Studio dalla progettazione all'implementazione per lo sviluppo e la convalida da parte del paziente della diagnostica cartacea dell'interruttore di attesa

RT-qPCR è rimasta la tecnologia gold standard per la diagnostica clinica grazie alla sua eccellente sensibilità e specificità. Sebbene altamente robusto, il metodo dipende da costose attrezzature e reagenti specializzati che richiedono una distribuzione e uno stoccaggio a temperatura controllata. Ciò presenta ostacoli significativi all'accessibilità di una diagnostica di qualità a livello globale, in particolare in tempi di epidemie e nelle regioni in cui l'accesso a laboratori ben attrezzati è limitato ^1,2. Ciò è stato osservato durante l'epidemia del virus Zika 2015/2016 in Brasile. Con solo cinque laboratori centralizzati disponibili per fornire test RT-qPCR, si sono verificati colli di bottiglia significativi, limitando l'accesso alla diagnostica. Ciò è stato particolarmente difficile per le persone in contesti periurbani, che sono stati più gravemente colpiti dall'epidemia ^3,4. Nel tentativo di migliorare l'accesso alla diagnostica, il protocollo mostra una piattaforma che è stata sviluppata con il potenziale per fornire diagnostica decentralizzata, a basso costo e ad alta capacità in ambienti con risorse limitate. Come parte di questo, è stata stabilita una pipeline di scoperta diagnostica, accoppiando sensori basati su amplificazione isoterma e RNA sintetico con sistemi di espressione senza cellule basati su carta ^5,6.

I sistemi di sintesi proteica priva di cellule (CFPS), in particolare i sistemi privi di cellule basati su E. coli, sono una piattaforma interessante per un'ampia gamma di applicazioni di biorilevamento, dal monitoraggio ambientale ^7,8 alla diagnostica dei patogeni 5,6,9,10,11,12 . Comprendendo i componenti necessari per la trascrizione e la traduzione, i sistemi CFPS presentano vantaggi significativi rispetto ai biosensori a cellule intere. In particolare, il rilevamento non è limitato da una parete cellulare e, in generale, sono modulari nel design, biosicuri, economici e possono essere liofilizzati per uso portatile. La capacità di liofilizzare le reazioni basate su circuiti genici su substrati come carta o tessuti, consente il trasporto, la conservazione a lungo termine a temperatura ambiente⁵ e persino l'incorporazione nella tecnologia indossabile¹³.

Lavori precedenti hanno dimostrato che i sistemi privi di cellule di E. coli possono essere utilizzati per rilevare numerosi analiti, ad esempio metalli tossici come il mercurio, antibiotici come la tetraciclina^7,14, sostanze chimiche che alterano il sistema endocrino^15,16, biomarcatori come l'acido ippurico 17, molecole quorum sensing associate ai patogeni ^9,18 e sostanze illecite come la cocaina 17 e il gamma idrossibutirrato (GHB)¹⁹ . Per la rilevazione specifica della sequenza degli acidi nucleici, le strategie si sono basate per la maggior parte sull'uso di biosensori basati su commutazione accoppiati a tecniche di amplificazione isotermica. Gli interruttori Toehold sono riboregolatori sintetici (chiamati anche semplicemente "interruttori" nel resto del testo) che contengono una struttura a forcina che blocca la traslazione a valle sequestrando il sito di legame ribosomiale (RBS) e il codone di partenza. Dopo l'interazione con il loro RNA trigger target, la struttura della forcina viene alleviata e la successiva traduzione di un frame di lettura aperto del reporter è abilitata²⁰.

L'amplificazione isoterma può anche essere utilizzata come diagnostica molecolare²¹; tuttavia, questi metodi sono soggetti ad amplificazione non specifica, che può ridurre la specificità e quindi l'accuratezza del test al di sotto di quella di RT-qPCR ²². Nel lavoro qui riportato, l'amplificazione isotermica a monte dei sensori basati su commutazione è stata utilizzata per fornire un'amplificazione del segnale combinata che consente il rilevamento clinicamente rilevante degli acidi nucleici (da femtomolare ad attomolare). Questa combinazione dei due metodi fornisce anche due punti di controllo specifici della sequenza che, in combinazione, forniscono un elevato livello di specificità. Utilizzando questo approccio, lavori precedenti hanno dimostrato la rilevazione di virus come Zika⁶, Ebola⁵, Norovirus 10, nonché batteri patogeni come C. difficile²³ e Typhoid¹² resistente agli antibiotici. Più recentemente, sono stati dimostrati interruttori di appoggio senza cellule per il rilevamento di SARS-CoV-2 nel tentativo di fornire una diagnostica accessibile per la pandemia COVID-19^11,12,13.

Il seguente protocollo delinea lo sviluppo e la convalida di un saggio sintetico senza cellule e basato su carta per il rilevamento del virus Zika, dalla progettazione di biosensori in silico , attraverso le fasi di assemblaggio e ottimizzazione, alla convalida sul campo con campioni di pazienti. Il protocollo inizia con la progettazione in silico di sensori basati su interruttore di RNA toehold e primer di amplificazione isotermica specifici per l'RNA virale Zika. Sebbene esistano numerosi metodi di amplificazione isoterma, qui è stato dimostrato l'uso dell'amplificazione basata sulla sequenza di acidi nucleici (NASBA) per aumentare la concentrazione di RNA virale bersaglio presente nella reazione, consentendo una sensibilità clinicamente significativa. In pratica, i metodi di amplificazione isotermica hanno il vantaggio di operare a temperatura costante, eliminando la necessità di attrezzature specializzate, come i termociclatori, che sono generalmente limitati a postazioni centralizzate.

Successivamente, viene descritto il processo di assemblaggio dei sensori sintetici toehold switch con sequenze di codifica reporter tramite sovrapposizione di estensione PCR e screening dei sensori sintetici toehold switch per prestazioni ottimali in sistemi privi di cellule utilizzando RNA sintetico. Per questo set di sensori del virus Zika, abbiamo selezionato il gene lacZ che codifica per l'enzima β-galattosidasi, che è in grado di scindere un substrato colorimetrico, il clorofenolo rosso-β-D-galattopiranoside (CPRG), per produrre un cambiamento di colore da giallo a viola che può essere rilevato ad occhio o con un lettore di piastre. Una volta identificati gli interruttori sintetici con le migliori prestazioni, viene descritto il processo per lo screening dei primer per l'amplificazione isotermica basata sulla sequenza di acidi nucleici della sequenza target corrispondente utilizzando RNA sintetico per trovare set che forniscono la migliore sensibilità.

