Espressione batterica e purificazione della metalloproteinasi-3 della matrice umana mediante cromatografia di affinità

Sommario

La purificazione, la dialisi e l'attivazione di His-tag sono impiegate per aumentare le rese di espressione proteica del dominio catalitico solubile e a matrice attiva metalloproteinasi-3 nei batteri. Le frazioni proteiche vengono analizzate tramite gel SDS-PAGE.

Abstract

Le metalloproteinasi della matrice (MMP) appartengono alla famiglia delle proteasi della metzincina con ruoli centrali nella degradazione e nel rimodellamento della matrice extracellulare (ECM), nonché nelle interazioni con diversi fattori di crescita e citochine. La sovraespressione di MMP specifiche è responsabile di diverse malattie come il cancro, le malattie neurodegenerative e le malattie cardiovascolari. Le MMP sono state recentemente al centro dell'attenzione come bersagli per sviluppare terapie in grado di trattare malattie correlate alla sovraespressione di MMP.

Per studiare il meccanismo MMP in soluzione, sono necessari metodi di espressione e purificazione delle proteine ricombinanti più facili e robusti per la produzione di MMP attive e solubili. Tuttavia, il dominio catalitico della maggior parte delle MMP non può essere espresso in Escherichia coli (E. coli) in forma solubile a causa della mancanza di macchinari post-traduzionali, mentre i sistemi di espressione dei mammiferi sono solitamente costosi e hanno rese inferiori. Gli organismi di inclusione MMP devono subire il noioso e laborioso processo di purificazione e ripiegamento estensivo, riducendo significativamente la resa delle MMP in conformazione nativa. Questo documento presenta un protocollo che utilizza le cellule Rosetta2(DE3)pLysS (di seguito denominate R2DP) per produrre il dominio catalitico della metalloproteinasi-3 della matrice (MMP-3cd), che contiene un N-terminal His-tag seguito da pro-domain (Hisx6-pro-MMP-3cd) da utilizzare nella purificazione dell'affinità. Le cellule R2DP migliorano l'espressione delle proteine eucariotiche attraverso un plasmide resistente al cloramfenicolo contenente codoni normalmente rari nei sistemi di espressione batterica. Rispetto alla tradizionale linea cellulare scelta per l'espressione proteica ricombinante, BL21 (DE3), la purificazione con questo nuovo ceppo ha migliorato la resa di Hisx6-pro-MMP-3cd purificato. Al momento dell'attivazione e della desalinizzazione, il dominio pro viene scisso insieme all'N-terminal His-tag, fornendo MMP-3cd attivo per l'uso immediato in innumerevoli applicazioni in vitro . Questo metodo non richiede attrezzature costose o proteine di fusione complesse e descrive la rapida produzione di MMP umane ricombinanti nei batteri.

Introduzione

La maggior parte delle proteine eucariotiche complesse subisce elaborate modificazioni post-traduzionali dopo l'espressione, che richiedono un ripiegamento proteico altamente assistito e co-fattori per essere ^funzionali1. La produzione di grandi quantità di proteine umane solubili in un ospite batterico rimane una sfida significativa a causa dei costi elevati e della mancanza di solidi metodi di espressione e purificazione, anche per esperimenti di laboratorio su scala ^ridotta2,3. Le MMP, endopeptidasi umane con grande peso molecolare, sono solitamente espresse come corpi di inclusione ....

