Articolo metodologico

In vitro Screening farmacologico contro tutte le fasi del ciclo di vita di Trypanosoma cruzi utilizzando parassiti che esprimono β-galattosidasi

DOI:

10.3791/63210

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5 novembre 2021

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1Área Parasitología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR), 2Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET, 3Instituto de Investigaciones Biomédicas (INBIOMED), Universidad de Buenos Aires (UBA) Facultad de Medicina, CONICET

In questo articolo

Sommario

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Descriviamo un saggio colorimetrico ad alto rendimento che misura l'attività β-galattosidasi in tre fasi del ciclo di vita di Trypanosoma cruzi, l'agente eziologico della malattia di Chagas. Questo test può essere utilizzato per identificare i composti tripanocidi in modo facile, veloce e riproducibile.

Abstract

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Trypanosoma cruzi è l'agente eziologico della malattia di Chagas (ChD), una malattia endemica di importanza per la salute pubblica in America Latina che colpisce anche molti paesi non endemici a causa dell'aumento della migrazione. Questa malattia colpisce quasi 8 milioni di persone, con nuovi casi stimati in 50.000 all'anno. Negli anni 1960 e '70, sono stati introdotti due farmaci per il trattamento della ChD: nifurtimox e benznidazolo (BZN). Entrambi sono efficaci nei neonati e durante la fase acuta della malattia ma non nella fase cronica, e il loro uso è associato a importanti effetti collaterali. Questi fatti sottolineano l'urgente necessità di intensificare la ricerca di nuovi farmaci contro T. cruzi.

T. cruzi è trasmesso attraverso insetti vettori ematofagi delle famiglie Reduviidae ed Hemiptera. Una volta nell'ospite mammifero, si moltiplica intracellulare come forma amastigote non flagellata e si differenzia nella tripomastigote, la forma infettiva non replicativa del flusso sanguigno. All'interno dell'insetto vettore, i tripomastigoti si trasformano nello stadio epimastigote e si moltiplicano attraverso la fissione binaria.

Questo articolo descrive un test basato sulla misurazione dell'attività della β-galattosidasi citoplasmatica rilasciata nella coltura a causa della lisi dei parassiti utilizzando il substrato, clorofenolo rosso β-D-galattopiranoside (CPRG). Per questo, il ceppo T. cruzi Dm28c è stato trasfettato con un plasmide sovraespressivo β-galattosidasi e utilizzato per lo screening farmacologico in vitro negli stadi epimastigote, tripomastigote e amastigote. Questo articolo descrive anche come misurare l'attività enzimatica in epimastigoti in coltura, cellule Vero infette con amastigoti e tripomastigoti rilasciati dalle cellule coltivate utilizzando il farmaco di riferimento, il benznidazolo, come esempio. Questo test colorimetrico è facilmente eseguibile e può essere scalato in un formato ad alta produttività e applicato ad altri ceppi di T. cruzi .

Introduzione

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La malattia di Chagas (ChD), o tripanosomiasi americana, è una malattia parassitaria causata dal protozoo flagellato, Trypanosoma cruzi (T. cruzi). ChD inizia con una fase acuta asintomatica o oligosintomatica che di solito non viene diagnosticata, seguita da una fase cronica permanente. Nella cronicità, ~ 30% dei pazienti manifesta - decenni dopo l'infezione - una varietà di condizioni debilitanti, tra cui miocardiopatia, sindromi mega-digestive, o entrambe, con un tasso di mortalità che va dallo 0,2% al 20% 1,2,3. I pazienti cronici asintomatici possono non avere segni clinici, ma rimangono sieropositivi per tutta la vita.

Le stime suggeriscono che circa 7 milioni di persone sono infette in tutto il mondo, per lo più dall'America Latina, dove la ChD è endemica. In questi paesi, T. cruzi viene trasmesso principalmente attraverso insetti triatomine infetti succhiatori di sangue (trasmissione trasmessa da vettori) e meno frequentemente per trasmissione orale attraverso l'ingestione di alimenti contaminati da feci di triatomina contenenti i parassiti2. Inoltre, il parassita può essere trasmesso attraverso la placenta dalle madri chagasic ai neonati, attraverso trasfusioni di sangue o durante il trapianto di organi. Questi modi indipendenti dal vettore di acquisire l'infezione e la migrazione umana hanno contribuito alla diffusione mondiale della malattia, evidenziata da un numero crescente di casi in Nord America, Europa e alcuni paesi africani, del Mediterraneo orientale e del Pacifico occidentale4. La ChD è considerata una malattia trascurata in quanto la trasmissione trasmessa da vettori è strettamente associata alla povertà ed è un importante problema di salute pubblica, specialmente nei paesi a basso reddito dell'America Latina. Sebbene ci siano trattamenti disponibili, la mortalità dovuta a ChD in America Latina è la più alta tra le malattie parassitarie, tra cui la malaria2.