Infine, le prestazioni della piattaforma diagnostica sono convalidate in loco in America Latina (Figura 1). Per determinare l'accuratezza diagnostica clinica, il test privo di cellule su carta viene eseguito utilizzando campioni di virus Zika da pazienti; in parallelo viene eseguito un test RT-qPCR gold standard per il confronto. Per monitorare i saggi colorimetrici senza cellule, consentiamo la quantificazione in loco dei risultati nelle regioni in cui i termociclatori non sono disponibili. Il lettore di piastre assemblato a mano denominato Portable, Low-Cost, User-friendly, Multimodal (PLUM; di seguito denominato lettore di piastre portatile) è anche introdotto qui²⁴. Inizialmente sviluppato come dispositivo complementare per la diagnostica dell'interruttore sintetico senza celle, il lettore di piastre portatile offre un modo accessibile per incubare e leggere i risultati in modo ad alto rendimento, fornendo agli utenti un'analisi software integrata basata sulla visione artificiale.

Figura 1: Flusso di lavoro per testare i campioni dei pazienti utilizzando reazioni di interruttore di presa senza cellule basate su carta. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. 

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani devono essere condotte in conformità con gli standard etici e le linee guida pertinenti, compresi i principi etici per la ricerca medica che coinvolge soggetti umani stabiliti dalla Dichiarazione dell'Associazione medica mondiale di Helsinki. Questo studio è stato approvato dal comitato etico per la ricerca umana con il numero di protocollo di licenza CAAE: 80247417.4.0000.5190. Il consenso informato di tutti i pazienti inclusi in questo studio è stato rinunciato dal Fiocruz-PE Institutional Review Board (IRB) per i campioni diagnostici.

NOTA: Il dispositivo PLUM sarà di seguito denominato "lettore di lastre portatile".

1. Progettazione computazionale di primer di amplificazione basati su sequenze di acidi nucleici

1. Scansiona il genoma di Zika per identificare un insieme di regioni candidate per l'amplificazione che sono circa 200 nucleotidi (nt) a 300 nt di lunghezza inserendo la sequenza genomica in NCBI / Nucleotide BLAST^25,26. Confrontare il genoma con le sequenze di RNA di riferimento (refseq_rna) e cercare siti che rimangono altamente conservati e non hanno omologia con il genoma umano (altri parametri BLAST rimangono invariati). Selezionare almeno due siti per progettare l'interruttore sintetico per l'appoggio a punta.
2. Utilizzare i criteri di selezione di Deiman et ^al.27 per generare coppie di primer di amplificazione basati sulla sequenza di acidi nucleici in avanti e indietro per ciascuna regione di amplificazione candidata. In breve, seguire questi criteri per la progettazione di primer: (1) contenuto GC tra il 40% e il 60%; (2) lunghezza compresa tra 20 e 24 nt con temperatura di fusione del DNA superiore a 41 °C; (3) nessuna corsa di quattro o più nucleotidi identici; (4) il nucleotide 3' finale è una base A; (5) bassa struttura secondaria del primer e probabilità di formazione del dimero. Schermo 8-10 coppie di primer per ogni regione target (consigliato).
3. Aggiungere la sequenza di prefissi contenente la sequenza del promotore T7 AATTCTAATACGACTCACTATAGGG AGAAGG(SEQUENZA DEL PROMOTORE T7 sottolineata) all'estremità 5' dei primer in avanti per consentire la trascrizione degli ampliconi usando la T7 RNA polimerasi (RNAP). Ordina i primer come oligo del DNA da una società di sintesi del DNA.

