Articolo metodologico

Lesioni indotte da laser semi-automatizzate controllate per lo studio della rigenerazione del midollo spinale nelle larve di zebrafish

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DOI:

10.3791/63259

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22 novembre 2021

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1Centre for Discovery Brain Sciences, University of Edinburgh Medical School: Biomedical Sciences, 2Center for Regenerative Therapies at the TU Dresden

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Sommario

Il presente protocollo descrive un metodo per indurre lesioni tessuto-specifiche e altamente riproducibili nelle larve di zebrafish utilizzando un sistema di lesione laser combinato con una piattaforma microfluidica automatizzata per la manipolazione delle larve.

Abstract

Le larve di zebrafish possiedono un sistema nervoso centrale (SNC) completamente funzionale con un'elevata capacità rigenerativa solo pochi giorni dopo la fecondazione. Questo rende questo modello animale molto utile per studiare le lesioni e la rigenerazione del midollo spinale. Il protocollo standard per indurre tali lesioni è quello di transettare manualmente la parte dorsale del tronco. Tuttavia, questa tecnica richiede un ampio allenamento e danneggia i tessuti aggiuntivi. È stato sviluppato un protocollo per le lesioni indotte dal laser per aggirare queste limitazioni, consentendo un'elevata riproducibilità e completezza della transezione del midollo spinale su molti animali e tra diverse sessioni, anche per un operatore non addestrato. Inoltre, il danno tissutale è principalmente limitato al midollo spinale stesso, riducendo gli effetti confondenti derivanti dalla lesione di diversi tessuti, ad esempio pelle, muscoli e SNC. Inoltre, sono possibili emi-lesioni del midollo spinale. Una migliore conservazione dell'integrità dei tessuti dopo una lesione laser facilita ulteriori dissezioni necessarie per ulteriori analisi, come l'elettrofisiologia. Quindi, questo metodo offre un controllo preciso dell'entità della lesione che è irraggiungibile manualmente. Ciò consente nuovi paradigmi sperimentali in questo potente modello in futuro.

Introduzione

A differenza dei mammiferi, il pesce zebra (Danio rerio) può riparare il loro sistema nervoso centrale (SNC) dopo un infortunio1. L'uso di larve di zebrafish come modello per la rigenerazione del midollo spinale è relativamente recente. Si è dimostrato utile studiare i meccanismi cellulari e molecolari alla base della riparazione2. Ciò è dovuto alla facilità di manipolazione, al breve ciclo sperimentale (nuove larve ogni settimana), alla trasparenza ottica dei tessuti e alle piccole dimensioni delle larve, ideali per la microscopia a fluorescenza in vivo .

Nel caso della rigenerazione del midollo spinale, due ulteriori vantaggi dell'utilizzo delle larve sono la velocità di recupero, pochi giorni rispetto a poche settimane per gli adulti, e la facilità di indurre lesioni utilizzando tecniche manuali. Questo è stato utilizzato con successo in molti studi3,4,5, comprese recenti indagini6,7. Nel complesso, ciò porta a una maggiore produzione di dati significativi, un'elevata adattabilità dei protocolli sperimentali e una diminuzione dei costi sperimentali. L'uso di larve di età inferiore ai 5 giorni dopo la fecondazione riduce anche l'uso di animali seguendo i principi 3R nella ricerca sugli animali8.

Dopo una lesione del midollo spinale nelle larve di zebrafish, si verificano molti processi biologici, tra cui la risposta infiammatoria, la proliferazione cellulare, la neurogenesi, la migrazione delle cellule sopravvissute o di nuova generazione, la riforma degli assoni funzionali e un rimodellamento globale dei circuiti dei processi neurali e dei tessuti della colonna vertebrale6,7,9,10 . Per essere orchestrati con successo, questi processi comportano un'interazione finemente regolata tra una gamma di tipi di cellule, componenti della matrice extracellulare e segnali biochimici11,12. Svelare i dettagli di questa significativa riorganizzazione di un tessuto complesso come il midollo spinale richiede l'uso e lo sviluppo di approcci sperimentali precisi e controllati.

