I saggi ACT1-CUP1 determinano le sensibilità specifiche del substrato dei mutanti spliceosomi nel lievito in erba

Sommario

Il test ACT1-CUP1, un saggio di crescita del rame, fornisce una rapida lettura dello splicing dell'RNA messaggero precursore (pre-mRNA) e dell'impatto che i fattori di splicing mutante hanno sulla funzione spliceosomale. Questo studio fornisce un protocollo ed evidenzia la personalizzazione possibile per affrontare la questione di splicing di interesse.

Abstract

Le mutazioni introdotte nello spliceosoma o nel suo substrato hanno contribuito in modo significativo alla nostra comprensione della complessità della funzione spliceosomiale. Che siano correlate alla malattia o funzionalmente selezionate, molte di queste mutazioni sono state studiate utilizzando saggi di crescita nell'organismo modello Saccharomyces cerevisiae (lievito). Il saggio di crescita del rame specifico per lo splicing, o test ACT1-CUP1, fornisce un'analisi completa della mutazione a livello fenotipico. Il test ACT1-CUP1 utilizza reporter che conferiscono tolleranza al rame quando giuntati correttamente. Pertanto, in presenza di rame, i cambiamenti nella vitalità del lievito sono correlati ai cambiamenti nella produzione di mRNA attraverso lo splicing. In un tipico esperimento, lo spliceosoma del lievito viene sfidato con diversi reporter di splicing non consensuali e la mutazione del fattore di splicing di interesse per rilevare qualsiasi impatto sinergico o antitetico sullo splicing. Qui viene fornita una descrizione completa della preparazione della piastra di rame, della placcatura delle cellule di lievito e della valutazione dei dati. Viene descritta una selezione di esperimenti complementari, evidenziando la versatilità dei reporter ACT1-CUP1. Il test ACT1-CUP1 è uno strumento utile nella cassetta degli attrezzi di splicing grazie alla lettura diretta degli effetti mutazionali e alle possibilità comparative derivanti dall'uso continuo sul campo.

Introduzione

Lo spliceosoma è una grande macchina biologica che catalizza la rimozione degli introni, regioni non codificanti nell'RNA messaggero precursore (pre-mRNA)^1,2. Caratterizzare l'effetto di un mutante a singolo punto in 1 delle quasi 100 proteine e 5 RNA non codificanti è spesso ambiguo quando si studia la proteina o l'RNA in isolamento. Il cambiamento nella funzione del componente mutato può essere valutato meglio in vivo nel contesto dello spliceosoma completo e funzionante.

Il saggio di crescita del rame qui descritto è un rapido indicatore dell'efficienza di splicing in

Protocollo

1. Costruzione del ceppo di lievito

1. Generare o ottenere un ceppo di S. cerevisiae il cui background include leu2 e cup1Δ. Per generare questo background, utilizzare il metodo del lievito ben consolidato che impiega acetato di litio e DNA a singolo filamento³⁹.
   NOTA: I ceppi di lievito aploidi possono contenere una, due o più copie di CUP1 ^6,38. Fare riferimento alle informazioni genomiche per il ceppo di lievito selezionato quando si progettano primer knock-out per affiancare la posizione del gene CUP1.

Risultati

I saggi di crescita, come ACT1-CUP1, richiedono la valutazione visiva e comparativa di più colonie. Qui, ogni ceppo è stato coltivato fino alla saturazione durante la notte, diluito a un OD₆₀₀ di 0,5 e placcato su 20 piastre contenenti un intervallo di concentrazioni di rame da 0 mM a 1,1 mM CuSO₄ (Figura 3). Questo intervallo è inferiore a quello elencato nel protocollo in quanto ha consentito la valutazione completa dell'impatto dei QSP e dei reporter ACT1-CUP1 utiliz.......