2. Progettazione computazionale degli interruttori a presa

1. Installare NUPACK²⁸ versione 3.2 (suite di progettazione di acidi nucleici) in base alle istruzioni sul sito Web²⁹. Utilizzare un sistema operativo UNIX e MATLAB (piattaforma di calcolo numerico) come linguaggio di programmazione (consigliato).
2. Identificare le sequenze target (ad esempio, il genoma virale) specifiche per il patogeno di interesse per i progetti dell'interruttore di presa come al punto 1.1. Scegliere le sequenze target Zika dagli ampliconi basati sulla sequenza di acidi nucleici generati nel passaggio 1.2.
   NOTA: In pratica, sia i primer di amplificazione basati sulla sequenza di acidi nucleici che gli interruttori sintetici possono essere progettati e testati per primi, a seconda delle esigenze degli utenti. Se sono già state stabilite particolari regioni target di interesse (ad esempio, da pubblicazioni o protocolli diagnostici esistenti), la progettazione e lo screening dell'interruttore toehold possono avvenire per primi, seguiti dalla progettazione e dallo screening per primer di amplificazione basati sulla sequenza di acidi nucleici. Se non ci sono regioni target stabilite, prima schermano i primer di amplificazione basati sulla sequenza di acidi nucleici rispetto all'intero genoma per restringere gli obiettivi di scelta mentre si seleziona l'efficienza di amplificazione del primer. Se sono disponibili più sequenze per il patogeno, è meglio progettare primer di amplificazione basati sulla sequenza di acidi nucleici che si concentrano su regioni altamente conservate (piuttosto che sullo screening dell'intero genoma).
3. Scarica e installa il software MATLAB richiesto sul computer.
4. Impostare le variabili di ambiente per consentire alle funzioni della suite di progettazione degli acidi nucleici di essere richiamate nel software. A tale scopo, aprire il software e quindi aprire (o creare) un file startup.m nella cartella di lavoro predefinita. Quindi, copiare le seguenti righe di codice nel file startup.m e, infine, aggiungere la cartella contenente i file binari della suite di progettazione di acidi nucleici al PATH:
   NUPACKINSTALL = '/Users/[user_name]/.../nupack3.2.2';
   setenv('NUPACKINSTALL',NUPACKINSTALL);
   setenv('PATH',[getenv('PATH'),sprintf(':%s/build/bin',NUPACKINSTALL)]);
5. Aprire il software della piattaforma di calcolo numerico e passare alla cartella del software di progettazione. Eseguire gli algoritmi di progettazione accessibili in https://github.com/AlexGreenLab/TSGEN.
6. Immettere le sequenze di destinazione nel design_input_file.csv che si trova nella sottocartella di input. Gli input includono Nome, Sequenza esterna, Sequenza interna, Temperatura, Nome output e Sequenza di output come definito nella Tabella 1. Se non sono ancora stati determinati siti di adescamento per il bersaglio, mantenere le sequenze interne ed esterne uguali. Solo i primi 29 nt del reporter saranno considerati durante il processo di progettazione. Al termine, salva e chiudi il foglio di calcolo aggiornato.
   NOTA: La sequenza di output è la sequenza della proteina reporter che si prevede di utilizzare per il test (ad esempio, lacZ). Specificando le sequenze interne ed esterne si assicura che l'algoritmo non generi interruttori sintetici che si sovrappongono a uno dei primer. Assicura inoltre che il test riconosca tre siti unici nel genoma di Zika per migliorarne la specificità.
7. Selezionare i parametri da utilizzare per la funzione di progettazione: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file, opzioni). Riempire i valori dei parametri come:
   1. num_designs - il numero di progetti migliori per ogni output di destinazione dal software. Il valore predefinito è 6 e può essere modificato secondo necessità (si consiglia un minimo di sei design per ogni target).
   2. input_file - questo parametro consente di specificare il nome del file che fornisce le informazioni sulla sequenza di input. Il valore predefinito è 'design_input_file.csv' e può essere modificato in base alle esigenze.
   3. Scegli tra le seguenti opzioni: (1) SeriesA e SeriesB: la versione (s) dell'interruttore toehold che il codice genererà. Impostare SeriesB su 1 e SeriesA su 0 per generare un interruttore di appoggio di serie B, che è il formato utilizzato nella diagnostica del virus Zika⁶; (2) Parallelo: impostato su 1 per sfruttare più core per calcolare i progetti; in caso contrario, impostare su 0; (3) Antisenso: impostato su 1 per generare interruttori di attesa che ibridano la sequenza antisenso (cioè il complemento inverso) dell'ingresso target; in caso contrario, impostare su 0.
8. Eseguire la funzione di progettazione utilizzando i parametri selezionati: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file,options). L'algoritmo inizierà quindi a generare i progetti di interruttore di appoggio per gli obiettivi di interesse.
9. Al termine del progetto, individuare le sequenze di progettazione dell'interruttore di attesa superiore e le sequenze di destinazione corrispondenti nella cartella final_designs sotto forma di fogli di calcolo in formato .csv. Le sequenze di DNA del toehold switch generate dall'algoritmo conterranno la sequenza del promotore T7 all'estremità 5' e la sequenza del linker 21 nt conservata AACCTGGCGGCAGCGCAAAAG all'estremità 3'.
10. Scherma le sequenze di progettazione dell'interruttore superiore risultanti contro altri virus comuni mettendole su NCBI-BLAST e controllando l'omologia della sequenza. Accetta sequenze con omologia pari o inferiore al 40%.
11. Ordina le sequenze di forcine dell'interruttore del piede come oligo di DNA e successivamente assemblali con il gene reporter in interruttori completamente funzionali. Ordinare i primer PCR necessari per il successivo assemblaggio del sensore a seconda della proteina reporter scelta.

Tabella 1: Definizione di ciascun parametro utilizzato nel software di progettazione di interruttori toehold.

3. Costruzione di interruttori di appoggio mediante PCR

NOTA: Questi passaggi descrivono la costruzione degli interruttori LacZ mediante estensione sovrapposta PCR. Qui, l'oligo del DNA viene utilizzato come primer in avanti e il terminatore T7 viene utilizzato come primer inverso. Usiamo il plasmide pCOLADuet-LacZ come modello per il gene lacZ (addgene: 75006). Qualsiasi altro modello di DNA che contiene la sequenza corrispondente può essere utilizzato come modello, a condizione che il terminatore T7 sia incluso nel costrutto finale.

1. Una volta ricevuti gli oligo di DNA sintetico dal fornitore commerciale, preparare soluzioni del DNA sintetico e primer di amplificazione inversa a una concentrazione di 10 μM in acqua priva di nucleasi. Assemblare le reazioni in provette PCR su ghiaccio secondo la Tabella 2.
   NOTA: i volumi PCR possono essere scalati in base alle esigenze. Utilizzare una quantità minima (0,1-1 ng) di modello di DNA pCOLADuet-LacZ per evitare la necessità di una fase aggiuntiva di rimozione del plasmide o di un segnale LacZ di fondo. Per quantità più elevate di modello di DNA, seguire la PCR con un digest enzimatico di restrizione DpnI per rimuovere il modello di plasmide residuo.
2. Collocare le reazioni in un termociclatore, seguendo le condizioni cicliche elencate nella Tabella 3. Analizzare i prodotti PCR su un gel di agarosio (Figura 2; vedere Protocollo supplementare e³⁰).
3. Purificare i prodotti PCR utilizzando un kit di purificazione PCR basato su colonna di spin ed eluire il DNA in 15-30 μL di acqua priva di nucleasi, secondo le istruzioni del produttore. Quantificare il DNA utilizzando uno spettrofotometro.

Tabella 2: I componenti PCR utilizzati per costruire gli interruttori di appoggio.

Tabella 3: Condizioni di ciclismo utilizzate durante la costruzione di interruttori di presa in punta mediante PCR.