Protocollo

1. Espressione MMP

1. Clonazione e trasformazione di pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd in celle R2DP
   1. Digerire il plasmide pET-3a (vedere la tabella dei materiali) con gli enzimi di restrizione NdeI e BamHI nel digest buffer (vedere la tabella dei materiali). In un volume totale di reazione di 40 μL, aggiungere 4 μL di Digest Buffer, 33 μL di plasmide 100 ng/μL e 1,5 μL di ciascun enzima di restrizione e lasciare che la reazione proceda per ~2 h fino al completamento a 37 °C.
   2. Eseguire una reazione PCR sulla sequenza MMP-3cd per inserire un His-tag N-terminale. Utilizzare 25 μL di PCR Mix (vedere la

Risultati

Quando si eseguono campioni su SDS-PAGE, poiché la proteina è espressa sotto forma di corpi di inclusione insolubili, le frazioni lisate e sonicate dovrebbero contenere poco o nessun estratto di Hisx6-pro-MMP-3cd, poiché la proteina non è ancora stata risolubilizzata nell'urea. La Figura 3 confronta le frazioni di eluizione di purificazione His-tag di Hisx6-pro-MMP-3cd da celle BL21(DE3) e celle R2DP. Le frazioni di eluizione sono state raggruppate separatamente per entrambe le cellule BL21 .......