Ci sono due farmaci registrati per il trattamento ChD introdotti alla fine del 1960 e all'inizio del 1970: nifurtimox e benznidazolo5. Entrambi i farmaci sono efficaci nella fase acuta della malattia negli adulti, nei bambini e nei neonati congenitamente infetti, così come nei bambini con infezione cronica, dove di solito si ottiene la cura. Tuttavia, solo poche persone vengono diagnosticate abbastanza presto da essere trattate in tempo. Secondo gli ultimi studi clinici, entrambi i farmaci hanno importanti limitazioni negli adulti e sono stati inefficaci nel ridurre i sintomi nelle persone con malattie croniche; quindi, il loro uso in questa fase è controverso. Altri inconvenienti sono i periodi di trattamento prolungati richiesti (60-90 giorni) e gli effetti avversi frequenti e gravi osservati, che portano all'interruzione della terapia in una percentuale di persone infette 6,7. Si stima che meno del 10% delle persone con ChD siano state diagnosticate e ancora meno abbiano accesso alle cure, poiché molti individui affetti vivono in aree rurali con accesso assente o scarso all'assistenza sanitaria8. Questi fatti evidenziano l'urgente necessità di trovare nuovi farmaci contro T. cruzi per consentire trattamenti più efficienti, sicuri e applicabili al campo, specialmente per la fase cronica. A questo proposito, un'altra sfida nello sviluppo di composti più efficaci è la limitazione dei sistemi per valutare l'efficacia dei farmaci in vitro e in vivo9.

Sebbene la biologia chimica e gli approcci genomici per l'identificazione di potenziali bersagli farmacologici siano stati utilizzati nei parassiti kinetoplastidi, gli strumenti genomici disponibili in T. cruzi sono limitati in contrasto con T. brucei o Leishmania. Pertanto, lo screening di composti con attività tripanocida è ancora l'approccio più utilizzato nella ricerca di nuovi candidati farmaci chemioterapici contro ChD. Di solito, la scoperta di farmaci in T. cruzi deve iniziare con il test degli effetti di un nuovo farmaco in un test in vitro contro lo stadio epimastigote. Per decenni, l'unico modo per misurare gli effetti inibitori dei composti candidati su T. cruzi era il conteggio microscopico manuale, che è laborioso, dispendioso in termini di tempo e dipendente dall'operatore. Inoltre, questo approccio è adatto per l'analisi di un piccolo numero di composti, ma è inaccettabile per lo screening ad alto rendimento di grandi librerie di composti. Al giorno d'oggi, molte indagini iniziano con l'analisi di un vasto numero di composti di origini diverse che vengono analizzati in vitro, testando la loro capacità di inibire la crescita dei parassiti. Sono stati sviluppati sia metodi colorimetrici che fluorometrici per aumentare la produttività in questi saggi, migliorando l'obiettività dello screening e rendendo l'intero processo meno noioso9.

Uno dei metodi colorimetrici più utilizzati si basa sull'attività β-galattosidasi dei parassiti trasfettati descritti per la prima volta da Bucknet e dai collaboratori10. L'enzima β-galattosidasi espresso dai parassiti ricombinanti idrolizza il substrato cromogenico, il clorofenolo rosso β-D-galattopiranoside (CPRG), al rosso clorofenolo, che può essere facilmente misurato colorimetricamente utilizzando uno spettrofotometro a micropiastre. Pertanto, la crescita del parassita in presenza di una varietà di composti può essere simultaneamente valutata e quantificata in piastre di microtitolazione. Questo metodo è stato applicato per testare farmaci in forme epimastigote (presenti nell'insetto vettore), tripomastigoti e amastigoti intracellulari, gli stadi mammiferi del parassita. Inoltre, sono già disponibili diversi ceppi di T. cruzi ricombinanti trasfettati con il plasmide pBS:CL-Neo-01/BC-X-10 (pLacZ)10 per esprimere l'enzima Escherichia coli β-galattosidasi (e ne possono essere costruiti di nuovi), che consente la valutazione di parassiti provenienti da diverse unità di tipizzazione discreta (DTU) che potrebbero non comportarsi allo stesso modo verso gli stessi composti 10,11,12,13 . Questo metodo è già stato utilizzato con successo per valutare i composti per l'attività contro T. cruzi nello screening a bassa e alta produttività12,13. Approcci simili sono stati utilizzati anche in altri parassiti protozoari, tra cui Toxoplasma gondii e Leishmania mexicana14,15.

