Articolo metodologico

Utilizzo della colorazione rosso alizarina per rilevare la perdita ossea indotta chimicamente nelle larve di zebrafish

DOI:

10.3791/63251

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28 dicembre 2021

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1Department of Toxicology, School of Public Health, Jiangsu Key Laboratory of Preventive and Translational Medicine for Geriatric Diseases, Medical College of Soochow University, 2Department of Occupational Disease Prevention, Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention, 3Jiangsu Preventive Medicine Association, Nanjing, China

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, abbiamo usato la colorazione rosso alizarina per dimostrare che l'esposizione all'acetato di piombo provoca un cambiamento di massa ossea nelle larve di zebrafish. Questo metodo di colorazione può essere adattato allo studio della perdita ossea nella perdita di larve di zebrafish indotta da altre sostanze tossiche pericolose.

Abstract

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La perdita ossea indotta chimicamente dovuta all'esposizione al piombo (Pb) potrebbe innescare una serie di impatti avversi sui sistemi scheletrici sia umani che animali. Tuttavia, gli effetti e i meccanismi specifici del pesce zebra rimangono poco chiari. Il rosso alizarina ha un'alta affinità per gli ioni calcio e può aiutare a visualizzare l'osso e illustrare la massa minerale scheletrica. In questo studio, abbiamo mirato a rilevare la perdita ossea indotta dall'acetato di piombo (PbAc) nelle larve di zebrafish utilizzando la colorazione rosso alizarina. Gli embrioni di zebrafish sono stati trattati con una serie di concentrazioni di PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) tra 2 e 120 ore dopo la fecondazione. La colorazione scheletrica a montaggio intero è stata condotta sulle larve a 9 giorni dopo la fecondazione e l'area totale colorata è stata quantificata utilizzando il software ImageJ. I risultati hanno indicato che i tessuti mineralizzati erano colorati in rosso e l'area colorata diminuiva significativamente nel gruppo di esposizione al PbAc, con un cambiamento dose-dipendente nella mineralizzazione ossea. Questo documento presenta un protocollo di colorazione per studiare i cambiamenti scheletrici nei difetti ossei indotti da PbAc. Il metodo può essere utilizzato anche nelle larve di zebrafish per la rilevazione della perdita ossea indotta da altre sostanze chimiche.

Introduzione

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Studi recenti hanno confermato che l'osteoporosi dovuta a glucocorticoidi, inibitori dell'aromatasi e consumo eccessivo di alcol è comune 1,2. Il piombo (Pb) è un metallo tossico presente nelle piante, nel suolo e negli ambienti acquatici3. Sebbene gli effetti avversi del Pb sul corpo umano abbiano attirato molta attenzione, il suo impatto irreversibile sull'osso deve essere studiato ulteriormente. L'intossicazione da piombo provoca una vasta gamma di cambiamenti patologici sia nello scheletro in via di sviluppo che in quello adulto, influenzando le normali attività della vita. Gli studi hanno trovato un'associazione tra esposizione cronica a Pb e danno osseo4, tra cui strutture ossee compromesse5,6, ridotta densità minerale ossea e persino aumento del rischio di osteoporosi7.

Il tessuto mineralizzato è di grande importanza per la resistenza ossea8 e la deposizione della matrice di mineralizzazione ossea è un indice critico della formazione ossea9. Il rosso alizarina ha un'alta affinità per gli ioni calcio e la colorazione rosso alizarina è una procedura standard per valutare la formazione ossea10. Secondo questo metodo, il tessuto mineralizzato è colorato di rosso, mentre tutto il resto del tessuto rimane trasparente. L'area colorata viene quindi quantificata mediante analisi digitale delle immagini11.

Il pesce zebra è un importante organismo modello ampiamente utilizzato nella scoperta di farmaci e nei modelli di malattia. Studi genetici nel pesce zebra e nell'uomo hanno dimostrato somiglianze nei meccanismi alla base della morfogenesi scheletrica a livello molecolare12. Inoltre, lo screening di farmaci o biomolecole ad alto rendimento è più fattibile in grandi covate di zebrafish rispetto ai modelli murini, facilitando lo studio meccanicistico di molecole proosteogeniche o osteotossiche13. La colorazione differenziale dello scheletro in toto10 è frequentemente utilizzata nello studio della displasia scheletrica nei piccoli vertebrati e nei feti di mammiferi. La colorazione rossa dell'alizarina è stata eseguita per studiare la tossicità dello sviluppo osseo delle sostanze chimiche nelle larve di zebrafish. Qui, abbiamo usato il piombo come esempio per descrivere un protocollo per rilevare difetti ossei indotti dall'acetato di piombo nelle larve di zebrafish.

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Protocollo

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Tutte le procedure per animali descritte qui sono state esaminate e approvate dall'Animal Care Institute del Comitato Etico della Soochow University.