4. Preparazione di bersagli di RNA sintetico (Trigger)

1. Utilizzando un software di progettazione di biologia molecolare, modificare i modelli di RNA trigger sintetico (selezionati nel passaggio 1.1) per includere una sequenza di promotori T7 a monte, assicurando che il modello completo rimanga breve (<200 bp). progettare primer avanti e indietro per amplificare il della sequenza di trigger (per le sequenze oligo vedere Protocollo supplementare).
2. Ordina le sequenze come oligo di DNA. Una volta ricevuto, ricostituire il DNA trigger sintetico e i primer di amplificazione a 10 μM in acqua priva di nucleasi. Assemblare le PCR corrispondenti in tubi a parete sottile su ghiaccio secondo la Tabella 2 e utilizzare 0,5 μL dell'ultramero del DNA trigger (concentrazione finale di 0,1 μM) come DNA modello.
3. Collocare le reazioni in un termociclatore e utilizzare le condizioni di ciclo elencate nella tabella 3. Utilizzare un tempo di estensione di 15 s. Valutare la qualità e purificare i prodotti trigger PCR come descritto nella fase 3.3 e nel protocollo supplementare.
   NOTA: Per accelerare il processo, i prodotti PCR trigger purificati con colonna possono anche essere utilizzati direttamente per lo screening iniziale dell'interruttore di appiglio.

5. Trascrizione in vitro di sequenze trigger selezionate

1. Assemblare i componenti di reazione sul ghiaccio secondo la Tabella 4.
2. Incubare le reazioni di trascrizione invitro (IVT) a 37 °C per 4 ore, seguite da un trattamento con DNasi I per rimuovere il DNA modello. Per la fase DNasi I, aggiungere 70 μL di acqua priva di nucleasi, 10 μL di tampone DNasi I 10x e 2 μL di DNasi I (senza RNasi) e incubare a 37 °C per 15 minuti. In caso contrario, disattivare immediatamente la DNasi I con l'aggiunta di 50 mM EDTA e l'inattivazione termica a 65 °C per 10 minuti.
3. Fase opzionale: eseguire l'elettroforesi su gel di poliacrilammide denaturante (ad esempio, urea-PAGE) sui prodotti IVT per valutare la qualità dell'RNA come descritto nel protocollo supplementare.
4. Purificare i prodotti IVT trigger utilizzando un kit di pulizia dell'RNA basato su colonna secondo le istruzioni del produttore, quindi quantificare la concentrazione e la purezza dell'RNA utilizzando la spettrofotometria. Vedere il protocollo supplementare per le istruzioni su come determinare la molarità e il numero di copie/μL dell'RNA.

Tabella 4: Trascrizione in vitro (IVT) di sequenze trigger selezionate.

6. Screening iniziale degli interruttori

NOTA: in questa sezione vengono descritti i passaggi associati all'impostazione delle reazioni dell'interruttore di presa a spunto senza celle e basate su carta e come eseguire lo screening degli interruttori di attesa ad alte prestazioni. La carta da filtro bloccata BSA utilizzata nella fase 6.10 deve essere preparata in anticipo come descritto nel protocollo complementare.

1. Preparare una soluzione madre di CPRG sciogliendo 25 mg della polvere in 1 mL di acqua priva di nucleasi. Conservare la soluzione sempre ghiacciata e conservare a -20 °C per un uso prolungato.
2. Determinare il numero di reazioni da configurare. Per ogni interruttore toehold valutato, includere un controllo no template (nessun interruttore e nessun RNA target, altrimenti noto come controllo da solo privo di cellule) per tenere conto di qualsiasi segnale di fondo che possa derivare dal master mix. Includere un controllo solo switch per valutare la perdita dell'interruttore di fondo o il tasso di OFF in assenza di RNA target.
3. Assemblare una miscela principale di reazione priva di cellule di soluzione A, soluzione B, inibitore della RNasi e CPRG su ghiaccio secondo il protocollo standard elencato nella Tabella 5.
   NOTA: i passaggi descritti qui si riferiscono a una miscela master che sarà sufficiente per un set triplice di reazioni da 1,8 μL con un volume aggiunto del 10% per tenere conto dell'errore di pipettaggio. Il volume del master mix deve essere regolato secondo necessità in base al numero di interruttori di attesa schermati.
4. Per ogni triplice reazione cellula-free, erogare la miscela master in un tubo PCR, mantenendo tutte le provette sul ghiaccio. Per il tubo messo da parte come controllo da solo privo di celle, aggiungere acqua priva di nucleasi ad un volume finale di 5,84 μL, mescolare mediante pipettaggio su e giù e centrifugare brevemente. Per il resto delle provette, aggiungere il DNA dell'interruttore di punta purificato con PCR a una concentrazione finale di 33 nM.
5. Per i tubi accantonati come comandi di sola interruttore, aggiungere acqua priva di nucleasi a un volume finale di 5,84 μL. Per le provette messe da parte per testare l'interruttore di appiglio e la combinazione di RNA bersaglio, aggiungere l'RNA bersaglio trascritto in vitro a una concentrazione finale di 1 μM. Quindi, aggiungere acqua priva di nucleasi a un volume finale di 5,84 μL. Mescolare accuratamente tutte le reazioni mediante pipettaggio su e giù e centrifugare brevemente.
6. Aggiungere 30 μL di acqua priva di nucleasi ai pozzetti che circondano i pozzi di reazione su una piastra nera a fondo chiaro a 384 pozzetti. Ciò riduce al minimo l'evaporazione nel corso dell'esperimento e migliora la riproducibilità.
   NOTA: se si utilizza il lettore di piastre portatile, posizionare una pellicola PCR sulla piastra e utilizzare un coltello di precisione per tagliare i pozzetti destinati alla reazione, nonché ciascuno dei quattro pozzetti angolari. La pellicola PCR impedisce la sovraesposizione della fotocamera del lettore di piastre portatile dai pozzetti vuoti.
7. Utilizzando un punzone per biopsia da 2 mm e una pinzetta, tagliare i dischi di carta da filtro bloccati da BSA e posizionarli nei pozzetti di reazione espellendo il punzone o usando una pinzetta (vedere Protocollo supplementare per la preparazione della carta da filtro bloccata BSA). Erogare volumi triplicati da 1,8 μL da ciascun tubo di reazione sui dischi di carta da filtro nella piastra a 384 pozzetti, mantenendo tutti i campioni, così come la piastra a 384 pozzetti, sul ghiaccio in ogni momento.
   NOTA: se si utilizza il lettore portatile di piastre, aggiungere 1,8 μL di CPRG (0,6 mg/ml) a ciascuno dei quattro angoli della piastra a 384 pozzetti. Il colore giallo del CPRG fornisce il riconoscimento del modello al lettore di piastre portatile per l'allineamento del modello digitale di piastre multipozzetto nell'analisi delle immagini. Coprire i pozzetti della piastra con pellicola PCR per evitare l'evaporazione.
8. Posizionare la piastra in un lettore di piastre, leggere OD₅₇₀ a 37 °C ogni minuto per 130 minuti.