Questo documento descrive e mostra un metodo dettagliato per uno screening farmacologico in vitro contro tutte le fasi del ciclo di vita di T. cruzi utilizzando parassiti che esprimono β-galattosidasi. I saggi qui presentati sono stati eseguiti con una linea di T. cruzi che esprime β galattosidasi ottenuta per trasfezione del ceppo T. cruzi Dm28c da DTU I13 con plasmide pLacZ (Dm28c/pLacZ). Inoltre, lo stesso protocollo potrebbe essere facilmente adattato ad altri ceppi per confrontare le prestazioni tra composti e tra ceppi di T. cruzi o DTU.

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Protocollo

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NOTA: una panoramica dell'intero progetto sperimentale è illustrata nella Figura 1.

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Figura 1: Panoramica del test di screening in vitro della linea Trypanosoma cruzi Dm28c/pLacZ utilizzando CPRG come substrato per la reazione colorimetrica. Il test consiste nel seminare i parassiti (1), incubarli con BZN (2 e 3) e quindi aggiungere il substrato colorimetrico (4). Quando i parassiti vengono lisati, viene rilasciata β-galattosidasi e scinde CPRG in rosso clorofenolo; questo cambiamento di colore può essere misurato spettrofotometricamente (5). I dati possono essere analizzati in un software di analisi statistica per ottenere la concentrazione semi-inibitoria (IC50) di BZN. Abbreviazioni: CPRG = clorofenolo rosso β-D-galattopiranoside; BZN = benznidazolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Preparazione di soluzioni stock