1. Allevamento ittico e raccolta di embrioni 14

  1. Dai da mangiare ai pesci tre volte al giorno; assicurarsi che i pesci zebra siano mantenuti a 28,5 ± 0,5 °C con un ciclo luce/buio di 14:10 h.
  2. Separare il pesce adulto maschio e femmina da tavole di isolamento in vasche di deposizione delle uova con un rapporto maschio-femmina di 2: 1 la sera.
  3. La mattina seguente, rimuovere le tavole di isolamento alle 9:00 e raccogliere gli embrioni 2 ore dopo.
  4. Mettere gli embrioni in un incubatore biochimico mantenuto a 28,5 °C prima dell'esperimento.

2. Esposizione chimica

  1. Preparare il brodo madre: pesare l'acetato di piombo triidrato (5 g) e scioglierlo in acqua ultrapura (50 ml) agitando.
    ATTENZIONE: PbAc è tossico. Indossare maschere antipolvere, indumenti protettivi e guanti adatti. Eseguire l'esperimento sotto una cappa aspirante.
  2. Selezionare e distribuire casualmente gli embrioni di zebrafish in piastre pulite a 6 pozzetti (30 embrioni per pozzetto in 3 ml di acqua di riproduzione del pesce zebra; vedere Tabella 1 per la sua composizione). Trattare gli embrioni con PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) da 2 a 120 ore dopo la fecondazione (hpf).
    NOTA: Le concentrazioni di PbAc sono state scelte in base agli esperimenti di determinazione del range di dose. I risultati hanno mostrato che la LC50 di acetato di piombo sugli embrioni di zebrafish era 41.044 mg/L a 120 hpf. Quindi, la concentrazione più alta è stata fissata a metà della LC50 e una serie di soluzioni preparate mediante diluizione 2 volte.
  3. Nutrire le larve due volte al giorno da 5 giorni dopo la fecondazione (dpf). Mantenere gli embrioni di zebrafish a 28,5 ± 0,5 °C con un ciclo luce/buio di 14:10 h.
  4. Rinfrescare il terreno privo di Pb (acqua di riproduzione del pesce zebra) ogni 24 ore fino a 9 dpf.
    NOTA: Al termine degli esperimenti, tutte le soluzioni contenenti piombo sono state versate in un serbatoio di liquido designato e trattate dal centro di gestione dell'esperimento.

3. Colorazione rosso alizarina

NOTA: Indossare maschere antipolvere, indumenti protettivi e guanti adatti durante l'intero processo di colorazione. Le composizioni di tutte le soluzioni sono mostrate nella Tabella 1.

  1. Fasi specifiche di colorazione
    NOTA: Il processo di tintura è stato effettuato in una piastra da 24 pozzetti a temperatura ambiente. Dopo aver aggiunto ogni soluzione, posizionare la piastra a 24 pozzetti sul tavolo vibrante impostato a bassa velocità.
    1. Rimuovere 10 larve di zebrafish a caso da ciascun gruppo a 9 dpf e fissare il pesce in 1 ml di paraformaldeide al 2% / 1x soluzione salina tamponata con fosfato per 2 ore.
    2. Decantare la soluzione e lavare le larve di zebrafish con 100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl2 per 10 min.
    3. Decantare la soluzione e incubare le larve nelle seguenti soluzioni per 5 minuti ciascuna per la decolorazione: soluzione di etanolo anidro (EtOH) (80% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl2, 50% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH=7,5) e 25% EtOH/100mM Tris-HCl (pH=7,5).
    4. Decantare la soluzione, rimuovere il pigmento mediante sbiancamento con una soluzione composta da 3%H 2 O2 e 0,5% KOH, e osservare una volta ogni 10 minuti fino a completa rimozione del pigmento.
    5. Risciacquare le larve di zebrafish più volte con glicerina al 25% / KOH allo 0,1% per 10 minuti ciascuna fino a quando non ci sono bolle.
      NOTA: È importante evitare le bolle; Altrimenti, le bolle nel corpo del pesce zebra appariranno come un campo visivo nero al microscopio, che influenzerà le osservazioni e l'analisi quantitativa.
    6. Macchiare le larve immergendo in 1 ml di alizarina allo 0,01% per 50 minuti.
    7. Decantare la soluzione e aggiungere 1 ml di glicerina al 50% / KOH allo 0,1% per 10 minuti per cancellare lo sfondo. Conservare i pesci in 50% glicerina fresca/0,1% KOH per la successiva osservazione.

4. Acquisizione di immagini

  1. Trasferire una larva sul vetrino ogni volta, mantenendo la larva nel mezzo della goccia di liquido.
  2. Osserva le larve al microscopio stereo.
  3. Accendere la fotocamera, aprire il software (vedere la tabella dei materiali) e mantenere le impostazioni predefinite.
  4. Fare clic su AE e scegliere un tempo di esposizione appropriato (60 ms in questo esperimento) per ottenere l'immagine migliore.
  5. Cattura tutte le immagini con le stesse impostazioni. Salvate le immagini in formato .tif per un'analisi successiva.