Tabella 5: Componenti della reazione di trascrizione-traduzione senza cellule PURExpress.

7. Identificazione degli interruttori di appoggio ad alte prestazioni

NOTA: questa sezione descrive come analizzare i dati del passaggio 6 per selezionare gli interruttori di appoggio con le migliori prestazioni con cui procedere.

1. Iniziare l'analisi dei dati normalizzando prima l'assorbanza OD₅₇₀ in background. Per fare ciò, sottrarre le misurazioni OD 570 delle reazioni che non hanno alcun interruttore o RNA bersaglio (cioè pozzetti da sole prive di cellule) dalle altre misurazioni OD₅₇₀.
2. Uniformare i dati normalizzati utilizzando una media mobile a tre punti e regolare il valore minimo di ciascun pozzetto a zero. Vedere la Figura 3 per un esempio di dati normalizzati raccolti per gli interruttori 27B, 33B e 47B.
3. Utilizzando questi dati elaborati, calcolare il cambio di piega (o rapporto ON/OFF) determinando la differenza nella velocità di variazione del colore (cioè la variazione di OD₅₇₀ nel tempo) tra l'interruttore di attesa e il target e i pozzetti di commutazione da soli (vedi Protocollo supplementare per il calcolo del rapporto; Figura 4).
4. Selezionare gli interruttori con il più alto cambio di piegatura ON/OFF per un'ulteriore caratterizzazione. Omettere gli interruttori di presa a punta con prestazioni scadenti che visualizzano il cambio di piega più basso.

8. Screening e sensibilità del primer di amplificazione basato sulla sequenza di acidi nucleici

NOTA: Nei passaggi seguenti, prima viene eseguito uno screening per i primer di amplificazione isotermica funzionale, quindi la loro sensibilità viene valutata determinando il numero di copie di RNA bersaglio per μL di RNA sintetico che un dato interruttore di appoggio può rilevare in modo affidabile quando accoppiato con l'amplificazione isoterma. Dopo l'amplificazione isotermica, eseguire reazioni prive di cellule per identificare con successo i set di primer di amplificazione basati sulla sequenza di acidi nucleici. Tuttavia, potrebbe essere più conveniente eseguire gel di poliacrilammide o agarosio su reazioni di amplificazione basate sulla sequenza di acidi nucleici per restringere prima il pool di set di primer candidati. In tal caso, i set di primer di amplificazione basati sulla sequenza di acidi nucleici che generano una banda sul gel alla dimensione appropriata dell'amplicone possono essere selezionati per il successivo screening senza cellule.

1. Preparare una soluzione madre da 25 μM di tutti i primer avanti e indietro in acqua priva di nucleasi (vedere protocollo supplementare). Determinare il numero di reazioni di amplificazione basate sulla sequenza di acidi nucleici e successive reazioni prive di cellule che devono essere impostate. Ciò dipenderà dal numero di interruttori di appoggio e dai rispettivi set di primer.
   NOTA: quando si esaminano i primer, è importante includere sempre un controllo no template per ogni set di primer per tenere conto di eventuali artefatti di sfondo che possono sorgere a causa dell'amplificazione non specifica associata al primer.
2. Impostare una reazione da 5 μL come segue (scalarla secondo necessità). Scongelare tutti i reagenti sul ghiaccio. Assemblare una miscela principale di reazione del tampone di reazione, della miscela nucleotidica e dell'inibitore della RNasi secondo la Tabella 6. Mescolare accuratamente pipettando su e giù fino a quando il precipitato bianco è solubilizzato, quindi erogare aliquote in provette PCR.
   1. Se la miscela principale è per lo screening di primer di amplificazione basati su sequenze di acidi nucleici, escludere inizialmente i primer dalla miscela master (erogare 2,55 μL di miscela master). In caso contrario, se si esegue l'analisi di sensibilità del primer, i primer possono essere inclusi nella miscela master (nel qual caso erogare aliquote di 2,75 μL). Aggiungere la miscela enzimatica dopo le fasi di denaturazione ed equilibrio.
3. Se si esaminano primer di amplificazione basati su sequenze di acidi nucleici, aggiungere i primer avanti e indietro ai tubi appropriati. Su un termociclatore, impostare il protocollo di incubazione come descritto nella Tabella 7.
4. Aggiungere 1 μL di acqua priva di nucleasi o 1 μL di RNA trigger target a 2 pM o circa 10⁶ copie/μL, assicurandosi di etichettare le provette di conseguenza. Mescolare con un pipettaggio delicato e ruotare brevemente i tubi.
   NOTA: Per lo screening del primer set, utilizzare una concentrazione di RNA trigger target che sia abbastanza alta da non interferire con il limite inferiore di rilevazione del metodo di amplificazione isoterma, ma non abbastanza alta da fornire l'attivazione dell'interruttore di appiglio se non dovesse verificarsi alcuna amplificazione.
5. Spostare i tubi sul termociclatore e avviare l'incubazione. Dopo 12 minuti, rimuovere i tubi e aggiungere 1,25 μL della miscela enzimatica a ciascuna provetta. Mescolare pipettando su e giù e centrifugare brevemente i tubi.
   NOTA: A questo punto, i tubi possono essere mantenuti a temperatura ambiente; Tuttavia, la miscela enzimatica deve essere mantenuta su ghiaccio fino a quando non viene aggiunta alle provette.
6. Riportare i tubi al termociclatore, saltando la fase di mantenimento di 41 °C per avviare l'incubazione della reazione di 1 ora.
   NOTA: Dopo l'incubazione, le reazioni possono essere poste su ghiaccio per la lavorazione in giornata o congelate a -20 °C per la lavorazione successiva.
7. Seguire i passaggi 6.2-6.7 e la Tabella 8 per assemblare le reazioni dell'interruttore di presa senza cellule basate su carta per valutare le prestazioni del primer. Analizzare i dati come descritto nei passaggi 7.1-7.2 e nella Figura 3.
   NOTA: Oltre ai controlli precedentemente menzionati, è importante includere anche il controllo negativo per tenere conto di qualsiasi segnale di fondo che potrebbe derivare dalla reazione. Inoltre, è importante includere anche un controllo con l'interruttore e 2 pM (concentrazione finale) di RNA target, come controllo di amplificazione no-NASBA.
8. Identificare le coppie di primer candidate per andare avanti con l'analisi di sensibilità. Le coppie di primer vengono selezionate in base al fatto che l'attivazione dell'interruttore toehold avvenga dopo l'aggiunta della reazione incubata. Se necessario, ripetere la schermata di primer con altre combinazioni di primer.
9. Mantenendo i campioni di RNA sul ghiaccio in ogni momento, effettuare il seguente set di diluizione seriale di RNA bersaglio in acqua priva di nucleasi: 10⁴, 10³, 10 2, 10¹ e 10^{0 copie} di RNA / μL. Ripetere l'amplificazione basata sulla sequenza di acidi nucleici e le reazioni prive di cellule con i set di primer selezionati (fasi 8.2-8.7), testando la serie di diluizione seriale al fine di identificare i set di primer che forniscono la migliore sensibilità. Vedere la Figura 5 per un esempio di risultati per determinare la sensibilità del set di primer.
   NOTA: Idealmente, l'interruttore di appoggio selezionato e la coppia di primer dovrebbero rilevare un minimo di 1-100 copie di RNA target per μL di RNA (concentrazione della soluzione madre).
10. Ripetere l'esperimento di sensibilità all'amplificazione basato sulla sequenza di acidi nucleici in triplice triplice biologico. Questo passaggio serve a confermare la riproducibilità dei risultati prima di passare agli esperimenti con campioni di pazienti.
11. Opzionale: Per avere una fonte affidabile del DNA dello switch per l'uso a lungo termine e per il trasporto, clonare la sequenza o le sequenze selezionate in un plasmide utilizzando qualsiasi metodo di clonazione convenzionale. Allo stesso modo, la sequenza di RNA trigger target può anche essere clonata in un plasmide di scelta per la conservazione.