  1. Preparazione di media e soluzioni
    1. Soluzione di hemin (Tabella supplementare S1)
      1. Aggiungere tutti i componenti a un tubo centrifuga da 50 ml nell'ordine indicato nella ricetta e omogeneizzare per inversione più volte.
      2. Sterilizzare per filtrazione attraverso un filtro da 0,22 μm.
      3. Preparare aliquote da 1 mL in tubi microcentrifuga da 1,5 mL e mantenerli a -80 °C fino all'uso.
    2. Iniezione epatica triptosio (LIT) Media (Tabella supplementare S1)
      1. Pesare tutti i componenti e mescolare per omogeneizzare a temperatura ambiente in un becher da 1 L contenente almeno 700 ml di acqua distillata.
      2. Regolare il pH a 7,2 e rabboccare il volume a 900 ml in un cilindro graduato da 1 L con acqua distillata; sterilizzare per filtrazione o autoclave (121 °C per 20 min).
      3. Integrare il mezzo aggiungendo 100 mL di siero fetale di vitello (FCS), (10% FCS, sterile e inattivato termicamente a 56 °C per 45 min), 20 ml di soluzione di glucosio sterile al 40% (sterilizzata mediante autoclave, 121 °C per 20 min) e 5 ml di soluzione di emina (concentrazione finale 5 μM) a 900 mL di mezzo LIT.
    3. Preparare il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco dalla polvere seguendo le istruzioni del produttore.
    4. Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (Tabella supplementare S1)
      1. Sciogliere tutti i componenti solidi mescolando la soluzione a temperatura ambiente in un becher da 1 L.
      2. Regolare il pH a 7,2, livellare fino a 1 L in un cilindro graduato da 1 L con acqua distillata e sterilizzare mediante filtrazione o autoclave (121 °C, 20 min).
  2. Soluzioni e diluizioni stock di benznidazolo (BZN)
    NOTA: L'intervallo di concentrazione di BZN utilizzato in questo lavoro era compreso tra 2,5 e 80 μM.
    1. Preparare una soluzione madre di 1 M BZN sciogliendo 13 mg del farmaco in 50 μL di dimetilsolfossido (DMSO). In condizioni asettiche, preparare diluizioni seriali da questa soluzione madre BZN da 1 M al doppio della concentrazione finale desiderata (soluzioni 2x) in un volume finale adeguato al numero di pozzetti da analizzare.
      NOTA: Calcolare per 100 μL per pozzetto con un eccesso di 10-20%. La soluzione madre BZN e tutte le diluizioni BZN devono essere preparate immediatamente prima dell'uso nel test a causa della bassa solubilità del farmaco nel mezzo.
    2. Preparare 2 diluizioni BZN di 160, 80, 40, 20, 10 e 5 μM.
      1. Diluire la soluzione madre 1 M BZN a una diluizione di 100 volte (10 μL di 1 M BZN + 990 μL di mezzo) per ottenere una soluzione di 10 mM nel mezzo appropriato utilizzato per ogni fase del ciclo di vita di T. cruzi. Mescolare continuamente per omogeneizzare la sospensione.
      2. Diluire la soluzione di BZN da 10 mM per preparare 320 μM di BZN nel mezzo appropriato: 32 μL di 10 mM BZN + 968 μL di mezzo. Mescolare continuamente per omogeneizzare la sospensione.
      3. Diluire 320 μM BZN 2 volte per ottenere una concentrazione di 160 μM (500 μL di 320 μM BZN + 500 μL di mezzo). Mescolare continuamente per omogeneizzare la sospensione. Ripetere questa diluizione 2 volte con ogni soluzione risultante per ottenere soluzioni da 80, 40, 20, 10 e 5 μM.
      4. DMSO diluito 1.000 volte nel mezzo appropriato per l'uso come controllo non trattato (controllo della sopravvivenza al 100%).
        NOTA: gli epimastigoti tollerano fino a una diluizione di DMSO di 100 volte, mentre le cellule Vero tollerano solo una diluizione di DMSO fino a 1.000 volte. Se necessario, un controllo della morte con il 50% di DMSO può essere incluso come condizione di sopravvivenza allo 0%.
  3. Soluzione di substrato
    1. Sciogliere CPRG a 1 mM di concentrazione in acqua distillata. Per una piastra da 96 pozzetti, aggiungere 2,4 mg di CPRG a 4 ml di acqua.
      NOTA: la soluzione cprg deve essere preparata immediatamente prima del test.
  4. Soluzione di lisi
    1. Preparare una soluzione al 2,5% v/v di detergente non ionico e non denaturante 2-[4-(2,4,4-trimetilpentano-2-il)fenossi]etanolo (vedere la tabella dei materiali) in 1x PBS. Preparare 1 mL di soluzione per piastra da 96 pozzetti immediatamente prima del test.