5. Analisi delle immagini

NOTA: vedere il file supplementare per un esempio con una serie di grafici di esempio per l'analisi delle immagini.

  1. Fare doppio clic sull'icona di ImageJ e analizzare le immagini salvate nel passaggio 4.5.
    1. Clicca su File | Aprire per aprire le immagini salvate nel passaggio 4.5.
    2. Clicca sull'immagine | Digitare, selezionare 8 bit.
    3. Clicca su Modifica | Inverti.
    4. Clicca su Analizza | Calibrare, selezionare OD non calibrato nell'interfaccia popup, selezionare Calibrazione globale nella parte inferiore sinistra dell'interfaccia inferiore e fare clic su OK.
    5. Clicca su Analizza | Imposta scala | Fare clic per rimuovere la scala nell'interfaccia popup, selezionare Globale di seguito e fare clic su OK.
    6. Clicca su Analizza | Imposta misure, seleziona l'area dell'elemento nell'interfaccia popup, seleziona la soglia Limita a di seguito (per misurare solo l'intervallo selezionato) e fai clic su OK.
    7. Clicca sull'immagine | Regola| Soglia, fai scorrere il cursore al centro dell'interfaccia popup per selezionare la soglia appropriata (modifica la soglia per ogni immagine) in modo che siano selezionate tutte le destinazioni da testare in un'immagine, quindi fai clic su Imposta.
    8. Clicca su Analizza | Misura. Registra le date di ciascun gruppo.
  2. Utilizzare ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo di Tukey per analizzare le differenze e impostare il livello di significatività a p < 0,001 (***).

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Risultati

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La colorazione rosso alizarina è un metodo sensibile e specifico per misurare i cambiamenti nella mineralizzazione ossea nelle larve di zebrafish. In questo studio, abbiamo osservato che PbAc ha avuto effetti avversi sulle larve di zebrafish, tra cui morte, malformazione, diminuzione della frequenza cardiaca e riduzione della lunghezza del corpo. Inoltre, le aree dello scheletro minerale delle larve di zebrafish sono state valutate per esaminare la perdita ossea indotta da PbAc. A 9 dpf (Figura 1A

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Discussione

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Il pesce zebra è un modello adatto per studiare la malattia metabolica ossea. Rispetto ai modelli di roditori, i modelli di zebrafish sono relativamente veloci da stabilire e la misurazione della gravità della malattia è più facile. Nelle larve di zebrafish wild-type, la mineralizzazione dello scheletro della testa avviene a 5 dpf e lo scheletro assiale a 7 dpf15. Pertanto, le ossa craniche come PS, OP, CB e NC sono ben sviluppate a 9 dpf. Dopo che le larve sono state completamente decolorate e sb...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81872646; 81811540034; 81573173) e dal Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1 M Tris-HCl (pH = 7,5)Solarbio, Pechino, Cina21per la detenzione del
4% Paraformaldeide Fix SolutionBBI, Shanghai, Cina14tessuti di fissaggio
10x tampone PBSBBI, Shanghai, Cina15per il fissaggio
del 35% H2O2Yonghua, Jiangsu, Cina8rimozione del pigmento
50 mL provetta da centrifugaAKX, Jiangsu, Cina4
95% etanolo anidroEnox, Jiangsu, Cina2decolorazione
Alizarina rossa (purezza 99,5%)Solarbio, Pechino, Cina1colorazione
Incubatore biochimicoYiheng, Shanghai, Cina3allevamento di embrioni di zebrafish
Bilancia elettronicaSartorius, Germania5pesatura delle materie prime solide
Glicerina (purezza 99,5%)BBI,Shanghai,Cina7conservazione del pesce macchiato
ImageJ (software)USA9analisi digitale
KOH (purezza 99,9%)Sigma,America10soluzione sbiancante
Acetato di piombo triidrato (purezza 99,5%)Aladino,Shanghai,Cina11
MgCl2 (Purezza 99,9%)Aladdin,Shanghai,Cina12soluzione detergente
NIS-Elements F (software)Nikon, Giappone13osservare e scattare foto
PipeAKX, Jiangsu, Cina18rimozione di embrioni e piastre di soluzione
(24 pozzetti)Corning,America17contenitore per la colorazione di piastre di embrioni
(6 pozzetti)Corning,America16contenitore per l'allevamento di embrioni
Tavolo vibranteBeyotime, Cina19miscelazione della soluzione
StereomicroscopioNikon, Giappone20osservazione e scatto di foto
ZebrafishZebrafish Experiment Center of Soochow University, Suzhou, Cina22animale da esperimento

Riferimenti

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