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Articolo metodologico

I saggi ACT1-CUP1 determinano le sensibilità specifiche del substrato dei mutanti spliceosomi nel lievito in erba

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DOI:

10.3791/63232

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30 giugno 2022

1College of Arts and Sciences, Northwest University

In questo articolo

Sommario

Il test ACT1-CUP1, un saggio di crescita del rame, fornisce una rapida lettura dello splicing dell'RNA messaggero precursore (pre-mRNA) e dell'impatto che i fattori di splicing mutante hanno sulla funzione spliceosomale. Questo studio fornisce un protocollo ed evidenzia la personalizzazione possibile per affrontare la questione di splicing di interesse.

Abstract

Le mutazioni introdotte nello spliceosoma o nel suo substrato hanno contribuito in modo significativo alla nostra comprensione della complessità della funzione spliceosomiale. Che siano correlate alla malattia o funzionalmente selezionate, molte di queste mutazioni sono state studiate utilizzando saggi di crescita nell'organismo modello Saccharomyces cerevisiae (lievito). Il saggio di crescita del rame specifico per lo splicing, o test ACT1-CUP1, fornisce un'analisi completa della mutazione a livello fenotipico. Il test ACT1-CUP1 utilizza reporter che conferiscono tolleranza al rame quando giuntati correttamente. Pertanto, in presenza di rame, i cambiamenti nella vitalità del lievito sono correlati ai cambiamenti nella produzione di mRNA attraverso lo splicing. In un tipico esperimento, lo spliceosoma del lievito viene sfidato con diversi reporter di splicing non consensuali e la mutazione del fattore di splicing di interesse per rilevare qualsiasi impatto sinergico o antitetico sullo splicing. Qui viene fornita una descrizione completa della preparazione della piastra di rame, della placcatura delle cellule di lievito e della valutazione dei dati. Viene descritta una selezione di esperimenti complementari, evidenziando la versatilità dei reporter ACT1-CUP1. Il test ACT1-CUP1 è uno strumento utile nella cassetta degli attrezzi di splicing grazie alla lettura diretta degli effetti mutazionali e alle possibilità comparative derivanti dall'uso continuo sul campo.

Introduzione

Lo spliceosoma è una grande macchina biologica che catalizza la rimozione degli introni, regioni non codificanti nell'RNA messaggero precursore (pre-mRNA)1,2. Caratterizzare l'effetto di un mutante a singolo punto in 1 delle quasi 100 proteine e 5 RNA non codificanti è spesso ambiguo quando si studia la proteina o l'RNA in isolamento. Il cambiamento nella funzione del componente mutato può essere valutato meglio in vivo nel contesto dello spliceosoma completo e funzionante.

Il saggio di crescita del rame qui descritto è un rapido indicatore dell'efficienza di splicing in Saccharomyces cerevisiae o lievito in erba. Sviluppato da C.F. Lesser e C. Guthrie e pubblicato nel 1993, questo test combina la facilità di lavoro con un semplice organismo modello e la lettura diretta della vitalità cellulare3. La vitalità è correlata al modo in cui gli spliceosomi in queste cellule possono riconoscere e unire la trascrizione del reporter.

Questo saggio di crescita del rame è più comunemente chiamato test ACT1-CUP1. Il nome ACT1-CUP1 deriva dai due geni fusi per creare un reporter di efficienza di splicing. ACT1 è il gene dell'actina del lievito, che è altamente espresso e ha unintrone 4,5 efficientemente giuntato. Cup1p è un chelante del rame che sequestra il rame nella cellula per prevenire interferenze con le normali funzioni cellulari 6,7,8. Il reporter ACT1-CUP1 contiene questi geni in sequenza tale che CUP1 è nel frame di lettura corretto solo se si verifica lo splicing pre-mRNA dell'introne di ACT1 (Figura 1). La proteina di fusione risultante contiene i primi 21 aminoacidi di actina e la proteina Cup1p a lunghezza intera, che aumenta la vitalità del lievito in un ambiente ricco di rame3. Pertanto, un aumento della quantità di giunzione del reporter si traduce in una maggiore concentrazione di Cup1p e una maggiore resistenza al rame (Figura 1). Rispetto ad altri geni reporter, CUP1 influisce sulla vitalità cellulare anche a bassi livelli, ha un ampio intervallo di sensibilità e può essere utilizzato per selezionare direttamente le mutazioni di splicing 3,6,7. Inoltre, CUP1 non è essenziale per la crescita standard del lievito, e quindi l'omeostasi cellulare non è influenzata durante la configurazione di questo test. Complementare ai saggi di delezione o crescita della temperatura, ACT1-CUP1 fornisce informazioni sugli effetti sullo splicing in condizioni di crescita del lievito altrimenti ottimali.