2. Preparazione della coltura del parassita

  1. Preparazione epimastigote
    NOTA: T. cruzi Dm28c/pLacZ linea13 è utilizzato in tutto questo rapporto.
    1. Coltivare axenicamente a 28 °C i bubottinite che esprimono β galattosidasi a 28 °C in palloni di coltura cellulare con un'area di crescita di 25 cm2 (palloni T-25). Mantenere le colture in fase logaritmica subculturando ogni 48-72 h (in 5 mL) in mezzo LIT integrato con 10% FCS (Tabella Supplementare S1) e geneticina solfato (G418) ad una concentrazione finale di 200 μg/mL. Quantificare la crescita dei parassiti contando le cellule in una camera neubauer prima di subculturare. Chiudere saldamente il tappo e mantenere il matraccio di coltura (non ventilato) a 28 °C in posizione verticale.
      NOTA: G418 garantisce la selezione e la manutenzione del plasmide pLacZ. Le colture in fase logaritrica hanno una concentrazione di epimastigote di 1-5 × 107 parassiti/mL per la linea Dm28c/pLacZ.
    2. Preparare una sospensione di 2 × 105 epimastigoti/mL da una coltura in fase logaritmica in LIT integrata con antibiotico G418. Erogare 100 μL della sospensione di epimastigote per pozzetto (20.000 epimastigoti in 100 μL di LIT) di una micropiastra a 96 pozzetti e portare il volume finale a 200 μL per pozzetto con il mezzo.
  2. Preparazione amastigote
    1. Utilizzare tripomastitigoti metaciclici spontanei ottenuti da una coltura di epimastigote invecchiata (per 7 giorni in questo protocollo) per eseguire un'infezione iniziale in un pallone T-25 con 2 × 105 cellule Vero seminate in precedenza in DMEM integrate con FCS al 2%.
      1. Contare il numero di tripomastitigoti metaciclici in una camera neubauer, infettare il monostrato cellulare Vero con una molteplicità di infezione (MOI) di 10 in 5 ml di DMEM con 2% FCS e incubare a 37 °C e 5% CO2 per 16 ore. Lavare i tripomastigoti rimanenti rimuovendo il mezzo dal matraccio con una pipetta sterile da 5 ml, quindi aggiungere 5 mL di 1x PBS e aspirare. Infine, aggiungere 5 ml di DMEM con il 2% di FCS e incubare nelle stesse condizioni.
      2. Utilizzare i tripomastigoti che emergono dal monostrato cellulare Vero infetto per mantenere l'infezione in palloni T-25 con 2 × 105 cellule Vero in DMEM con FCS al 2%, generando una nuova bottiglia infetta ogni settimana.
        NOTA: Dopo 5-7 giorni, i tripomastiti iniziano ad emergere e sono visibili nel surnatante. Non aggiungere G418 ai tripomastigoti usati per infettare le cellule o le cellule infette, poiché la linea cellulare Vero non è resistente a G418.
    2. Preparare una sospensione di 1 × 105 cellule Vero/mL in DMEM integrata con 2% fcs e seme 100 μL della sospensione per pozzetto in piastre di coltura tissutale a 96 pozzetti (10.000 cellule per pozzetto). Incubare durante la notte (12-16 h) a 37 °C e 5% di CO2 per garantire l'aderenza cellulare al fondo dei pozzetti.
    3. Dopo l'incubazione notturna, sciacquare il monostrato cellulare Vero tre volte con 100 μL di PBS sterile 1x. Aggiungere T. cruzi Dm28c/pLacZ tripomastigotes (ottenuto da una precedente infezione in un pallone T-25, fase 2.2.1) ad un MOI di 10 su 100 μL di DMEM integrato con il 2% di FCS per pozzetto (100.000 tripomatigoti per pozzetto).
    4. Incubare le piastre per 6 ore a 37 °C e 5% di CO2. Dopo questo periodo di incubazione, lavare le piastre due volte con 1x PBS e aggiungere 100 μL di DMEM senza rosso fenolo integrato con il 2% di FCS.
      NOTA: Dopo 48 ore (2 giorni dopo l'infezione), gli amastigoti intracitoplasmatici sono visibili con un microscopio ottico. Il rosso fenolo, un indicatore di pH nel DMEM e in altri terreni di coltura cellulare, potrebbe interferire con la misurazione dell'assorbanza del CPRG. Se DMEM senza rosso fenolo non è disponibile, vedere le alternative menzionate di seguito al paragrafo 3.2.1.
  3. Preparazione di tripomastigote
    1. Preparare una sospensione di 1 × 106 cellule Vero/mL in DMEM integrata con 2% fcs e semina 800.000 cellule in 5 mL del mezzo in palloni T-25. Incubare durante la notte (12-16 h) a 37 °C e 5% di CO2 per garantire l'aderenza cellulare.
      NOTA: per un pallone T-75, il seme 2 × 106 celle in un volume finale di 15 ml.
    2. Dopo l'incubazione, risciacquare due volte con 3 ml di PBS sterile 1x. Aggiungere T. cruzi Dm28c/pLacZ tripomastigotes ad un MOI di 10 in 5 ml di DMEM con 2% DI FCS (8 × 106 tripomastiti per un pallone T-25).
      NOTA: Per un pallone T-75, aggiungere 20 × 106 tripomastiti in un volume finale di 15 ml di DMEM con il 2% di FCS.
    3. Incubare durante la notte (12-16 h) a 37 °C e 5% DI CO2. Lavare il matraccio due volte con 3 mL di 1x PBS e aggiungere 5 mL di DMEM fresco integrato con il 2% di FCS. Incubare a 37 °C e 5% CO2 per quattro giorni.
    4. Controllare il surnatante per i tripomastimiti al microscopio ottico. Quantificare i tripomastimiti contandoli in una camera neubauer. Raccogliere il surnatante in un tubo da 15 ml e centrifugare a 7.000 × g per 10 minuti a temperatura ambiente.
    5. Scartare il surnatante e risospesciare il pellet per ottenere una concentrazione di 1 × 106 tripomastigoti/mL in DMEM senza rosso fenolo integrato con 2% FCS. Semina 100 μL della sospensione di tripomastigote (100.000 tripomastiti per pozzetto) in una piastra da 96 pozzetti.
      NOTA: se DMEM senza rosso fenolo non è disponibile, vedere le alternative riportate di seguito al paragrafo 3.2.1.