Discussione

La produzione su larga scala di MMP solubili, umane e ricombinanti rimane un compito impegnativo. Le cellule di mammifero possono esprimere MMP funzionali a costi elevati e lunghi tempi di attesa, mentre E. coli produce rapidamente elevate quantità di corpi di inclusione MMP che devono essere purificati e ripiegati11,16. Le celle R2DP aumentano significativamente la resa degli organismi di inclusione MMP, consentendo un processo di ripiegamento MMP più e.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,22 µ m filtro sterile	Sigma Aldrich	SLGP033RS	Utilizzato per rimuovere alcuni contaminanti dall'estratto proteico prima della purificazione e prevenire l'intasamento della colonna Ni-NTA
Palloni da 1 L Thermo	Fisher Scientific S76106F		n/a
Flaconi in vetro da 1 L	Thermo Fisher Scientific	06-414-1D	n/a
Provette per microfuge da 1,5 mL	Thermo Fisher Scientific	02-682-002	n/a
Provette coniche da 15 mL	Thermo Fisher Scientific	339650	n/a
18 G, ago smussato da 1 pollice	Amazon	B07S7VBHM2	Utilizzato in combinazione con la cassetta per dialisi
Colonna di desalinizzazione da 2 mL	Thermo Fisher Scientific	89890	Rimuove l'APMA dopo l'attivazione
dell'acido 2-(N-morfolino)etansolfonico (MES)	Thermo Fisher Scientific	AAA1610422	n/a
Cuscini per bottiglie coniche da 250 mL	Thermo Fisher Scientific	05-538-53A	Stabilizzare le bottiglie coniche durante la centrifugazione di grandi volumi
Bottiglie coniche da 250 mL	Thermo Fisher Scientific	05-538-53	n/a
Cella agitata da 400 mL	Sigma Aldrich	UFSC40001	Riconcentra un volume molto maggiore rispetto all'unità di filtro centrifuga. Le cellule Rosetta2(DE3)pLysS producono elevati volumi di proteine che possono superare il limite di 15 mL dell'unità di filtro centrifugo
Acetato di 4-amminofenilmercurico (APMA)	Sigma Aldrich	A9563-5G	Attiva MMP-3 scindendo la
siringa da 5 mL	Thermo Fisher Scientific	NC0829167	Utilizzato in combinazione con la cassetta per dialisi
Provette coniche da 50 mL	Thermo Fisher Scientific	339650	Utilizzato per la conservazione in molte fasi di purificazione
Provetta di riconcentrazione da 50 mL	Sigma Aldrich	UFC901024D	Utilizzato per la riconcentrazione di campioni proteici dopo la dialisi o per la rimozione di contaminanti
Agar	Thermo Fisher Scientific	BP1423-500	Ingrediente tampone che solidifica i terreni LB autoclavati dopo il raffreddamento
Ampicillina	Thermo Fisher Scientific	BP1760-25	Antibiotico utilizzato con il vettore pET3a; usato a 100 & micro; g/mL in terreni LB
BamHI	NEB	R3136S	Enzima di restrizione da utilizzare con il vettore pET3a
Cloruro di calcio (CaCl2)	Thermo Fisher Scientific	600-30-23	Lo ione calcio stabilizza la struttura delle MMP
Divaricatori cellulari	Thermo Fisher Scientific	50-189-7544	Può essere utilizzato per diffondere le cellule su una capsula di Petri dopo la trasformazione
Cloramfenicolo	Thermo Fisher Scientific	22-055-125GM	Antibiotico utilizzato con vettore pET3a; utilizzato a 34 & micro; g/mL in terreni LB
Tampone per dialisi 1	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 &; M ZnCl2, 4 M Urea.
Tampone per dialisi 2	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 &; M ZnCl2, 2 M Urea.
tampone per dialisi 3	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 , 1 µ M ZnCl2.
Clip per dialisi	Thermo Fisher Scientific	68011	Utilizzato in combinazione con tubi per dialisi in pelle di serpente
Tubo per dialisi	Thermo Fisher Scientific	88243	Metodo di dialisi alternativo che contiene volumi di campione molto più grandi, ma con un rischio maggiore di perdita di campione
Tampone digestivo	NEB	B7204S Tampone	utilizzato per digerire il vettore pET3a
Cuvette monouso	Thermo Fisher Scientifico	21-200-257	Utilizzato per misurare l'OD della coltura batterica durante la crescita e l'espressione
Ditiotreitolo (DTT)	Thermo Fisher Scientific D107125G		Assiste con la denaturazione delle proteine riducendo qualsiasi legame disolfuro
Miscela di assemblaggio del DNA	NEB	E2621S	Utilizzato per legare il prodotto PCR Hisx6-pro-MMP-3cd e il vettore pET3a digerito
DNasi I	NEB	M0303S	Endonucleasi per la degradazione di contaminanti sfavorevoli del DNA che potrebbero successivamente influenzare la purificazione delle proteine
Etanolo	Thermo Fisher Scientific	A995-4	n/a
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	J15694-AE	Utilizzato nella denaturazione. Previene l'ossidazione e la successiva formazione di legami disolfuro
Kit di recupero su gel	Promega	A9281	Isola e purifica il DNA dai gel di agarosio
Glicerolo	Thermo Fisher Scientific	G33-500	Utilizzato per la produzione di stock di glicerolo, che vengono congelati a -80 ° C
