule di superare barriere che sono solo modellate in modo incompleto da saggi in vitro . È stato stabilito un flusso di lavoro sistematico utilizzando modelli in vivo robusti e riproducibili e metodi standardizzati per identificare nuovi attori nelle metastasi del melanoma. Questo approccio consente l'inferenza dei dati in specifiche fasi sperimentali per caratterizzare con precisione il ruolo di un gene nelle metastasi. I modelli vengono stabiliti introducendo cellule di melanoma geneticamente modificate tramite iniezioni intracardiache, intradermiche o sottocutanee nei topi, seguite dal monitoraggio con imaging seriale in vivo . Una volta raggiunti gli endpoint prestabiliti, i tumori primari e/o gli organi portatori di metastasi vengono prelevati ed elaborati per varie analisi. Le cellule tumorali possono essere ordinate e sottoposte a una qualsiasi delle diverse piattaforme "omiche", incluso il sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Gli organi vengono sottoposti ad imaging e analisi immunoistopatologiche per quantificare il carico complessivo delle metastasi e mappare la loro specifica posizione anatomica. Questa pipeline ottimizzata, compresi i protocolli standardizzati per l'attecchimento, il monitoraggio, la raccolta dei tessuti, l'elaborazione e l'analisi, può essere adottata per colture derivate dal paziente, a breve termine e linee cellulari umane e murine consolidate di vari tipi di cancro solido.

Introduction

L'elevata mortalità associata al melanoma metastatico combinata con una crescente incidenza di melanoma in tutto il mondo¹ (un aumento stimato del 7,86% entro il 2025) richiede nuovi approcci terapeutici. I progressi nella scoperta del target dipendono da modelli riproducibili di metastasi, un processo altamente complesso. Durante le fasi della cascata metastatica, le cellule di melanoma devono superare innumerevoli barriere per raggiungere l'evasione del sistema immunitario e la colonizzazione di tessuti distanti². La resilienza e l'adattabilità delle cellule di melanoma derivano da una moltitudine di fattori, tra cui i....

Protocol

NOTA: Le procedure animali coinvolte nel seguente protocollo sono state approvate dal New York University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Tutte le procedure sono condotte in strutture approvate dall'Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). La Figura 1 illustra l'approccio sperimentale generale.

1. Colture a breve termine di melanoma derivate dal paziente (STCs)

1. Posizionare il tessuto in una capsula di Petri da 60 mm con 1 mL di RPMI completo (RPMI 1640 integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS), 2 mM di L-g....

Results

Le figure seguenti illustrano come il flusso di lavoro descritto è stato applicato per l'identificazione di nuovi driver di metastasi del melanoma. La Figura 2 riassume i risultati di uno studio pubblicato in cui sono stati studiati gli effetti del silenziamento della fucosiltransferasi FUT8 nelle metastasi del melanoma in vivo ²⁶. In breve, l'analisi dei dati glicemici dei pazienti umani (ottenuti da array di lectine) e il profilo trascrittomico hanno rivela.......

Discussion

Lo scopo di questo rapporto tecnico è quello di offrire un flusso di lavoro standardizzato, dall'alto verso il basso per lo studio di potenziali attori nelle metastasi del melanoma. Poiché gli esperimenti in vivo possono essere costosi e dispendiosi in termini di tempo, le strategie per massimizzare l'efficienza e aumentare il valore delle informazioni ottenute sono fondamentali.

