Il presente studio delinea un metodo altamente riproducibile e trattabile per studiare gli eventi di segnalazione Wnt paracrini non canonici in vitro. Questo protocollo è stato applicato per valutare l'impatto della segnalazione paracrina Wnt5a nelle cellule della cresta neurale murina e nei mioblasti.
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Articolo metodologico
Modellazione paracrina non canonica Wnt Signaling In Vitro
In questo articolo
Sommario
Abstract
La segnalazione Wnt non canonica regola l'organizzazione intracellulare del filamento di actina e la migrazione polarizzata delle cellule progenitrici durante l'embriogenesi. Questo processo richiede interazioni paracrine complesse e coordinate tra le cellule che inviano e ricevono il segnale. Dato che queste interazioni possono verificarsi tra vari tipi di cellule di diversi lignaggi, la valutazione in vivo dei difetti specifici delle cellule può essere difficile. Il presente studio descrive un metodo altamente riproducibile per valutare la segnalazione Wnt paracrina non canonica in vitro. Questo protocollo è stato progettato con la capacità di (1) condurre valutazioni funzionali e molecolari della segnalazione Wnt non canonica tra due tipi di cellule di interesse; (2) analizzare il ruolo delle molecole che inviano il segnale rispetto a quelle che ricevono il segnale nella via di segnalazione Wnt non canonica; e (3) eseguire esperimenti fenotipici di salvataggio con approcci molecolari o farmacologici standard.
Questo protocollo è stato utilizzato per valutare la segnalazione Wnt non canonica mediata dalle cellule della cresta neurale (NCC) nei mioblasti. La presenza di NCC è associata ad un aumento del numero di filopodi citoplasmatici e lamellipodi positivi alla falloidina nei mioblasti e a una migliore migrazione dei mioblasti in un test di guarigione delle ferite. L'asse Wnt5a-ROR2 è stato identificato come una via di segnalazione Wnt cruciale non canonica tra NCC e progenitori del secondo campo cardiaco (SHF). In conclusione, questo è un protocollo altamente trattabile per studiare i meccanismi di segnalazione Wnt paracrini non canonici in vitro.
Introduzione
La segnalazione Wnt non canonica è una via evolutivamente conservata che regola l'organizzazione dei filamenti cellulari e la migrazione direzionale. Questa via è stata implicata in molteplici processi biologici, tra cui la morfogenesi del tessuto embrionale 1,2,3, l'angiogenesi linfatica e vascolare 4,5,6,7 e la crescita e le metastasi del cancro 8,9,10 .....
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Protocollo
1. Espansione presperimentale e passaggio delle cellule
- Coltura cellulare C2C12:
- Preparare 500 ml di terreno di coltura C2C12 combinando il terreno di coltura modificato di Dulbecco (DMEM) con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina.
- Scongelare un flaconcino di cellule C2C12 a bagnomaria a 37 °C. Mentre le celle C2C12 si scongelano, aggiungere 5 ml di terreno C2C12 a un tubo conico da 15 ml. Trasferire immediatamente le cellule scongelate nel tubo da 15 mL utilizzando una pipetta P1000.
NOTA: Le cellule C2C12 sono cellule di mioblasti murini che sono state precedentemente utilizzate e conv....
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Risultati
Effetti dei NCC sulla capacità migratoria dei mioblasti murini
Questo test è stato applicato per la prima volta per valutare l'impatto delle NCC sulla capacità migratoria dei mioblasti. La Figura 1 illustra il modello schematico del test. Per testare questo impatto, sono stati eseguiti saggi di scratch con mioblasti che sono stati coltivati in isolamento (senza inserti NCC) rispetto a quelli cresciuti in presenza di inserti. Come controllo positivo, 500 ng/mL di Wnt5a ric.......