Lo spliceosoma riconosce il suo substrato attraverso tre sequenze introniche, vale a dire il sito di giunzione 5' (5' SS), il sito di diramazione (BS) e il sito di giunzione 3' (3' SS). Sono stati generati numerosi reporter ACT1-CUP1 contenenti sequenze non consensuali in questi siti. Una selezione dei reporter ACT1-CUP1 più comuni è mostrata nella Figura 1 e nella Tabella 1. Poiché lo spliceosoma interagisce con ciascun sito di giunzione in modo univoco in diversi punti del ciclo di giunzione, la robustezza dello spliceosoma può essere testata in diversi passaggi in base ai quali viene utilizzato il reporter non consensuale. I giornalisti non di consenso sono chiamati per la posizione mutata all'interno dell'introne e la base in cui è stato mutato. Ad esempio, A3c è un reporter con una mutazione al 5' SS, in particolare posizione 3 dall'adenosina di consenso a una citosina. Questo reporter interagirà fortemente con le mutazioni degli spliceosomi che influenzano la selezione e l'uso di 5' SS. Nel loro studio iniziale, Lesser e Guthrie hanno determinato quali mutazioni 5' SS hanno inibito lo splicing3. Più tardi, nello stesso anno, Burgess e Guthrie pubblicarono rapporti non consensuali in tutti e tre i siti di giunzione in uno schermo soppressore delle mutazioni nell'ATPasi Prp16p9. Confrontando il consenso con i giornalisti non di consenso, il test ACT1-CUP1 è stato una chiave importante per comprendere la robustezza e la selettività dello spliceosoma del lievito e per dedurre la funzione degli spliceosomi di altri eucarioti.

Poiché i giornalisti ACT1-CUP1 non consensuali sensibilizzano lo spliceosoma a ulteriori perturbazioni, l'impatto di una singola mutazione del fattore di splicing può essere caratterizzato attraverso i reporter che ha un impatto positivo o negativo. Questo è stato applicato allo splicing delle domande di ricerca in vari modi. In primo luogo, il test ACT1-CUP1 può ed è stato utilizzato come screening genetico per le mutazioni nei fattori di splicing. Ad esempio, Prp8p, la più grande proteina di splicing, funge da piattaforma su cui il nucleo di RNA dello spliceosoma catalizza la reazione di splicing. Ciò è stato dedotto, in parte, attraverso il modo in cui i mutanti Prp8p hanno migliorato o ridotto lo splicing di diversi reporter ACT1-CUP1 10,11,12,13,14,15,16,17. Altri componenti proteici dello spliceosoma sono stati studiati utilizzando ACT1-CUP1, tra cui Hsh155p, Cwc2p, Cef1p ed Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25. Le soglie energetiche per Prp16p e altre quattro ATPasi coinvolte nella transizione spliceosomiale sono state studiate anche con questo test 9,26,27,28,29,30. I piccoli RNA nucleari (snRNA) sono stati anche ampiamente studiati utilizzando ACT1-CUP1 per identificare le sequenze di pre-mRNA che coordinano e i cambiamenti nella struttura secondaria che gli snRNA subiscono durante lo splicing 3,31,32,33,34,35,36,37.

Il test ACT1-CUP1 richiede un ceppo di lievito in cui tutte le copie del gene CUP1 sono state eliminate. Poiché CUP1 può avere un numero di copie elevato 6,38, la preparazione di un ceppo knock-out completo può richiedere più round o uno screening approfondito. Di conseguenza, i ceppi di lievito cup1Δ sono stati spesso condivisi tra i laboratori, così come i giornalisti.

Se le mutazioni in un fattore di splicing vengono valutate da una copia plasmide, il gene wild-type per questo fattore dovrebbe essere eliminato. Inoltre, il background del lievito dovrebbe consentire la selezione di almeno due plasmidi, uno contenente un reporter ACT1-CUP1, storicamente su un plasmide di selezione dei nutrienti leucina, e uno contenente una mutazione o perturbazione nel meccanismo di splicing che verrà studiato (Figura 2). Di solito, in un singolo test, più ceppi di lievito, ciascuno con la perturbazione dello splicing della query (QSP) e un reporter diverso, testeranno l'impatto della query sullo splicing.

Le variabili indipendenti nel test ACT1-CUP1 consentono a un ricercatore di valutare la gravità di un QSP. Queste variabili indipendenti sono la concentrazione di rame e la selezione di più reporter di giunzione non consensuali. In primo luogo, poiché i ceppi di lievito vengono coltivati su piastre contenenti una gamma di concentrazioni di rame (Figura 2), l'impostazione del saggio include la selezione del gradiente di concentrazioni utilizzate. Gli studi possono utilizzare un gradiente di concentrazione di rame del corso per ottenere una lettura iniziale della vitalità e quindi ripetere il test con un gradiente più fine per identificare sottili differenze di vitalità. La seconda variabile è l'ampia gamma di reporter ACT1-CUP1 che possono essere testati (Figura 1 e Tabella 1). Se il QSP influisce sulla vitalità del lievito in modo diverso in presenza di un reporter non di consenso rispetto al wild-type, si può concludere che il QSP influisce su una fase dello splicing o su una regione dello spliceosoma importante durante il riconoscimento o l'elaborazione di quella regione dell'introne.