Discussione

ACT1-CUP1 è un test di crescita e occorre prestare attenzione per garantire che le differenze di crescita osservate possano essere attribuite solo a difetti di splicing. Tutti i ceppi devono essere manipolati in modo simile prima della placcatura, compresa la lunghezza e il tipo di crescita e condizioni di conservazione simili. Se si utilizzano ceppi sensibili alla temperatura, i saggi ACT1-CUP1 devono essere eseguiti solo in condizioni in cui tali ceppi crescono in modo comparabile al tipo selvatico. In relazione a ciò,.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette sterili per microcentrifuga da 1,5 mL	Fisher Scientific	05-408-129	O prodotto comparabile di un produttore diverso.
Provette sterili per microcentrifuga da 2 mL	Fisher Scientific	05-408-138	O articolo comparabile di un produttore diverso.
Provette da centrifuga sterili da 50 mL	Fisher Scientific	07-201-332	O prodotto comparabile di un produttore diverso.
Micropiastra a fondo tondo a 96 pozzetti	Fisher Scientific	07-200-760	O articolo comparabile di un produttore diverso.
Etanolo a 190 prove	Fisher Scientific	22-032-600	O articolo comparabile di un produttore diverso.
Sistema di filtraggio da 500 mL (0,22 & micro; m)	CellTreat Scientific Products	229707	O un articolo comparabile di un produttore diverso.
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500	Qualsiasi agar di grado molecolare funzionerà.
Autoclave	Tuttnauer	3870EA	O articolo comparabile di un produttore diverso.
Bruciatore Bunsen	Humboldt	PN6200.1	O articolo comparabile di un produttore diverso.
Densimetro di celle	VWR	490005-906	O altro dispositivo spettrale in grado di misurare l'assorbanza a 595 nm.
Solfato di rame pentaidrato	Fisher Scientific	LC134051	O articolo comparabile di un produttore diverso.
Sistema di imaging digitale	Cytiva	29399481	ImageQuant 4000 (utilizzato per la Figura 3),  Amersham ImageQuant 800 o un prodotto comparabile di un altro produttore.
Miscela di dropout (-Leu)	USBiological Life Sciences	D9525	Utilizzare la miscela di dropout appropriata per l'esperimento. È possibile che utilizzerai anche un marcatore nutritivo del lievito per la tua perturbazione della query. In tal caso, la miscela di esclusione dovrebbe essere per quel marcatore e Leu
D-Glucosio	Fisher Scientific	AAA1682836	O un articolo comparabile di un produttore diverso.
Software di quantificazione della banda gel	Cytiva	29-0006-05	ImageQuant TL v8.1 (utilizzato per la figura 5A) o articolo comparabile di un produttore diverso.
Fotocamera portatile	Nikon	D3500	O articolo comparabile di un produttore diverso.
Dispositivo di imaging su gel nel vicino infrarosso	Cytiva	29238583	Amersham Typhoon NIR (utilizzato per la Figura 5a) o articolo simile di un produttore diverso.
Morsetto da laboratorio	Fisher Scientific	05-769-7Q	O articolo comparabile di un altro produttore.
Supporto e morsetto da laboratorio	Fisher Scientific	12-000-101	O articolo comparabile di un produttore diverso.
Ancorette magnetiche	Fisher Scientific	14-513-51	O un prodotto comparabile di un produttore diverso.
Replicatore a spillo	VP Scientific	VP 407AH
Cuvette monouso semi-micro	VWR	97000-590	O articolo comparabile di un produttore diverso.
Agitatore	JEIO Tech	IST-3075	O articolo comparabile di un produttore diverso.
Spettrofotometro	Biowave	80-3000-45	O qualsiasi spettrofotometro in grado di misurare l'assorbanza a 600 nm.
Piastre quadrate	VWR	102091-156	Possono essere utilizzate anche piastre circolari, anche se sono più impegnative se si utilizza un replicatore a spillo.
Piastra di agitazione	Fisher Scientific	11-520-16S	O articolo comparabile di un produttore diverso.
Lievito a base di azoto	USBiological Life Sciences	Y2025	O articolo comparabile di un produttore diverso.