Il paradigma sperimentale primario utilizzato per studiare la rigenerazione del midollo spinale nel pesce zebra è quello di utilizzare mezzi chirurgici per indurre danni ai tessuti mediante resezione, pugnalata o crioigiura3,13. Questi approcci hanno lo svantaggio di richiedere una formazione specifica nelle competenze di microchirurgia, che richiede tempo per qualsiasi nuovo operatore e può impedirne l'uso in progetti a breve termine. Inoltre, di solito inducono danni ai tessuti circostanti, che possono influenzare la rigenerazione.

Un altro approccio consiste nell'indurre danni cellulari chimicamente14 o mediante manipolazioni genetiche15. Quest'ultimo consente danni altamente mirati. Tuttavia, tale tecnica richiede un lungo lavoro preparatorio per generare nuovi pesci transgenici prima di fare qualsiasi esperimento, rinnovato ogni volta che viene preso di mira un tipo di cellula unico.

C'è, quindi, la necessità di un metodo che consenta lesioni mirate ma versatili adatte a una varietà di studi sulla rigenerazione. Una soluzione consiste nell'utilizzare un laser per indurre danni localizzati nel tessuto di interesse16,17,18,19,20. In effetti, l'uso del danno tissutale indotto dal laser presenta un approccio robusto per generare lesioni del midollo spinale con molti vantaggi. I microscopi dotati di tali moduli di manipolazione laser consentono di specificare un'area sagomata personalizzata in cui si verificherà l'ablazione cellulare, con l'ulteriore vantaggio del controllo temporale. La dimensione e la posizione della lesione possono quindi essere adattate per rispondere a qualsiasi domanda.

La caratteristica mancante della maggior parte dei sistemi di lesioni laser è la possibilità di indurre lesioni in modo altamente riproducibile per una serie di larve. Qui viene descritto un protocollo originale che utilizza un laser UV per indurre lesioni semi-automatizzate precise e controllate nelle larve di zebrafish basate su una piattaforma microfluidica progettata per la manipolazione automatizzata delle larve21. Inoltre, nel sistema qui presentato, le larve sono inserite in un capillare di vetro, che consente la libera rotazione dell'animale attorno al suo asse rostrocaudale. L'utente può scegliere quale lato della larva presentare al laser, consentendo al contempo l'imaging a fluorescenza per indirizzare con precisione il raggio laser e valutare il danno dopo la lesione.

Il protocollo qui descritto viene utilizzato con un sistema di imaging semi-automatizzato delle larve di zebrafish combinato con un disco rotante dotato di un laser UV (designato di seguito come sistema VAST). Tuttavia, i punti principali del protocollo e la maggior parte delle affermazioni della tecnica sono validi per qualsiasi sistema dotato di un laser in grado di ablazione cellulare, compresi microscopi a scansione laser a due fotoni, microscopi a disco rotante dotati di un laser UV (modulo FRAP) o videomicroscopi con un modulo laser per la manipolazione fotografica. Una delle principali differenze tra il sistema VAST e la gestione convenzionale dei campioni sarà che per quest'ultimo sarà necessario montare larve in agarosio a basso punto di fusione su coperture di vetro / piastre di Petri con fondo di vetro invece di caricarle in una piastra a 96 pozzetti.

I benefici offerti da questo metodo aprono opportunità di ricerca innovativa sui meccanismi cellulari e molecolari durante il processo di rigenerazione. Inoltre, l'elevata qualità dei dati consente indagini quantitative in un contesto multidisciplinare.

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Protocollo

Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti con l'approvazione del Ministero degli Interni del Regno Unito e secondo i suoi regolamenti, sotto la licenza di progetto PP8160052. Il progetto è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Edimburgo. Per le analisi sperimentali, sono state utilizzate larve di zebrafish fino a 5 giorni di entrambi i sessi delle seguenti linee transgeniche disponibili: Tg (Xla.Tubb: DsRed;mpeg1: GFP), Tg (Xla.Tubb: DsRed), Tg (betaactin: utrophin-mCherry), Tg (Xla.Tubb: GCaMP6s) e Tg (mnx1: gfp) (vedi File supplementare 1 relativo alla generazione delle linee transgeniche di zebrafish). Uno schema del protocollo che utilizza la piattaforma automatizzata di gestione delle larve di zebrafish è mostrato nella Figura 1. Tutti i software personalizzati, gli script e i protocolli sperimentali dettagliati utilizzati in questo lavoro sono disponibili presso https://github.com/jasonjearly/micropointpy/.