Tabella 6: Componenti della reazione NASBA.

Tabella 7: Condizioni di reazione per la NASBA.

Tabella 8: Componenti di reazione privi di cellule su carta.

9. Raccolta di campioni di pazienti ed estrazione di RNA virale

NOTA: Questa sezione descrive il protocollo per raccogliere campioni di pazienti ed estrarre l'RNA utilizzando un kit di purificazione dell'RNA. Il protocollo seguente viene utilizzato per ottenere siero dal sangue periferico. I campioni utilizzati in questo studio sono stati raccolti da pazienti che presentavano febbre, esantema, artralgia o altri sintomi correlati di infezione da arbovirus nello stato di Pernambuco, in Brasile.

1. Raccogliere campioni di sangue periferico da pazienti sospetti infetti da arbovirus. Eseguire la venipuntura (tubo di sangue intero) utilizzando una tecnica asettica standard. Etichettare le provette con un codice anonimo e la data di raccolta del campione.
2. Centrifugare il sangue per separare il siero a 2.300 x g per 10 minuti. Utilizzando una pipetta, preparare aliquote di siero (200 μL) che verranno utilizzate per l'estrazione dell'RNA in provette da 1,5 ml.
   NOTA: Se non è possibile eseguire l'estrazione dell'RNA poco dopo la raccolta del campione, i campioni di siero devono essere conservati a -80 °C prima delle applicazioni a valle.
3. Pipettare 560 μL di tampone AVL (tampone di lisi virale) preparato contenente l'RNA carrier in una provetta da 1,5 ml. Aggiungere 140 μL di siero alla miscela di RNA tampone AVL/carrier nella provetta. Miscelare mediante vortice di impulsi per 15 s.
4. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi centrifugare brevemente il campione per raccogliere il contenuto sul fondo della provetta. Aggiungere 560 μL di etanolo (96% -100%) al campione e mescolare mediante vortice di impulsi per 15 s. Dopo la miscelazione, centrifugare il campione per raccogliere il contenuto sul fondo della provetta.
5. Aggiungere con cautela 630 μL della soluzione dal punto 9.4 alla colonna di rotazione senza bagnare il bordo. Dopo questo passaggio, chiudere il tappo e centrifugare a 6.000 x g per 1 minuto. Posizionare la colonna di spin in un tubo di raccolta pulito da 2 mL ed eliminare il tubo di raccolta usato contenente il filtrato.
6. Aprire con attenzione la colonna di rotazione e ripetere il passaggio 9.5. Aprire con attenzione la colonna di rotazione e aggiungere 500 μL di tampone AW1 (tampone di lavaggio 1). Chiudere il tappo e centrifugare a 6.000 x g per 1 minuto. Posizionare la colonna di spin in un tubo di raccolta pulito da 2 mL ed eliminare il tubo di raccolta usato contenente il filtrato.
7. Aprire con attenzione la colonna di rotazione e aggiungere 500 μL di tampone AW2 (tampone di lavaggio 2). Chiudere il tappo e centrifugare a 20.000 x g per 3 minuti. Posizionare la colonna di spin in una provetta di raccolta pulita da 2 ml ed eliminare la provetta di raccolta usata contenente il filtrato.
8. Per evitare la contaminazione da tampone residuo AW2, che potrebbe causare problemi nelle reazioni enzimatiche a valle, posizionare la colonna di spin in una provetta di raccolta pulita da 2 mL e scartare la provetta di raccolta utilizzata con il filtrato. Centrifugare a 20.000 x g per 1 min.
9. Posizionare la colonna di spin in un tubo pulito da 1,5 mL e gettare il tubo di raccolta usato con il filtrato. Aprire con attenzione la colonna di rotazione e aggiungere 60 μL di Buffer AVE (buffer di eluizione) equilibrato a temperatura ambiente. Seguendo questo passaggio, chiudere il tappo e incubare a temperatura ambiente per 1 minuto.
10. Centrifugare a 6.000 x g per 1 min. L'RNA eluito può quindi essere utilizzato come input per NASBA e RT-qPCR in parallelo.
11. Seguire i passaggi da 8.3 a 8.11 per eseguire l'amplificazione basata sulla sequenza di acidi nucleici e le reazioni prive di cellule basate su carta utilizzando 1 μL di RNA del paziente estratto, assicurandosi di includere reazioni di controllo negative e positive. Dopo le reazioni, preparare la piastra di reazione a 384 pozzetti ed eseguire il test nel lettore portatile di piastre a 37 °C (vedere i dettagli nel protocollo supplementare).
    NOTA: Due concentrazioni di RNA di 10⁴ e 10² PFU / ml, estratte dal virus Zika in coltura sono utilizzate come controlli positivi per tutti gli esperimenti durante la convalida clinica. Oltre ai controlli precedentemente menzionati, è importante includere anche il trigger (10 ng/μL) come controllo positivo.
12. Alla fine di ogni esperimento, i dati grezzi (file .csv) dal lettore di lastre prtable possono essere caricati su un database sicuro online. Inoltre, il lettore di piastre portatile genera un rapporto che indica se i campioni sono positivi o negativi per il virus Zika (Figura 6); vedere la sezione dei risultati rappresentativi per esempi di tutti i grafici ottenuti durante l'incubazione (Figura 7).
    NOTA: gli utenti possono anche trasferire file dal lettore di piastre portatile al proprio computer tramite USB.