La cassetta degli attrezzi del lievito è ampia e il test ACT1-CUP1 è parte integrante della ricerca sullo splicing. Il test ACT1-CUP1 viene spesso eseguito insieme a un'analisi genetica, strutturale e/o biochimica più approfondita sull'impatto di un QSP. Poiché questi studi più dettagliati hanno generalmente una procedura più lunga e / o un prezzo più alto, un approccio frequente è lo screening di mutanti interessanti con ACT1-CUP1 prima.

A condizione che qui sia presente un protocollo di analisi ACT1-CUP1, inclusa la preparazione della piastra di rame. Questo test fornisce ai ricercatori una risposta iniziale all'effetto di un QSP sullo splicing e quali regioni introniche sono maggiormente influenzate dalla perturbazione.

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Protocollo

1. Costruzione del ceppo di lievito

  1. Generare o ottenere un ceppo di S. cerevisiae il cui background include leu2 e cup1Δ. Per generare questo background, utilizzare il metodo del lievito ben consolidato che impiega acetato di litio e DNA a singolo filamento39.
    NOTA: I ceppi di lievito aploidi possono contenere una, due o più copie di CUP1 6,38. Fare riferimento alle informazioni genomiche per il ceppo di lievito selezionato quando si progettano primer knock-out per affiancare la posizione del gene CUP1.
  2. Eseguire una trasformazione del lievito per incorporare il QSP tramite incorporazione genomica o su un plasmide. Utilizzare un protocollo consolidato come quelli descritti nella ricerca precedente40,41,42.
  3. Eseguire una trasformazione del lievito con i ceppi risultanti dal punto 1.2. per aggiungere il plasmide reporter ACT1-CUP1 desiderato.
    NOTA: Le cellule devono essere mantenute su piastre e terreni di abbandono della leucina (-Leu) per garantire la ritenzione dei plasmidi reporter ACT1-CUP1 dopo questa trasformazione.
  4. Eseguire i passaggi 1.2. e 1.3. per ogni QSP e ogni plasmide reporter ACT1-CUP1 da testare, compresi i ceppi di controllo.

2. Preparazione della piastra di rame

  1. Selezionare un intervallo di concentrazione di rame adatto ai reporter da testare (vedere la Tabella 1 per la letalità dei reporter usati frequentemente).
    NOTA: un esempio di intervallo di concentrazione di rame completo è costituito da 30 diverse concentrazioni di rame di 0 mM, 0,025 mM, 0,05 mM, 0,075 mM, 0,1 mM, 0,15 mM, 0,2 mM, 0,25 mM, 0,3 mM, 0,35 mM, 0,4 mM, 0,45 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM e 2,5 mM Cu2+.
  2. Preparare una soluzione madre di 1 M CuSO4 e filtrare sterile attraverso un filtro sterile in PES (polietersolfone) da 0,22 μm.
  3. Per la piastra di rame desiderata, preparare una diluizione di 2 ml del brodo CuSO4 in acqua sterile.
    NOTA: Poiché la lastra con 0 mM Cu 2+ verrà sempre analizzata e ripresa come riferimento, si consiglia di realizzare due lastre 0 mM Cu2+, una all'inizio e una alla fine della fase galvanica (passaggio 3.4.).
    1. Calcolare la quantità di scorte per la concentrazione finale di rame desiderata in 40 mL del volume della piastra (Tabella supplementare 1).
    2. Aggiungere la quantità calcolata di acqua sterile e 1 M CuSO4 stock in un tubo sterile da 2 ml.
  4. Versare le piastre per il test ACT1-CUP1.
    NOTA: Un'alternativa al protocollo riportato di seguito consiste nel combinare inizialmente il mezzo e l'agar in un grande contenitore e aliquota dopo l'autoclave in contenitori più piccoli per ottenere diverse concentrazioni di rame per ciascuna piastra. Qualunque sia il metodo adottato, è importante assicurarsi che la concentrazione del fluido sia coerente tra tutte le piastre, nonostante ciascuna abbia una diversa concentrazione di rame.
    1. Etichettare ogni piatto vuoto da versare con la concentrazione finale di rame che conterrà. Preparare almeno una piastra quadrata per ogni concentrazione di rame da testare.
    2. Etichettare una bottiglia da 100 ml per concentrazione di rame da testare.
    3. Ad ogni flacone, aggiungere 790 mg di agar (2% p/v di agar) e un mescolatore.
    4. In un becher grande, unire il mezzo di crescita -Leu per tutte le lastre di rame da versare. Per ogni piastra da produrre, sciogliere 265 mg di lievito azotato base (YNB) e 64 mg di miscela drop-out meno leucina (e qualsiasi altro nutriente che possa essere necessario per mantenere il plasmide QSP nelle cellule) in 34 ml di acqua deionizzata.
    5. Aggiungere 34 ml della soluzione di terreno di coltura -Leu a ciascuna bottiglia da 100 ml preparata e tappo con foglio di alluminio. Etichettare il foglio con la concentrazione di rame prevista.
    6. Autoclave per sterilizzare e sciogliere l'agar utilizzando il ciclo liquido consigliato per l'autoclave.
    7. Aggiungere il più rapidamente possibile, 4 ml di glucosio al 20% p/v (filtrato sterile) in ciascuna bottiglia.
    8. Abbinare le etichette e aggiungere le diluizioni da 2 ml di CuSO4 al flacone previsto.
      NOTA: Poiché decine di lastre di rame possono essere prodotte contemporaneamente, ognuna con una concentrazione diversa, etichettare chiaramente tutte le bottiglie, i tubi e le piastre con la concentrazione di rame prevista eviterà confusione durante il versamento delle lastre.
    9. Utilizzare una piastra mescolare per mescolare per ~ 30 s e versare o pipettare 35 ml nella piastra etichettata, evitando bolle. Lasciare raffreddare prima di riporlo o utilizzarlo.
      NOTA: Spesso, le piastre vengono fatte 1 giorno o 2 giorni prima del test e conservate a 4 °C fino a poche ore prima dell'uso. Le piastre devono essere a temperatura ambiente (RT) prima di iniziare la placcatura (fase 3.4.).