3. saggio β-galattosidasi

NOTA: La quantificazione dell'attività della β-galattosidasi viene utilizzata come modo indiretto per determinare il numero di parassiti. Si prevede che la crescita sarà inibita in presenza di un composto tripanocida, portando ad un minor numero di parassiti rispetto al controllo non trattato, che si rifletterà in una minore attività β-galattosidasi e quindi in una minore assorbanza.

  1. Incubare i parassiti con BZN.
    1. Aggiungere 100 μL di corrispondente 2x soluzione di BZN per pozzetto per raggiungere una concentrazione finale di BZN di 80, 40, 20, 10, 5 e 2,5 μM a 100 μL di sospensione di epimastigote (dal passo 2.1), cellule Vero con amastigoti (2 giorni dopo l'infezione) (passo 2.2) o tripomatigoti (passo 2.3) in una piastra a 96 pozzetti.
    2. Incubare gli epimastigoti a 28 °C per 72 ore e i tripomastigoti o cellule Vero infette con amastigoti per 24 ore a 37 °C e 5% di CO2.
      NOTA: Ogni concentrazione di farmaco deve essere valutata almeno in triplice copia e includere colture di controllo di epimastigoti, tripomastigoti e cellule Vero infette con DMSO (vedere fase 1.2.2.4).
  2. Reazione colorimetrica
    1. Dopo il periodo di incubazione del trattamento, se le cellule Vero infette o tripomastimiti sono in DMEM con rosso fenolo, sostituire il mezzo con 100 μL di 1x PBS per evitare interferenze. Eseguire pozzetti vuoti triplicati contenenti solo 100 μL di mezzo corrispondente (o 1x PBS a seconda dei casi).
      NOTA: Non è necessario rimuovere il terreno di coltura per epimastigoti in caso di mezzo LIT o DMEM senza rosso fenolo. DMEM con rosso fenolo può ancora essere utilizzato; preparare un pozzetto vuoto con DMEM da solo per misurare l'assorbanza di base e quindi sottrarre questo valore durante l'analisi dei dati (passaggio 3.3.). Il mezzo insetto di Schneider, che è incolore, è un'alternativa per gli epimastigoti.
    2. Aggiungere 40 μL di soluzione di substrato CPRG e 10 μL di soluzione detergente a ciascun pozzetto, ottenendo una concentrazione finale di 200 μM CPRG e 0,1% detergente in un volume finale di 250 μL in ciascun pozzetto.
      NOTA: La soluzione CPRG e il detergente possono essere sommati in un volume finale di 50 μL per pozzetto.
    3. Incubare a 37 °C per 2 ore e misurare l'assorbanza a 595 nm in uno spettrofotometro a micropiastre.
      NOTA: il cambiamento di colore previsto è da giallo a bruno-rossastro al momento della scissione enzimatica β-galattosidasi (Figura 2A). Il tempo di incubazione può essere esteso fino a 4 ore e gli spettri di assorbanza del clorofenolo rosso possono essere letti tra 570 e 595 nm con raccordi di curva simili (Figura supplementare S1A,B). L'incubazione fino a 24 ore in presenza di substrato CPRG ha mostrato raccordi di curva simili (Figura supplementare S1C).
      1. In uno spettrofotometro a micropiastre con un selettore monocromatore, creare un nuovo protocollo nel software dell'apparecchiatura (Figura supplementare S2).