10. Dispositivo portatile di lettura di piastre

1. Il lettore portatile di targhe (figura 8) può essere utilizzato come alternativa a un lettore di targhe convenzionale²⁴. Per il protocollo e i risultati rappresentativi, vedere Protocollo supplementare.

11. RT-qPCR per il rilevamento del virus Zika

NOTA: questa sezione descrive i passaggi per eseguire la RT-qPCR per il rilevamento del virus Zika da campioni di pazienti (vedere Protocollo supplementare).

1. Per evitare la contaminazione, assemblare i componenti RT-qPCR in un'area isolata dal processo di amplificazione (ad esempio, clean-hood). Posizionare il tampone RT-qPCR, gli enzimi e il primer/sonde sul ghiaccio o su un blocco freddo. Successivamente, aggiungere le reazioni a una piastra da 384 pozzetti sul ghiaccio secondo la Tabella 9.
   NOTA: Il controllo negativo (controllo di estrazione e controllo non modello [NTC]) e il controllo positivo (10⁴ PFU / ml) sono raccomandati per tutti gli esperimenti.
2. Dopo aver aggiunto i reagenti a una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml, mescolare la reazione mediante pipettaggio su e giù (non vortice) ed erogare 6,5 μL in ciascun pozzetto. Aggiungere 3,5 μL di ogni modello di RNA in triplice copia.
3. Posizionare un film PCR sulla parte superiore della piastra. Centrifugare la piastra a 384 pozzetti a 600 x g per 2 minuti.
4. Posizionare la piastra in una macchina RT-qPCR utilizzando le seguenti condizioni di ciclo descritte nella Tabella 10. Per analizzare i risultati, utilizzare il software di progettazione e analisi della macchina RT-qPCR e considerare la soglia automatica e la linea di base (vedere i dettagli nel protocollo supplementare).

Tabella 9: Componenti RT-qPCR per amplificare l'RNA del virus Zika basato sul protocollo Centers for Disease Control and Prevention-CDC USA per rilevare il virus Zika da campioni di pazienti³¹.

Tabella 10: Condizioni ciclistiche per RT-qPCR.

Seguendo la pipeline di progettazione computazionale, la costruzione di tre interruttori di attesa è stata eseguita mediante PCR. I prodotti PCR sono stati analizzati utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio (Figura 2). La presenza di una banda chiara di circa 3.000 bp, all'incirca la dimensione del gene lacZ accoppiato a un interruttore di appiglio, indica tipicamente una reazione riuscita. In alternativa, una corsia senza banda, bande multiple o una banda di dimensioni errate, indica una PCR fallita. In caso di PCR fallita, le condizioni di reazione e/o le sequenze di primer devono essere ottimizzate.

Gli interruttori di appoggio assemblati sono stati sottoposti a screening per valutare ciascun sensore rispetto al rispettivo RNA trigger trascritto in vitro (Figura 3). Mentre tutti e tre i sensori mostravano un aumento dell'assorbanza OD570, lo switch 27B (Figura 3A) aveva la velocità di accensione più rapida. Gli interruttori 33B e, in misura minore, 47B hanno mostrato un aumento dell'assorbanza OD570 in assenza di RNA trigger target, indicando che questi interruttori possiedono una certa attività di fondo o perdita (Figura 3B, C), una caratteristica non voluta in un sensore candidato in quanto può ridurre la specificità. Per identificare più chiaramente il sensore con il rapporto segnale ON/OFF più elevato, è stata calcolata la variazione di piega dell'assorbanza OD570 (vedere la sezione 5 delle informazioni supplementari) e tracciata (Figura 4). Da questa analisi, è chiaro che l'interruttore 27B è il sensore che ha le migliori prestazioni con un rapporto ON / OFF di circa 60.

La sensibilità del toehold switch più performante (27B) è stata quindi valutata determinando la più bassa concentrazione di RNA richiesta per attivare il toehold switch quando accoppiato con una reazione NASBA. Il grafico illustra che i sensori Zika più performanti possono rilevare l'RNA a concentrazioni fino a 1,24 molecole per μL (equivalenti a ~ 2 aM; Figura 5).

Dopo che lo switch 27B è stato identificato e convalidato, i materiali dei sensori sono stati distribuiti ai membri del team a Recife, nello stato brasiliano di Pernambuco. In Brasile, l'accuratezza diagnostica clinica della piattaforma diagnostica del virus Zika è stata valutata utilizzando campioni di pazienti con virus Zika, in parallelo con RT-qPCR per il confronto. Per convalidare la piattaforma diagnostica Zika basata su carta, è stato utilizzato il lettore di piastre portatile, che è in grado di incubare e leggere l'output colorimetrico dei sensori basati su carta. Il cambiamento di colore da giallo a viola viene utilizzato per identificare un campione positivo, mentre un campione negativo rimane giallo (Figura 6). Un'opzione aggiuntiva per visualizzare i risultati generati dal lettore di piastre portatile (Figura 8) consiste nel tracciare la risposta colorimetrica per ciascuna reazione cartacea nel tempo. I campioni sono stati testati in triplice copia e quelli che hanno superato la soglia (linea rossa impostata a 1) sono stati considerati positivi, mentre i campioni al di sotto della soglia sono stati considerati negativi (Figura 6 e Figura 7).