3. Saggio ACT1-CUP1

  1. Striare i ceppi desiderati su piastre -Leu.
    NOTA: Se si lavora da scorte criogeniche, è necessario prestare attenzione per garantire che le cellule siano sufficientemente rianimate dallo stoccaggio prima della placcatura. Una procedura raccomandata per questo è quella di striare dal ceppo criogenico e lasciarlo crescere per 3-5 giorni a 30 ° C. Quindi, riporre un piccolo campione e lasciarlo crescere per altri 2-3 giorni a 30 ° C.
  2. Coltiva colture durante la notte in 10 ml di media.
    1. Preparare i substrati di crescita -Leu utilizzando gli stessi rapporti descritti al punto 2.4.2. Per 10 ml di terreno, aggiungere 66 mg di base azoto di lievito (YNB) e 16 mg di miscela drop-out meno leucina a 9 ml di acqua deionizzata. Passare attraverso un filtro sterile PES da 0,22 μm.
    2. Per ogni ceppo di lievito, aggiungere 9 ml di terreno di crescita -Leu e 1 mL di glucosio al 20% p/v (filtrato sterile) in un tubo conico sterile da 50 ml.
    3. Utilizzando un bastoncino sterile o una punta di pipet, raccogliere un piccolo campione di lievito (~ 1 mm rotondo) e inoculare il supporto.
    4. Agitare tutte le colture notturne a 180 giri/min e 30 °C.
      NOTA: Se disponibili, i rotatori possono essere utilizzati al posto di uno shaker.
  3. Diluire i ceppi a un OD600 0,5 ± 0,05 in glicerolo al 10%.
    1. Per ceppo, aggiungere 100 μL di coltura in una cuvetta contenente 900 μL di acqua.
    2. Misurare l'OD600 con uno spettrofotometro.
    3. Calcolare la diluizione richiesta per essere a un OD600 di 0,5 in un volume finale di 2 ml.
    4. Diluire ogni ceppo a OD600 0,5 in glicerolo al 10% (sterile).
    5. Rimisurare l'OD600 per verificare che la densità cellulare rientri nell'intervallo desiderato compreso tra 0,5 ± 0,05.
  4. Placcare i ceppi sulle piastre di rame.
    NOTA: è possibile utilizzare una varietà di metodi per placcare i ceppi, tra cui pipettaggio manuale di volumi da 5-10 μL, utilizzando un pipettatore a ripetizione o multicanale o stampaggio con un replicatore di pin. Quest'ultimo metodo è descritto di seguito, anche se la maggior parte dei passaggi sarà simile indipendentemente dal metodo.
    1. Impostare un luogo di lavoro sterile e un bruciatore Bunsen acceso.
    2. Per un replicatore a 48 pin, pipettare 200 μL di ciascun ceppo diluito in un pozzetto separato di una piastra a 96 pozzetti. Riempire gli spazi vuoti nella griglia 6 x 8 con 200 μL di glicerolo al 10% (sterile).
      NOTA: Un esempio di schema galvanico per nove ceppi di lievito è riportato nella tabella supplementare 2.
    3. Immergere il replicatore in un piatto poco profondo di etanolo al 95% (v / v) e fiammare per sterilizzare. Lasciare raffreddare per almeno 2 minuti dopo che la fiamma si è spenta per evitare che il calore urti le cellule.
    4. Posizionare quattro piastre vicino al bruciatore e rimuovere i coperchi.
    5. Immergere il replicatore nella piastra a 96 pozzetti e sollevarlo con un movimento rapido.
    6. Posizionare delicatamente sul piatto e dondolare leggermente avanti e indietro per facilitare un buon trasferimento.
    7. Solleva con un movimento rapido e posizionalo esattamente nello stesso orientamento nella piastra a 96 pozzetti.
    8. Ripetere l'operazione per un massimo di altri tre piatti. Ripetere il processo di immersione del replicatore in etanolo, fiammeggiante per sterilizzare e attendere di raffreddare ogni quattro piastre.
    9. Dopo che una piastra è stata placcata, spostati con un movimento graduale verso il lato ma sempre all'interno dell'ombrello di sterilizzazione della fiamma.
      NOTA: Si consiglia di eseguire le diluizioni del lievito e la placcatura vicino a una fiamma. Le piastre possono facilmente essere contaminate durante l'essiccazione.
    10. Lasciare asciugare completamente i piatti prima di posizionare i coperchi, di solito 3-5 min.
    11. Incubare le piastre per 3 giorni a 30 °C.