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Discussione
La via di segnalazione non canonica Wnt/polarità cellulare planare (PCP) è una via di segnalazione cellulare di importanza critica che è stata implicata nei processi di sviluppo multiplo 24,25 e malattia24,26. Durante lo sviluppo embrionale, la segnalazione Wnt non canonica coinvolge una vasta rete di segnali molecolari provenienti da cellule che inviano segnali che alla fine inducono cambiamenti.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato in parte dai premi NIH F30HL154324 a O.T. e K08HL121191 e R03HL154301 a S.R.K. Gli autori desiderano riconoscere che lo schema nella Figura 1 di questo manoscritto è stato creato con biorender.com.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoetanolo | Sigma Aldrich | M-7522 | |
| Supporto di montaggio antisbiadimento con DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | Conservato a 4 gradi; C |
| Albumina sierica bovina | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323 | Conservato a 4 ° C |
| C2C12 linea cellulare di mioblasti murini | ATCC | CRL-1772 | |
| Flaconi per colture cellulari, 75 cm2 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Chamber Slide System, 4 pozzetti | ThermoFisher Scientific | 154526 | |
| Dulbecco' s Aquila modificata' s Medio (DMEM), glicemia alta (4,5 g/L), L-glutammina (2 mM) | Corning | 10-017-CV | Conservato a 4 gradi; C |
| Provette coniche per centrifuga Falcon, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Supporto permeabile Falcon per piastra a 24 pozzetti con 0,4 &; M membrana in PET trasparente | Corning | 353095 | |
| Siero fetale bovino | Fisher Scientific | W3381E | Conservato in aliquote da 50 mL a -20 ° C |
| Soluzione di gelatina, 0,1% | ATCC | PCS-999-027 | Conservato a 4 ° C |
| Puntali per pipette graduati e sterili, 10 & micro; L | USA Scientific | 1111-3810 | |
| Fattore inibitorio della leucemia (LIF), 106 unità/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| L-glutammina 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Lipofectamina RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| MEM aminoacidi non essenziali (MEM NEAA) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| Terreno minimo essenziale (MEM) | Corning | 10-022-CV | |
| Mitomicina C | Roche | 10107409001 | |
| Vetrini coprioggetto antiaderenti per auto, 24 x 55 mm | Springside Scientific HRTCG2455 | ||
| linea cellulare con cresta neurale O9-1 | Millipore Sigma | SCC049 | |
| Opti-MEM I, 1x | Gibco | 31985-070 | |
| Paraformaldeide soluzione in PBS, 4% | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Conservato a 4 gradi C |
| Penicillina-streptomicina (10.000 U/mL di penicillina e 10.000 μ g/mL di streptomicina) | Fisher Scientific | W3470H | Conservato in aliquote da 10 mL a -20 gradi; C |
| Phalloidin-iFluor 488 | Abcam | ab176753 | Conservato a -20 ° C, Tenere al riparo dalla luce |
| Soluzione salina tampone fosfato (PBS), 1x, senza calcio e magnesio, pH 7,4 | Corning | 21-040-CV | Conservato a 4 gradi; C |
| Fattore di crescita dei fibroblasti umani ricombinante-basico (rhFGF-basic) | R& D Systems | 233-FB-025 | |
| Proteina Wnt5a ricombinante umana/di topo | R& D Systems | 645-WN-010 | |
| Piruvato di sodio, 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| Piastra di Petri quadrata con griglia | Thomas Scientific | 1219C98 | |
| STO cellule di alimentazione di fibroblasti murini | ATCC | CRL-1503 | |
| Soluzione Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tripsina-EDTA, 0,25% | Fisher Scientific | W3513C | Memorizzato a 4 gradi C |
| Microscopio a fluorescenza Zeiss Apotome.2 | Carl Zeiss AG | ||
| Microscopio ottico Zeiss invertito Axio Vert.A1 | Software per microscopia Carl Zeiss AG | ||
| Zen lite 2012 | imaging | Carl Zeiss AG |
Riferimenti
- Ho, H. Y. H., et al. Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).
- Čapek, D., et al.
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Ristampe e permessi