      2. Fare clic su Assorbanza come metodo di rilevamento | Endpoint come tipo di lettura | Ok (Figura supplementare S2A). Aggiungere un passaggio di lettura, digitare la lunghezza d'onda selezionata e fare clic su OK (Figura supplementare S2B).
      3. Nella sezione Layout piastra, contrassegnare i pozzetti da leggere e fare clic su Ok (Figura supplementare S2C). Per leggere la piastra, inseriscila nel vassoio e clicca su Leggi piastra. Attendere che i valori vengano visualizzati sullo schermo (Figura supplementare S2D) ed esportarli in un foglio di calcolo per analizzare i risultati.
  3. Analisi dei dati e calcolo della concentrazione di inibitori dei media (IC50)
    1. Sottrarre il valore misurato in bianco, corrispondente solo al mezzo LIT, 1x PBS o DMEM con o senza rosso fenolo più la soluzione detergente CPRG. Quando si testa l'attività tripanocida di composti colorati, misurare l'assorbanza di ulteriori controlli in bianco con LIT o DMEM con ogni concentrazione di farmaco utilizzato e quindi sottrarre tali valori dai valori di assorbanza ottenuti con i parassiti ad ogni concentrazione.
      NOTA: La tabella supplementare S2 mostra i valori tipici ottenuti in questo test con questi mezzi senza parassiti più soluzione detergente CPRG. Le differenze prima e dopo l'aggiunta di CPRG sono significative ma non interferiscono con il test con i parassiti (Tabella supplementare S2).
    2. Nel software di analisi statistica, tracciare la concentrazione di BZN (in μM) rispetto all'assorbanza a 595 nm in una tabella xy. Trasformare le concentrazioni di BZN in valori logaritmici facendo clic sul pulsante Analizza, selezionando l'opzione Trasforma | trasformare i valori x utilizzando l'opzione x= log(x) e facendo clic sul pulsante Ok.
    3. Ottenere i valori IC50 dal software di analisi statistica.
      NOTA: L'IC50 è definito come la concentrazione del farmaco che riduce la crescita del parassita del 50% rispetto al controllo non trattato ed è calcolato come il punto di inflessione della funzione sigmoidale che si adatta alla curva.
      1. Nel software di analisi statistica, fare clic sul pulsante Analizza , selezionare Regressione non lineare (adattamento curva) nell'elenco di analisi xy e fare clic su OK.
      2. Nella scheda modello della finestra Parametri , nel gruppo dose-risposta - inibizione delle equazioni incorporate, selezionare l'opzione metodo dose-risposta: log(inibitore) vs. risposta - Pendenza variabile (quattro parametri). Lasciare tutte le altre schede ai valori predefiniti; fare clic su OK.
      3. Clicca sulla sezione dei risultati del software di analisi statistica per trovare il valore IC50, la SD e la bontà della vestibilità.
      4. Fare clic sulla sezione del grafico per trovare il grafico xy della concentrazione logaritmica del farmaco rispetto ai valori di assorbanza . Cerca l'adattamento della curva è anche rappresentato graficamente in un colore diverso.
        NOTA: uno strumento di calcolo IC50 online gratuito è disponibile all'indirizzo https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator.