4. Raccolta e analisi dei dati

  1. Rimuovere le piastre dall'incubatore e ispezionarle visivamente.
  2. Registrare le immagini delle lastre con una fotocamera disponibile o un altro sistema di imaging digitale.
  3. Registrare (o punteggio) per ogni ceppo si osserva l'ultima crescita visibile della concentrazione di rame.
    NOTA: Le cellule sono in grado di giuntare e rimanere vitali fino a quella concentrazione. Per coerenza, utilizzare sempre lo stesso metodo, ad occhio o dalle immagini della lastra, per ottenere l'ultima concentrazione di rame vitale. Colonie molto piccole sono talvolta visibili dall'occhio ma non sull'immagine. La differenza tra l'ispezione visiva diretta o la registrazione dalle immagini è piccola, di solito un passo nel gradiente. Poiché le immagini delle colonie sono spesso utilizzate nelle pubblicazioni, si raccomanda di segnare in base alle immagini.
  4. Combinare i dati di più saggi ACT1-CUP1 per lo stesso ceppo per trarre conclusioni su come il QSP influisce sullo splicing.
    NOTA: I dati di pubblicazione mostrano abitualmente immagini delle colonie di lievito a 0 mM Cu2+ concentrazione, l'ultima concentrazione di rame vitale e la successiva concentrazione in cui la colonia è morta. I dati possono anche essere visualizzati come grafico a barre con barre di errore per la deviazione standard tra le repliche. I dati non devono essere normalizzati, ma possono esserlo impostando la vitalità del controllo del fattore di splicing WT su 1 e confrontando l'effetto delle mutazioni introdotte.

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Risultati

I saggi di crescita, come ACT1-CUP1, richiedono la valutazione visiva e comparativa di più colonie. Qui, ogni ceppo è stato coltivato fino alla saturazione durante la notte, diluito a un OD600 di 0,5 e placcato su 20 piastre contenenti un intervallo di concentrazioni di rame da 0 mM a 1,1 mM CuSO4 (Figura 3). Questo intervallo è inferiore a quello elencato nel protocollo in quanto ha consentito la valutazione completa dell'impatto dei QSP e dei reporter ACT1-CUP1 utiliz...

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Discussione

ACT1-CUP1 è un test di crescita e occorre prestare attenzione per garantire che le differenze di crescita osservate possano essere attribuite solo a difetti di splicing. Tutti i ceppi devono essere manipolati in modo simile prima della placcatura, compresa la lunghezza e il tipo di crescita e condizioni di conservazione simili. Se si utilizzano ceppi sensibili alla temperatura, i saggi ACT1-CUP1 devono essere eseguiti solo in condizioni in cui tali ceppi crescono in modo comparabile al tipo selvatico. In relazione a ciò,...