Infine, per valutare e confrontare le prestazioni cliniche del sensore Zika toehold switch con l'attuale metodo gold standard per diagnosticare l'infezione da virus Zika, tutti i campioni di pazienti sono stati testati in parallelo con RT-qPCR. Il grafico di amplificazione di due campioni rappresentativi di pazienti è stato testato in triplice copia per la rilevazione del virus Zika mediante RT-qPCR (Figura 9). I campioni sono considerati positivi quando il valore della soglia del ciclo (Ct) è ≤38; la linea rossa indica un campione positivo e la linea blu indica un campione negativo per il virus Zika.

Figura 2: Elettroforesi su gel di agarosio per valutare la qualità dei prodotti PCR. I prodotti PCR vengono analizzati su un gel di agarosio all'1% in 1X TAE, eseguito a 80 V per 90 minuti. Una singola banda chiara indica in genere una reazione di successo. Corsia 1: 1 kb scala del DNA; Corsie 2-4: 27B commutano DNA, 33B trigger DNA e 47B trigger DNA, rispettivamente. I numeri sul lato sinistro rappresentano la dimensione della banda in bp. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Prototipazione di tre interruttori toehold per sensori Zika basati su carta. Le prestazioni di tre sensori toehold switch a RNA basati su carta sono state misurate a 37 °C per oltre 130 minuti. Ogni grafico contiene due tracce, una rappresenta il controllo solo switch, mentre l'altra rappresenta l'interruttore e il trigger. I tre grafici rappresentano i dati acquisiti utilizzando i sensori toehold switch 27B (A), 33B (B) e 47B (C). Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media (SEM) di tre repliche. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: I sensori più performanti sono identificati calcolando la variazione di piega dell'assorbanza a 570 nm. Il cambio di piega (o rapporto ON/OFF massimo) viene calcolato misurando il rapporto di assorbanza (OD570) a 130 minuti tra il controllo solo dell'interruttore e il test CFPS interruttore più trigger. Le barre di errore rappresentano SEM da tre repliche. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Valutazione della sensibilità dell'interruttore più performante. L'RNA Zika trascritto in vitro viene titolato in reazioni NASBA. Dopo un'incubazione di 1 ora, le reazioni sono state aggiunte alle reazioni PURExpress prive di cellule su dischi di carta con un rapporto di 1:7. Viene tracciato il cambio di piega dopo 130 minuti a 37 °C. Questa cifra è stata riprodotta da24. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Pagina di acquisizione del lettore di lastre portatile caricata con i dati delle immagini acquisite. Questa figura mostra un'immagine di esempio dell'immagine finale acquisita dal lettore di targhe portatile durante un'esecuzione di raccolta dati. Il timbro data/ora originale è visibile nella parte superiore dell'immagine. Il colore giallo indica reazioni di controllo o negative e il colore viola indica una reazione positiva. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 7: Modalità di analisi dei dati. A sinistra, gli utenti selezionano i set di dati che desiderano tracciare; I grafici vengono quindi visualizzati sulla destra con colori univoci per ogni campione o set di controlli. La linea rossa tratteggiata funge da soglia per determinare i campioni positivi e negativi. I campioni testati in triplice copia che superano la soglia sono considerati positivi, mentre i campioni al di sotto della soglia sono considerati negativi. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard (SD) da tre repliche. Ctrl da 1 a Ctrl 5 indica i controlli. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 8. PLUM, un lettore di piastre portatile. Questo lettore di piastre portatile funge da lab-in-a-box e funge da lettore di piastre a temperatura controllata per incubare e monitorare le reazioni colorimetriche. Questo dispositivo portatile è in grado di fornire misurazioni quantitative e ad alta produttività dei sensori Zika basati su carta in loco. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 9: Grafico RT-qPCR dell'amplificazione di due campioni di pazienti testati in triplice copia per la rilevazione del virus Zika. I campioni sono considerati positivi quando il valore della soglia del ciclo (Ct) è ≤38. La linea rossa tratteggiata serve come soglia per determinare campioni positivi e negativi. La traccia rossa indica un campione positivo e la traccia blu indica un campione negativo. Il valore ΔRn (delta Rn) rappresenta la grandezza normalizzata del segnale di fluorescenza rilevato dallo strumento RT-qPCR per tutti i campioni testati. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Cifre supplementari. Clicca qui per scaricare queste figure. 

K.P. e A.A.G. sono co-inventori di tecnologie relative ai sensori di presa basati su carta. Y.G., S.C. e K.P. sono co-fondatori di LSK Technologies, Inc. e sono co-inventori delle tecnologie relative a PLUM. M.K., K.P. e A.A.G. sono co-fondatori di En Carta Diagnostics Ltd. Altri autori non hanno conflitti di interesse. Brevetti: Dispositivo PLUM: Y.G., S.C. e la domanda di brevetto K.P. sono stati depositati dall'Università di Toronto e assegnati a LSK Technologies Inc. U. S. Provisional Patent Application No. 62/982,323 depositato il 27 febbraio 2020; Brevetto Toehold switch: A.A.G., P.Y., e J.J. C. "Riboregulator compositions and methods of use", Brevetto. WO2014074648A3 depositato il 6 novembre 2012; Brevetto diagnostico cartaceo: K.P. e J.J.C. "Paper-based synthetic gene networks" U.S. patent pending No. US15/963.831 depositato il 6 dicembre 2013; Brevetto Zika 1: K.P., A.A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. e J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform", U. S. Provisional Patent Application No. 62/403,778 depositato il 4 ottobre 2016; Brevetto Zika 2: K.P., A. A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. e J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform", U. S. Provisional Patent Application No. 62/341,221 depositato il 25 maggio 2016.