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Risultati

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Seguendo il protocollo sopra descritto, gli epimastigoti Dm28c che esprimono β galattosidasi sono stati incubati con 6 concentrazioni di BZN (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 μM) (o composti di interesse) per 72 ore. Dopo questo periodo, il reagente CPRG è stato aggiunto insieme al detergente, che lisa le cellule e rilascia β-galattosidasi. CpRG è scisso dalla β-galattosidasi per produrre clorofenolo rosso, portando ad un cambiamento di colore da giallo a rossastro (Figura 2A). Il rosso clorofenolo è ...

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Discussione

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Questo articolo descrive un test basato sulla determinazione dell'attività citoplasmatica β-galattosidasi rilasciata a causa della lisi di membrana di T. cruzi epimastigotes, tripomastigotes o cellule infette con amastigoti in presenza del substrato CPRG. Abbiamo usato i parassiti T. cruzi Dm28c/pLacZ, un ceppo parassitario stabile ottenuto dopo la trasfezione con un plasmide portatore di β-galattosidasi costruito da Buckner e co-autori10. Questo test è stato utilizzato per la ri...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da divulgare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo il Dr. Buckner per aver gentilmente fornito il plasmide pLacZ. Questo lavoro è stato sostenuto da Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva dall'Argentina (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) e Research Council United Kingdom [MR/P027989/1]. Servier Medical Art è stato utilizzato per produrre la Figura 1 (https://smart.servier.com).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pipetta
10 mL Pipetta sierologica sterileJet BiofilGSP211010
Pipetta sierologica da 5 mL sterileJet BiofilGSP010005
piastre a 96 pozzettiCorning3599
BenznidazoleSigma Aldrich419656N-Benzil-2-nitro-1H-imidazolo-1-acetammide
Biosafty CabinetTelstarBio II A/P
Provetta da centrifuga 15 mL sterile a fondo conicoTarson546021
Provetta da centrifuga 50 mL a fondo conico sterileTarson546041
CO2 IncubatoreSanyoMCO-15A
CPRGRoche10 884308001Clorofenolo Rosso-β- D-galattopiranoside
DMEM,di 12100046Thermo Fisher Cientific
DMSOSintorganSIN-061Dimetilsolfossido
Siero fetale di vitelloInternegocios SAFCS FRA 500Soluzione sterile e inattivata a caldo
sale di disolfato G418RocheG418-ROConcentrazione di base: 50 mg/mL
Glucosio D(+)Cicarelli716214
Cilindro graduatoNalgene3663-1000
HeminFrontier ScientificH651-9
KClCicarelli867212
Infusione di fegatoDifco226920
Provetta per microcentrifuga 1,5 mLTarson500010-N
Spettrofotometro per micropiastreBiotekSynergy HTX
Na2HPO4Cicarelli834214
NaClCicarelli750214
Camera NeubauerBoecoBOE 01
Nonidet P-40AntraceNIDP402-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenossi]etanolo
Prisma GraphpadSoftware di analisi statistica
Bicarbonato di sodioCicarelli929211NaHCO3
Sorvall ST 16 CentrifugaThermo Fisher Cientific75004380
Palloni T-25Corning430639
TriptosioMerck1106760500
celle VeroATCCCRL-1587
sierologica da 1 10005227 polvere ad alto glucosio di

Riferimenti

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  1. Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies. Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).
  2. Pérez-Molina, J. A., Molina, I. Chagas disease. The Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).
  3. World Health Organization & TDR Disease Reference Group on Chagas Disease, human African Trypanosomiasis and Leishmaniasis. Research priorities for Chagas disease, human African trypanosomiasis and leishmaniasis. World Health Organization. , Available from: https//apps.who.int/iris/handle/10665/77472 (2012).
  4. Messenger, L. A., Miles, M. A., Bern, C. Between a bug and a hard place: Trypanosoma cruzi genetic diversity and the clinical outcomes of Chagas disease. Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (8), 995-1029 (2015).
  5. Steverding, D. The history of Chagas disease. Parasites & Vectors. 7, 317(2014).
  6. Viotti, R., et al. Towards a paradigm shift in the treatment of chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (2), 635-639 (2014).
  7. Bern, C. Chagas’ Disease. The New England Journal of Medicine. 373 (19), 1882(2015).
  8. Drugs for Neglected Diseases Initiative. , Available from: https//dndi.org/diseases/chagas/ (2020).
  9. Bustamante, J. M., Tarleton, R. L. Methodological advances in drug discovery for Chagas disease. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (6), 653-661 (2011).
  10. Buckner, F. S., Verlinde, C. L., La Flamme, A. C., Van Voorhis, W. C. Efficient technique for screening drugs for activity against Trypanosoma cruzi using parasites expressing beta-galactosidase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 40 (11), 2592-2597 (1996).
  11. Vega, C., Rolón, M., Martínez-Fernández, A. R., Escario, J. A., Gómez-Barrio, A. A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase. Parasitology Research. 95 (4), 296-298 (2005).
  12. Bettiol, E., et al. Identification of three classes of heteroaromatic compounds with activity against intracellular Trypanosoma cruzi by chemical library screening. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (2), 384(2009).
  13. Gulin, J. E. N., et al. Optimization and biological validation of an in vitro assay using the transfected Dm28c/pLacZ Trypanosoma cruzi strain. Biology Methods and Protocols. 6 (1), 004(2021).
  14. da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., Dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732(2019).
  15. McFadden, D. C., Seeber, F., Boothroyd, J. C. Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).
  16. Moreno-Viguri, E., et al. In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).
  17. García, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry. ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).
  18. Vela, A., et al. In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269(2021).
  19. Alonso-Padilla, J., Rodríguez, A. High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259(2014).
  20. Martinez-Peinado, N., et al. Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity. Parasites & Vectors. 13 (1), 299(2020).
  21. Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764(2018).
  22. Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., Gómez-Barrio, A. Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes. Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).

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