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Dichiarazioni

L'autore non ha nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Grazie ad Aaron Hoskins e ai membri del laboratorio Hoskins dell'Università del Wisconsin-Madison per l'uso di ceppi di lievito e attrezzature nella generazione delle figure 3-5. Grazie a Harpreet Kaur e Xingyang Fu per i loro commenti penetranti sul manoscritto. Grazie agli studenti, al personale e ai docenti della Northwest University durante la scrittura, l'editing e le riprese di questo documento. Grazie a Isabelle Marasigan per l'aiuto nelle riprese di questo metodo.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette sterili per microcentrifuga da 1,5 mLFisher Scientific05-408-129O prodotto comparabile di un produttore diverso.
Provette sterili per microcentrifuga da 2 mLFisher Scientific05-408-138O articolo comparabile di un produttore diverso.
Provette da centrifuga sterili da 50 mLFisher Scientific07-201-332O prodotto comparabile di un produttore diverso.
Micropiastra a fondo tondo a 96 pozzettiFisher Scientific07-200-760O articolo comparabile di un produttore diverso.
Etanolo a 190 proveFisher Scientific22-032-600O articolo comparabile di un produttore diverso.
Sistema di filtraggio da 500 mL (0,22 & micro; m)CellTreat Scientific Products229707O un articolo comparabile di un produttore diverso.
AgarFisher ScientificBP1423-500Qualsiasi agar di grado molecolare funzionerà.
AutoclaveTuttnauer3870EAO articolo comparabile di un produttore diverso.
Bruciatore BunsenHumboldtPN6200.1O articolo comparabile di un produttore diverso.
Densimetro di celleVWR490005-906O altro dispositivo spettrale in grado di misurare l'assorbanza a 595 nm.
Solfato di rame pentaidratoFisher ScientificLC134051O articolo comparabile di un produttore diverso.
Sistema di imaging digitaleCytiva29399481ImageQuant 4000 (utilizzato per la Figura 3),  Amersham ImageQuant 800 o un prodotto comparabile di un altro produttore.
Miscela di dropout (-Leu)USBiological Life SciencesD9525Utilizzare la miscela di dropout appropriata per l'esperimento. È possibile che utilizzerai anche un marcatore nutritivo del lievito per la tua perturbazione della query. In tal caso, la miscela di esclusione dovrebbe essere per quel marcatore e Leu
D-GlucosioFisher ScientificAAA1682836O un articolo comparabile di un produttore diverso.
Software di quantificazione della banda gelCytiva29-0006-05ImageQuant TL v8.1 (utilizzato per la figura 5A) o articolo comparabile di un produttore diverso.
Fotocamera portatileNikonD3500O articolo comparabile di un produttore diverso.
Dispositivo di imaging su gel nel vicino infrarossoCytiva29238583Amersham Typhoon NIR (utilizzato per la Figura 5a) o articolo simile di un produttore diverso.
Morsetto da laboratorioFisher Scientific05-769-7QO articolo comparabile di un altro produttore.
Supporto e morsetto da laboratorioFisher Scientific12-000-101O articolo comparabile di un produttore diverso.
Ancorette magneticheFisher Scientific14-513-51O un prodotto comparabile di un produttore diverso.
Replicatore a spilloVP ScientificVP 407AH
Cuvette monouso semi-microVWR97000-590O articolo comparabile di un produttore diverso.
AgitatoreJEIO TechIST-3075O articolo comparabile di un produttore diverso.
SpettrofotometroBiowave80-3000-45O qualsiasi spettrofotometro in grado di misurare l'assorbanza a 600 nm.
Piastre quadrateVWR102091-156Possono essere utilizzate anche piastre circolari, anche se sono più impegnative se si utilizza un replicatore a spillo.
Piastra di agitazioneFisher Scientific11-520-16SO articolo comparabile di un produttore diverso.
Lievito a base di azotoUSBiological Life SciencesY2025O articolo comparabile di un produttore diverso.