1. Preparazione del campione

  1. A 5 ore dopo la fecondazione, ordinare gli embrioni per il corretto stadio di sviluppo21. Scartare le uova morte e gli embrioni poco sviluppati e sovrasviluppati.
  2. A 3 giorni dopo la fecondazione (dpf), anestetizzare le larve aggiungendo 2 ml di 0,4% di amminobenzoico-acido-etilmetil-estere a 50 ml di acqua di impianto di pesce in una capsula di Petri da 90 mm. Utilizzare animali allevati con feniltiourea (PTU) (vedi Tabella del materiale) per prevenire la pigmentazione della pelle se si tratta di un problema, che non è il caso di lesioni del midollo spinale su 3 larve dpf descritte in questo protocollo.
    NOTA: Questa concentrazione di anestetico relativamente elevata viene utilizzata per prevenire i movimenti delle larve dopo l'impatto laser.
  3. Esaminare gli embrioni per l'espressione di reporter fluorescente (fascicolo supplementare 1).
    NOTA: Un reporter fluorescente per il midollo spinale (o altra struttura di interesse) è spesso richiesto per valutare l'efficienza della lesione. L'uso di tg(Xla.Tubb:DsRed) aiuta a identificare il midollo spinale.
  4. Trasferire le larve selezionate in una piastra a 96 pozzetti per l'uso nel sistema VAST (vedi Tabella dei materiali) con 300 μL di acqua di impianto per pesci per pozzetto. Utilizzare direttamente il mezzo contenente l'anestetico della capsula di Petri da 90 mm. Assicurati di avere solo una larva per pozzo. Preparare una piastra vuota extra da 96 pozzetti per raccogliere le larve lesionate.
    NOTA: Se si utilizza un altro sistema di lesioni laser, montare le larve in gel di agarosio a basso punto di fusione (LMP) all'1% in una camera di osservazione appropriata.

2. Preparazione del microscopio

  1. Accendere tutti i componenti del sistema (VAST, microscopio, laser, PC), compreso il laser per l'ablazione.
  2. Una volta che l'hardware è completamente inizializzato, avviare il software del microscopio, ImageJ / Fiji, un ambiente di sviluppo integrato python (IDE) e il software di imaging zebrafish automatizzato (sistema VAST) se si utilizza questa piattaforma (vedere Tabella dei materiali).
  3. Configurare il software VAST seguendo i passaggi seguenti.
    1. All'avvio del software VAST, scegliere Piastra nella prima finestra e fare clic sul pulsante Fine (Figura 2A). Un'altra piccola finestra apparirà chiedendo se il capillare è vuoto e pulito. Verificare guardando l'immagine del capillare se ci sono bolle d'aria all'interno. In caso contrario, fare clic su Sì. Se ci sono bolle, fare clic su No e seguire i passaggi 2.3.2-2.3.3 (Figura 2B).
    2. Nella finestra Campionatore di particelle grandi (LP), fare clic su Prime per rimuovere le bolle d'aria (Figura 2C).
    3. Vai alla finestra principale del software (con l'immagine capillare) e fai clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine. Selezionare Registra immagine capillare vuota nel menu a comparsa (Figura 2B).
    4. Nella finestra LP Sampler , vai al menu File e seleziona l'opzione Apri script . Scegli un file contenente lo script corrispondente all'esperimento da eseguire.
    5. Nella finestra principale del software VAST, vai su File e scegli Apri esperimento. Scegliere il file dell'esperimento corrispondente all'esperimento pianificato.
      NOTA: assicurarsi che le caselle Scarico automatico e Uscita in blocco per rifiuti NON siano selezionate.
  4. Impostare il software del microscopio per l'imaging.
    1. Avviare il software di imaging del microscopio (vedere Tabella dei materiali) per inizializzare l'hardware. Questa operazione potrebbe richiedere alcuni minuti, a seconda del sistema.
    2. Vai alle impostazioni di acquisizione e imposta il microscopio per l'imaging del fluoroforo espresso nelle larve. Utilizzare un obiettivo a immersione in acqua NA 0,5 10x per garantire che il volume focale sia abbastanza allungato lungo l'asse ottico da lesionare l'intera profondità del midollo spinale o del tessuto bersaglio.
  5. Impostare ImageJ/Fiji per le lesioni laser.
    1. Vai al menu File , scegli Nuovo/Script per aprire la finestra dello script.
    2. Nella finestra Nuovo , vai al menu File e scegli Apri per caricare lo script della lesione laser (Manual_MP_Operation.ijm).
  6. Configurare l'IDE Python.
    1. Avviare l'IDE Python.
    2. Vai al menu File e scegli Apri file per caricare lo script per gestire il laser (Watch_for_ROIs_py3.py).
    3. Vai al menu Esegui e scegli Esegui senza debug per eseguire lo script. Verificare che venga visualizzata una sequenza di messaggi nel pannello TERMINALE insieme a un po' di rumore durante l'inizializzazione dell'attenuatore laser (Figura 2D).