Colonna a flusso gravitazionale	BioRad	7321010	Utilizzato per la purificazione Ni-NTA di proteine ricombinanti marcate con His-tagging
Cellule ad alta efficienza di trasformazione	NEB	C2987	Cellule ad alta efficienza di trasformazione con maggiori possibilità di successo per la clonazione del tag His-His-terminale n/a n/a del costrutto pET3a-pro-MMP-3cd
Elution Buffer	n/a	/a	20 mM di Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM di NaCl, 6 M di urea, 250 mM di imidazolo. Regolare il pH a 7,4
HT Tampone di equilibratura	n/a	n/a 20	mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 6 M urea. Regolare il pH a 7,4
HT Tampone di rigenerazione	n/a	n/a	20 mM MES, 0,1 M NaCl. Regolare il pH a 5,0
HT Tampone	di lavaggio n/a	n/a 20	mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 25 mM imidazolo. Regolare il pH a 7,4
Acido cloridrico (HCl)	Thermo Fisher Scientific	A144C-212	Utilizzato per tamponare il pH
Imidazole	Thermo Fisher Scientific	AAA1022122	imita il gruppo laterale istidina. Utilizzato per separare le proteine non specificamente leganti dalla proteina bersaglio con tag his:
Buffer corporeo di inclusione	n/a	n/a,	20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0,5 M Urea. Regolare il pH a 8,0
Isopropil-ß-D-tiogalattopiranoside (IPTG)	Thermo Fisher Scientific	FERR0392	Un reagente che induce l'espressione genica bersaglio in pET3a. Produrre aliquote da 0,5 mL 1 M, filtrare sterilizzare e conservare a -20 gradi C
LB Amp CamR media	n/a	n/a	Da versare in un flacone steribile da 1 L o in un pallone da 1 L. Per 1 L, aggiungere 25 g di brodo LB. Sterilizzare in autoclave. Una volta raffreddato a meno di 50 ° C, aggiungere ampicillina a 100 µ g/mL e cloramfenicolo a 34 µ g/mL
LB Amp CamR piastre	n/a	n/a	Da versare in piastre di Petri sterili. Versare fino a coprire completamente il coperchio della capsula di Petri. 1 litro di terreno produce 40-60 piastre. Per 1 L: 25 g di brodo LB, 16 g di Agar. Sterilizzare in autoclave. Una volta raffreddato a meno di 50 ° C, aggiungere ampicillina a 100 µ g/mL e cloramfenicolo a 34 µ g/mL
LB Brodo	Thermo Fisher Scientific	BP1426-2	Premiscelato con triptone, estratto di lievito e cloruro di sodio Tampone
lisi	n/a	n/a	50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0,133 g/mL lisozima, 0,49% v/v Triton X-100. Regolare il pH a 8,0
Lisozima	MP Biomedicals	195303	Utilizzato nell'estrazione delle proteine. Enzima che lisa le pareti cellulari batteriche
Kit Miniprep	Promega	A1330	In caso di successo, estrae il costrutto pET3a-pro-MMP-3cd dai trasformanti
NdeI	NEB	R0111S	Enzima di restrizione da utilizzare con la resina Ni-NTA vettoriale pET3a
	Thermo Fisher Scientific	PI88221	Utilizzato per legare proteine ricombinanti marcate con his. Questa forte interazione può essere spostata con concentrazioni più elevate di imidazolo
Tensioattivo non ionico	Thermo Fisher Scientific	PI28316	Detergente per la conservazione per prevenire l'aggregazione di MMP. Riduce al minimo le interazioni tra i residui idrofobici sulla superficie delle MMP e le molecole d'acqua, senza interrompere l'attività catalitica.
Miscela per PCR	NEB	M0492S	Un reagente PCR per l'inserimento di un his-tag N-terminale nel vettore pET3a-pro-MMP-3cd
pET plasmide	Addgene	n/a	Il vettore pET3a offre resistenza all'ampicillina, espressione inducibile di un gene bersaglio e sequenziamento con primer T7
piastre di Petri	VWR	25384-342	Utilizzato per la placcatura di trasformanti su terreni di agar LB
Cellule R2DP	Novagen	714033	derivati BL21 con aumentata espressione di proteine eucariotiche. Contiene tRNA di codoni che si sono rivelati rari nei
mezzi di crescita SOC	NEB	B9020S	Terreni di crescita non selettivi per una rapida crescita durante la trasformazione
Cloruro di sodio (NaCl)	Thermo Fisher Scientific	BP358-1	Utilizzato nei tamponi e aiuta con la stabilità delle proteine
Desossicolato di sodio	Thermo Fisher Scientific	nell'estrazione	delle proteine. Lissi pareti cellulari
Tampone di solubilizzazione	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Urea. Regolare il pH a 8,0
Tris base	Thermo Fisher Scientific	BP152-1	Tampone comune utilizzato nell'intervallo di pH fisiologico. Detergente
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	M1122980101	alla temperatura utilizzato per la lisi cellulare
Urea	Thermo Fisher Scientific	AAJ75826A7	Primo agente caotropico per l'interruzione della struttura secondaria delle proteine
Cloruro di zinco (ZnCl2)	Thermo Fisher Scientific	AAA162810E	Stabilizza la struttura MMP. Lo ione zinco si trova nel sito catalitico di MMP-3

del propeptide HT n, di di e. coli PI89905 Detergente utilizzato sensibile