Riferimenti

  1. Wahl, M. C., Will, C. L., Luhrmann, R. The spliceosome: Design principles of a dynamic RNP machine. Cell. 136 (4), 701-718 (2009).
  2. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
  3. Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutational analysis of pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae using a sensitive new reporter gene, CUP1. Genetics. 133 (4), 851-863 (1993).
  4. Ng, R., Abelson, J. Isolation and sequence of the gene for actin in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (7), 3912-3916 (1980).
  5. Gallwitz, D., Sures, I. Structure of a split yeast gene: Complete nucleotide sequence of the actin gene in I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (5), 2546-2550 (1980).
  6. Fogel, S., Welch, J. W., Cathala, G., Karin, M. Gene amplification in yeast: CUP1 copy number regulates copper resistance. Current Genetics. 7 (5), 347-355 (1983).
  7. Hamer, D. H., Thiele, D. J., Lemontt, J. E. Function and autoregulation of yeast copperthionein. Science. 228 (4700), 685-690 (1985).
  8. Winge, D. R., Nielson, K. B., Gray, W. R., Hamer, D. H. Yeast metallothionein. Sequence and metal-binding properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14464-14470 (1985).
  9. Burgess, S. M., Guthrie, C. A mechanism to enhance mRNA splicing fidelity: The RNA-dependent ATPase Prp16 governs usage of a discard pathway for aberrant lariat intermediates. Cell. 73 (7), 1377-1391 (1993).
  10. Collins, C. A., Guthrie, C. Allele-specific genetic interactions between Prp8 and RNA active site residues suggest a function for Prp8 at the catalytic core of the spliceosome. Genes & Development. 13 (15), 1970-1982 (1999).
  11. Siatecka, M., Reyes, J. L., Konarska, M. M. Functional interactions of Prp8 with both splice sites at the spliceosomal catalytic center. Genes & Development. 13 (15), 1983-1993 (1999).
  12. Umen, J. G., Guthrie, C. Mutagenesis of the yeast gene PRP8 reveals domains governing the specificity and fidelity of 3' splice site selection. Genetics. 143 (2), 723-739 (1996).
  13. Grainger, R. J., Beggs, J. D. Prp8 protein: At the heart of the spliceosome. RNA. 11 (5), 533-557 (2005).
  14. Query, C. C., Konarska, M. M. Suppression of multiple substrate mutations by spliceosomal prp8 alleles suggests functional correlations with ribosomal ambiguity mutants. Molecular Cell. 14 (3), 343-354 (2004).
  15. Konarska, M. M., Vilardell, J., Query, C. C. Repositioning of the reaction intermediate within the catalytic center of the spliceosome. Molecular Cell. 21 (4), 543-553 (2006).
  16. Liu, L., Query, C. C., Konarska, M. M. Opposing classes of prp8 alleles modulate the transition between the catalytic steps of pre-mRNA splicing. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (6), 519-526 (2007).
  17. MacRae, A. J., et al. Prp8 positioning of U5 snRNA is linked to 5' splice site recognition. RNA. 24 (6), 769-777 (2018).
  18. Query, C. C., Konarska, M. M. CEF1/CDC5 alleles modulate transitions between catalytic conformations of the spliceosome. RNA. 18 (5), 1001-1013 (2012).
  19. Tang, Q., et al. SF3B1/Hsh155 HEAT motif mutations affect interaction with the spliceosomal ATPase Prp5, resulting in altered branch site selectivity in pre-mRNA splicing. Genes & Development. 30 (24), 2710-2723 (2016).
  20. Carrocci, T. J., Zoerner, D. M., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. SF3b1 mutations associated with myelodysplastic syndromes alter the fidelity of branchsite selection in yeast. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4837-4852 (2017).
  21. Kaur, H., Groubert, B., Paulson, J. C., McMillan, S., Hoskins, A. A. Impact of cancer-associated mutations in Hsh155/SF3b1 HEAT repeats 9-12 on pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 15 (4), 0229315(2020).
  22. vander Feltz, C., et al. Saccharomyces cerevisiae Ecm2 modulates the catalytic steps of pre-mRNA splicing. RNA. 27 (5), 591-603 (2021).
  23. Carrocci, T. J., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. Functional analysis of Hsh155/SF3b1 interactions with the U2 snRNA/branch site duplex. RNA. 24 (8), 1028-1040 (2018).
  24. Hogg, R., de Almeida, R. A., Ruckshanthi, J. P., O'Keefe, R. T. Remodeling of U2-U6 snRNA helix I during pre-mRNA splicing by Prp16 and the NineTeen Complex protein Cwc2. Nucleic Acids Research. 42 (12), 8008-8023 (2014).
  25. Hansen, S. R., Nikolai, B. J., Spreacker, P. J., Carrocci, T. J., Hoskins, A. A. Chemical inhibition of pre-mRNA splicing in living Saccharomyces cerevisiae. Cell Chemical Biology. 26 (3), 443-448 (2019).
  26. Xu, Y. Z., Query, C. C. Competition between the ATPase Prp5 and branch region-U2 snRNA pairing modulates the fidelity of spliceosome assembly. Molecular Cell. 28 (5), 838-849 (2007).
  27. Staley, J. P., Guthrie, C. An RNA switch at the 5' splice site requires ATP and the DEAD box protein Prp28p. Molecular Cell. 3 (1), 55-64 (1999).