3. Esecuzione di lesioni laser sul sistema VAST

  1. Centrare il capillare rispetto all'obiettivo del microscopio spostando il palco facendo clic sui pulsanti freccia nella finestra principale del software VAST (Figura 2B).
  2. Concentrati sulla parte superiore del capillare guardando attraverso gli oculari e usando la luce trasmessa dal microscopio.
    ATTENZIONE: Il capillare è molto fragile e può rompersi se toccato dall'obiettivo. Spostare lentamente la manopola del microscopio quando si mette a fuoco dentro e fuori.
  3. Posizionare le piastre a 96 pozzetti sul portatarga del campionatore LP del sistema VAST. Posizionare il piatto contenente larve sul supporto sinistro e il piatto per la raccolta a destra. Assicurarsi che le piastre siano orientate correttamente: il pozzetto A1 deve trovarsi nell'angolo anteriore sinistro del supporto.
  4. Nel software VAST, nella finestra LP Sampler, fare clic sul pulsante Modello di piastra e selezionare tutti i pozzetti contenenti larve. Fare clic sul pulsante OK per convalidare e chiudere la finestra (Figura 2C).
  5. Nella finestra LP Sampler, fai clic sul pulsante Esegui piastra per iniziare a caricare una larva.
    NOTA: Dopo un po 'di tempo, la larva dovrebbe essere visibile nel capillare in posizione (predefinita nel file di definizione dell'esperimento), consentendo di ferire il midollo spinale. La luce del vassoio VAST si spegnerà dopo alcune rotazioni per impostare la larva con il lato laterale rivolto verso l'obiettivo del microscopio.
  6. Vai al software del microscopio e fai clic sul pulsante Live per visualizzare la larva.
  7. Ruotare la manopola di messa a fuoco del microscopio fino a quando il canale centrale del midollo spinale è visibile.
    NOTA: può essere più facile mettere a fuoco prima la luce trasmessa e poi perfezionarla con la fluorescenza.
  8. Scatta un'istantanea in fluorescenza e salva l'immagine in una cartella dedicata.
  9. Aprire l'immagine in ImageJ e regolare il contrasto se necessario (utilizzando il menu Immagine/Regolazione/Luminosità/contrasto... in ImageJ).
  10. Fare clic sullo strumento linea Regione di interesse (ROI) e disegnare una linea corta (20 μm) centrata sul midollo spinale (Figura 3A).
  11. Impostare il microscopio nella posizione dello specchio riflettente al 100%.
  12. Caricare lo script ImageJ e fare clic sul pulsante Esegui . Utilizzare i seguenti parametri: Ripetizione - 2; Campione - 1; Larghezza - 40 micron; Attenuazione - 89 (potenza laser completa) (Figura 3C).
  13. Al termine della sequenza di riprese laser, passare all'imaging a fluorescenza sul software di imaging e, se necessario, regolare la messa a fuoco.
    NOTA: si osserva spesso uno spostamento della messa a fuoco a causa dello spostamento della coda durante l'esposizione laser.
  14. Scatta una nuova istantanea e salvala.
  15. Apri questa nuova immagine in ImageJ e disegna una nuova linea che dovrebbe essere più grande del midollo spinale stesso (~ 80 μm), iniziando sotto il lato ventrale del midollo spinale nella parte superiore della notocorda e andando verso il lato dorsale per terminare nello spazio tra il midollo spinale e la pelle (Figura 3B).
  16. Impostare il microscopio nella posizione dello specchio riflettente al 100%.
  17. Vai alla finestra dello script ImageJ e fai clic sul pulsante Esegui . Utilizzare i seguenti parametri: Ripetizione - 2; Campione - 1; Larghezza - 40 micron; Attenuazione - 89 (potenza laser completa).
  18. Al termine della sequenza di riprese laser (più lunghe), verificare la qualità della trasezione mediante fluorescenza e messa a fuoco dell'immagine. Assicurarsi che nessuna cellula o assone rimanga intatto nel sito della lesione, che dovrebbe apparire come un'area fluorescente scura o come un'area fluorescente debole e omogenea (Figura 3D, pannello inferiore).
  19. Raccogli le larve lesionate nella piastra vuota a 96 pozzetti (con le stesse coordinate del pozzo originale) andando alla finestra principale del software VAST e facendo clic sul pulsante Raccogli .
  20. Riaccendi la spia del sistema VAST facendo clic sulla casella di controllo Luce vassoio in basso a sinistra della finestra.
  21. Ripeti i passaggi 3.3-3.17 per ogni nuova larva da ferire.