È imperativo utilizzare approcci complementari per incrociare i risultati all'interno dello stesso esperim.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#15 Lama Scapel	WPI	500242	Per procedure chirurgiche
#3 Scapel Handle	WPI	500236	Per procedure chirurgiche
1 mL di siringa di tubercolina, punta scorrevole	BD	309626	Iniezioni
Siringa da 10 mL, punta a slittamento	BD	301029	Perfusione
10% Formalina Tamponata	di sodio EK Industries	4499-20L	Per perfusione/fissativo tissutale
15 mL	Corning conico	430052	Colture cellulari
15 mL Provette coniche da centrifuga in polipropilene	Falcon	352196	Coltura cellulare
200 Proof Ethanol	Deacon Labs	04-355-223	Istologia
22G - Ago da 22 mm	BD	305156	Perfusione
4-0 Vicryl Suture	Ethicon	J464G	Sutura
4% fosfato di Carson tamponato paraformaldeide	EMS	15733-10	Per perfusione/fissativo tissutale
40µ m	Corning	431750	Lavorazione dei tessuti
5-0 Sutura assorbibile	Ethicon	6542000	Chiusura
50 mL Conico	Corning	430828	Colture cellulari
50mL Provette coniche da centrifuga in polipropilene Falcon		352070	Coltura cellulare
7-0 Sutura in seta	FST	18020-70	Legatura
70µ m	Corning	431751	Lavorazione dei tessuti
Supporti di montaggio anti-sbiadimento	Vector Labs	H-1000-10	Approssimatore di immunofluorescenza
che applica pinze, 10 cm	WPI	14189	Per procedure microchirurgiche
Avance	Bruker	3 HD	NMR Console
Biospec 7030	Bruker	7030	Micro MRI
BSA	Bioreg	A941	NuMA Colorazione
Pinza per sutura Castroviejo, punte dritte Piattaforma di legatura da 5,5 mm, 11 cm	WPI	WP5025501	Per procedure microchirurgiche
Barattolo di colorazione Coplin	Bel-Art	F44208-1000	Istologia
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	Immunofluorescenza
dCas9-KRAB	Addgene	110820	Manipolazione genetica
DNase I	NEB	M0303L	Elaborazione dei tessuti
DPBS	Corning	21-030-CM	Lavorazione dei tessuti
Lama a bordo singolo non rivestita extra affilata	GEM	62-0167	Lavorazione dei tessuti
Substrato della matrice extracellulare	Corning	354234	considerare il fattore di crescita ridotto (come alternativa
FBS	Cytiva	SH30910.03	Coltura cellulare
Fiji Immagine J	Fiji Immagine J	Software	Immunofluorescenza
Capra anti-coniglio HRP coniugato multimero	Thermo Fisher	A16104	NuMA Siero di capra colorante
	Gibco	PCN5000	Immunofluorescenza
HBSS	Corning	21-020-CV	Lavorazione dei tessuti
Ematossilina	Richard-Allan Scientific	7231	Istologia
Illumina III	PerkinElmer	CLS136334	BLI Instrument
Siringa da insulina 28G - ago da 8 mm	BD	329424	Iniezioni
Siringa da insulina 31G - ago da 6 mm.	BD	326730	Iniezioni Pinze
iris, 10,2 cm, curva completa, seghettate	WPI	504478	Per perfusione e procedure chirurgiche
Isoflurano USP	Covetrus	11695067772	Anestesia
Gioiellieri #7 Pinze Titanio 11 cm 0,07 x 0,01 mm Punta	WPI	WP6570	Per procedure microchirurgiche
Ketamina HCl 100mg/mL	Mylan Ind.	1049007	Anestesia
lentiCRISPRv2	Addgene	98290	Manipolazione genetica
Lycopersicon Esculentum (Pomodoro) Lectina, DyLight 649	Invitrogen	L32472	Marcatore di cellule endoteliali vascolari
MEM aminoacidi non essenziali X 100	Corning	25-025-CI	Colture cellulari
Forbici Metzenbaum	WPI		503269 Per chirurgia procedure
Unità di microiniezione	KOPF	5000	Iniezioni intracardiache
NaCl	Fisher	S25877	Colorazione NuMA
Ago 30G x 25mm	BD	305128	Ago per iniezione intracardiaca
33G x 15mm	Hamilton	7747-01	iniezione intracarotidea
, Castroviejo, 14cm, con blocco, 1,2mm Ganasce seghettate	WPI	14137-G	Per procedure microchirurgiche
NOD. Topi Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ	The Jackson Laboratory	005557	topi Murine model
NU/J	The Jackson Laboratory	002019	Modello murino
Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human	Abcam	97585	NuMA Colorazione
Penicillina-Streptomicina 10000U/mL	Gibco	15140122	Coltura cellulare
Percoll	GE	0891-01	soluzione di separazione della densità
Guanti chirurgici classici PI Cardinal	Health	2D72PT75X	Chirurgia
pLKO Tet-On	Addgene	21915	Manipolazione genetica
Povidone-Iodio 10% Soluzione	Medline	MDS093943	Chirurgia
Gocce di proparacaina 0,5%	Akorn Pharma	AX0501	Anestetico locale oftalmico
Puralube Petrolatum Unguento oftalmico	Dechra	83592	anestesia
Lame a doppio taglio	EMS	72000	Rasatura e Vibrotomo Brain Slicing
Reflex 9mm EZ Clip	Braintree	EZC-  KIT	Chiusura ferita
RPMI 1640	Corning	10-040-CM	Forbici per colture cellulari
, molla 10,5 cm Str, lame da 8 mm	WPI	501235	Per procedure microchirurgiche
Microtomo a lama vibrante semiautomatico	Leica	VT1200	Brain Slice Immunofluorescenza
Sistema di vaporizzazione per anestesia a canale singolo	Kent Scientific	VetFlo-1210S	anestesia
Sistema di camere da tavolo Smartbox e soffiatore di scarico	EZ Systems	TT4000	Eutanasia CO2
Telo monouso fenestrato sterile	Medline	NON21002	Chirurgia
Cultori chirurgici Aurora sterili non rinforzati con maniche a scomparsa	Medline	DYNJP2715
Surgery T25 Flask	Corning	430639	Coltura cellulare
Tris	Corning	46-031-CM	Colorazione NuMA
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML	Troutman in immunofluorescenza
, 10 cm, modello G curvo, punta da 0,52 mm con piattaforma di legatura	WPI	WP505210	Per procedure microchirurgiche
Clip per vasi 10G Pressione 5x 0,8 mm Ganasce, 5/confezione	WPI	15911	Per procedure microchirurgiche
Visiopharm	Visiopharm Visiopharm		Software di quantificazione della colorazione NuMA
Xilasina 100mg/mL	Akorn Pharma	59399-111-50	Anestesia
Xilene	Fisher	X3P-1GAL	Istologia