  28. Bousquet-Antonelli, C., Presutti, C., Tollervey, D. Identification of a regulated pathway for nuclear pre-mRNA turnover. Cell. 102 (6), 765-775 (2000).
  29. Villa, T., Guthrie, C. The Isy1p component of the NineTeen complex interacts with the ATPase Prp16p to regulate the fidelity of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 19 (16), 1894-1904 (2005).
  30. Mayas, R. M., Maita, H., Staley, J. P. Exon ligation is proofread by the DExD/H-box ATPase Prp22p. Nature Structure and Molecular Biology. 13 (6), 482-490 (2006).
  31. Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutations in U6 snRNA that alter splice site specificity: Implications for the active site. Science. 262 (5142), 1982-1988 (1993).
  32. McPheeters, D. S. Interactions of the yeast U6 RNA with the pre-mRNA branch site. RNA. 2 (11), 1110-1123 (1996).
  33. Perriman, R. J., Ares, M. Rearrangement of competing U2 RNA helices within the spliceosome promotes multiple steps in splicing. Genes & Development. 21 (7), 811-820 (2007).
  34. Mefford, M. A., Staley, J. P. Evidence that U2/U6 helix I promotes both catalytic steps of pre-mRNA splicing and rearranges in between these steps. RNA. 15 (7), 1386-1397 (2009).
  35. Hilliker, A. K., Mefford, M. A., Staley, J. P. U2 toggles iteratively between the stem IIa and stem IIc conformations to promote pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (7), 821-834 (2007).
  36. Wu, G., et al. Pseudouridines in U2 snRNA stimulate the ATPase activity of Prp5 during spliceosome assembly. EMBO Journal. 35 (6), 654-667 (2016).
  37. Crotti, L. B., Bacikova, D., Horowitz, D. S. The Prp18 protein stabilizes the interaction of both exons with the U5 snRNA during the second step of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (10), 1204-1216 (2007).
  38. Fogel, S., Welch, J. W. Tandem gene amplification mediates copper resistance in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5342-5346 (1982).
  39. Gardner, J. M., Jaspersen, S. L. Manipulating the yeast genome: Deletion, mutation, and tagging by PCR. Methods Molecular Biology. 1205, 45-78 (2014).
  40. JoVE. Yeast Transformation and Cloning. In Biology I: yeast, Drosophila and C. Elegant. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  41. Gietz, R. D., Woods, R. A. Yeast transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG method. Methods Molecular Biology. 313, 107-120 (2006).
  42. Gietz, R. D., Woods, R. A. Genetic transformation of yeast. Biotechniques. 30 (4), 816(2001).
  43. Mayerle, M., et al. Structural toggle in the RNaseH domain of Prp8 helps balance splicing fidelity and catalytic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4739-4744 (2017).
  44. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  45. Beier, D. H., et al. Dynamics of the DEAD-box ATPase Prp5 RecA-like domains provide a conformational switch during spliceosome assembly. Nucleic Acids Research. 47 (20), 10842-10851 (2019).
  46. vander Feltz, C., DeHaven, A. C., Hoskins, A. A. Stress-induced pseudouridylation alters the structural equilibrium of yeast U2 snRNA Stem II. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 524-536 (2018).
  47. Rodgers, M. L., Didychuk, A. L., Butcher, S. E., Brow, D. A., Hoskins, A. A. A multi-step model for facilitated unwinding of the yeast U4/U6 RNA duplex. Nucleic Acids Research. 44 (22), 10912-10928 (2016).
  48. Stutz, F., Rosbash, M. A functional interaction between Rev and yeast pre-mRNA is related to splicing complex formation. EMBO Journal. 13 (17), 4096-4104 (1994).
  49. Libri, D., Lescure, A., Rosbash, M. Splicing enhancement in the yeast rp51b intron. RNA. 6 (3), 352-368 (2000).
  50. Libri, D., Stutz, F., McCarthy, T., Rosbash, M. RNA structural patterns and splicing: Molecular basis for an RNA-based enhancer. RNA. 1 (4), 425-436 (1995).
  51. Howe, K. J., Kane, C. M., Ares, M. Perturbation of transcription elongation influences the fidelity of internal exon inclusion in Saccharomyces cerevisiae. RNA. 9 (8), 993-1006 (2003).
  52. Cuenca-Bono, B., et al. SUS1 introns are required for efficient mRNA nuclear export in yeast. Nucleic Acids Research. 39 (19), 8599-8611 (2011).
  53. Scherrer, F. W., Spingola, M. A subset of Mer1p-dependent introns requires Bud13p for splicing activation and nuclear retention. RNA. 12 (7), 1361-1372 (2006).
  54. Hálová, M., et al. Nineteen complex-related factor Prp45 is required for the early stages of cotranscriptional spliceosome assembly. RNA. 23 (10), 1512-1524 (2017).
  55. Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection. Genes & Development. 9 (7), 855-868 (1995).
  56. Crotti, L. B., Horowitz, D. S. Exon sequences at the splice junctions affect splicing fidelity and alternative splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 18954-18959 (2009).
  57. Perriman, R., Ares, M. Invariant U2 snRNA nucleotides form a stem loop to recognize the intron early in splicing. Molecular Cell. 38 (3), 416-427 (2010).

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