4. Gestione post-lesione ed esperimenti aggiuntivi

  1. Estrarre le larve dal piatto a 96 pozzetti il prima possibile e trasferirle in una capsula di Petri pulita con acqua fresca per le larve per recuperare la post-lesione. Mettere la capsula di Petri in un'incubatrice a 28 °C.
    NOTA: Il danno spesso continua a propagarsi nella prima ora dopo la lesione. L'effettiva estensione della lesione deve quindi essere valutata mediante imaging a fluorescenza dopo un ritardo di circa 1 ora.

5. Risoluzione dei problemi

  1. Se le bolle d'aria sono presenti nei tubi e nei capillari del sistema VAST, fare clic sul pulsante Prime nella finestra LP Sampler per rimuoverle.
  2. Considerare le lesioni non riuscite (valutate dalla fluorescenza rimanente nel sito della lesione, a parte il residuo atteso e lo sfondo omogeneo), che possono essere dovute a diversi motivi menzionati di seguito.
    1. Bassa potenza laser: quando ciò accade, prova con un valore più alto.
      NOTA: Il sistema VAST è dotato di un laser colorante. Ciò implica che la concentrazione della soluzione colorante utilizzata per la generazione di luce laser può cambiare nel tempo, portando a una diminuzione della potenza del laser. La sostituzione con una nuova soluzione di solito risolve il problema22.
    2. Calibrazione scadente: quando ciò accade, verificare la calibrazione e la potenza del sistema laser come da passaggio 5.2.2.1-5.2.2.4. Se non calibrato correttamente, il laser non sarà diretto verso la posizione desiderata, portando così a lesioni infruttuose o danni indesiderati nei tessuti adiacenti.
      1. Posizionare una diapositiva a specchio sopra la camera capillare. Concentrati sul lato rivestito (dovrebbe essere rivolto verso l'obiettivo). Utilizzare un valore predefinito precedente nella diapositiva per mettere a fuoco più facilmente.
      2. Applicare un modello di ablazione laser utilizzando uno script di calibrazione.
      3. Valutare la qualità del modello. Le macchie o le linee dovrebbero apparire nitide e non sfocate.
      4. Utilizzare una rampa con potenza crescente per valutare se la potenza del laser è cambiata rispetto alle sessioni precedenti.
    3. Movimento larvale durante le lesioni: le larve rispondono in modo diverso all'anestesia; pertanto, la lesione laser può innescare movimenti della coda durante il processo, impedendo così una trasezione di successo. Quando ciò accade, eseguire un'ulteriore iterazione delle fasi della lesione laser per completarla evitando comunque danni ai tessuti circostanti.
    4. Cattiva messa a fuoco: quando ciò si verifica, concentrati sul centro del canale centrale per ottenere i migliori risultati.
    5. Disegno, posizione e dimensione del ROI: la posizione e le dimensioni del ROI sono fondamentali per il successo delle transezioni. Il ROI dovrebbe essere maggiore del midollo spinale e centrato sul centro del midollo spinale. Per risolvere questo problema, inizia a disegnare il ROI dal lato ventrale del midollo spinale e sali verso il lato dorsale per ottenere una trasezione di successo. Ciò è probabilmente dovuto ai movimenti della coda innescati dalla sequenza di colpi laser durante la procedura di ablazione.

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Risultati

Validazione della transezione del midollo spinale
Sono state eseguite indagini strutturali e funzionali per valutare se il protocollo consente una completa traslazione del midollo spinale.

In primo luogo, per verificare che la perdita di fluorescenza nel sito della lesione fosse dovuta al danno del tessuto neuronale e non alla fotosbiancamento a fluorescenza dall'illuminazione laser, è stata eseguita l'immunocolorazione utilizzando un anticorpo contro la tubulina acetilata ...

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Discussione

C'è un urgente bisogno di una comprensione più profonda dei processi in gioco durante la rigenerazione nel pesce zebra. Questo modello animale offre molti vantaggi per la ricerca biomedica, in particolare per le lesioni del midollo spinale1. La maggior parte degli studi riguarda lesioni manuali che richiedono un operatore ben addestrato e inducono danni multi-tessuto. Qui viene presentato un protocollo di lesione laser, che consente il controllo delle caratteristiche della lesione e la riduzione d...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato supportato dal BBSRC (BB/S0001778/1). CR è finanziato dal Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Programme. Ringraziamo David Greenald (CRH, Università di Edimburgo) e Katy Reid (CDBS, Università di Edimburgo) per il gentile dono del pesce transgenico (Vedi file supplementare). Ringraziamo Daniel Soong (CRH, Università di Edimburgo) per il gentile accesso alla confocale a disco rotante 3i.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Software
Software per microscopio Zen Blue 2.0Carl Zeiss
ImageJ/FIJIOpen-Source
Microsoft
Microscopio e accessori
ApoTomeCarl Zeiss
C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) lente a immersioneCarl Zeiss
doppia AxioCam 506 m telecamere CCDCarl Zeiss Microscopio confocale a scansione laser Carl Zeiss
LSM880Carl Zeiss
Modulo disco rotante CSU-X1Yokogawa
Microscopio verticaleAxio Examiner D1Carl Zeiss
Laser UVMicropoint
VAST BioImagerUnion Biometrica
Labware
90 mm Piastra di PetriThermo-Fisher101R20
Piastra a 96 pozzettiCorning3841
Chemicals
Kit di imaging Click-It EdUInvitrogenC10637
acido aminobenzoico-etil metil-estere (MS222)Sigma-AldrichA5040
feniltiourea (PTU)Sigma-AldrichP7629
Anticorpi
Donkey anti-pollo Alexa Fluor 488Jackson703-545-155
Asino anti-topo Cy3Jackson715-165-150
Topo anti-GFPAbcamAB13970
Topo anticorpo acetilato anti-tubulinaSigmaT6793
Transgenic zebrafish lines
Tg(beta-actin:utrophin-mCherry)N/AStabilito da David Greenhald, Università di Edimburgo
Tg(mnx1:gfp)N/A Descrittoper la prima volta in [Flanagan-Steet et al. 2005]
Tg(Xla.Tubb:DsRed)N/ADescritto per la prima volta in [Peri e Nusslein-Volhard 2008]
Tg(Xla.Tubb:DsRed; mpeg1:GFP)N/AStabilito da Katy Reid, Università di Edimburgo
Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)N/AIstituito da David Greenhald, Università di Edimburgo
Codice Visual Studio

Riferimenti

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Errata corrige


Formal Correction: Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
Posted by JoVE Editors on 4/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. The title was updated.

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Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

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Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

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Lesione indotta da laserLesione controllataSistema nervoso centraleImaging del calcioImmunoistochimicaElettrofisiologiaImaging a fluorescenzaReclutamento dei macrofagi

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