Isolamento e caratterizzazione del ficobilisoma intatto nei cianobatteri

Summary

L'attuale protocollo descrive in dettaglio l'isolamento dei ficobilisomi dai cianobatteri mediante centrifugazione attraverso un gradiente di densità discontinuo di saccarosio. Le frazioni di ficobilisomi intatti sono confermate dallo spettro di emissione fluorescente 77K e dall'analisi SDS-PAGE. Le frazioni ficobilisomiali risultanti sono adatte per la colorazione negativa del TEM e l'analisi della spettrometria di massa.

Abstract

Nei cianobatteri, il ficobilisoma è un complesso proteico antenna vitale che raccoglie la luce e trasferisce energia al fotosistema I e II per la fotochimica. Studiare la struttura e la composizione del ficobilisoma è di grande interesse per gli scienziati perché rivela l'evoluzione e la divergenza della fotosintesi nei cianobatteri. Questo protocollo fornisce un metodo dettagliato e ottimizzato per rompere le cellule cianobatteriche a basso costo da un battitore di perline in modo efficiente. Il ficobilisoma intatto può quindi essere isolato dall'estratto cellulare mediante ultracentrifugazione a gradiente di saccarosio. Questo metodo ha dimostrato di essere adatto sia per cianobatteri modello che non modello con diversi tipi di cellule. Viene inoltre fornita una procedura passo-passo per confermare l'integrità e la proprietà delle ficobiliproteine mediante spettroscopia di fluorescenza 77K e SDS-PAGE colorato da solfato di zinco e Coomassie Blue. Il ficobilisoma isolato può anche essere sottoposto ad ulteriori analisi strutturali e compositive. Nel complesso, questo protocollo fornisce un'utile guida di partenza che consente ai ricercatori che non hanno familiarità con i cianobatteri di isolare e caratterizzare rapidamente il ficobilisoma intatto.

Introduction

Il ficobilisoma (PBS) è un enorme complesso pigmento-proteina solubile in acqua che si attacca al lato citoplasmatico dei fotosistemi nelle membrane tilacoidi dei ^{cianobatteri1}. La PBS è composta principalmente da ficobiliproteine colorate e proteine linker ^incolori1,2. Le ficobiliproteine possono essere suddivise in quattro gruppi principali: ficoeritrina, ficoeritrocianina, ficocianina e alloficocianina3. I quattro gruppi principali assorbono diverse lunghezze d'onda dell'energia luminosa nell'intervallo 490-650 nm, che le clorofille hanno assorbito in modo

Protocol

Il Synechocystis sp. PCC 6803, il ceppo modello tollerante al glucosio, è stato ottenuto dal Dr. Chu, Hsiu-An presso Academia Sinica, Taiwan. Leptolyngbya sp. JSC-1, il filamentoso non modello, è stato ottenuto dal Dr. Donald A. Bryant della Pennsylvania State University, USA.

1. Coltura cellulare e raccolta

1. Inoculare le celle Syn6803 o JSC-1 utilizzando un anello di inoculazione metallico in un pallone conico da 100 ml contenente 50 mL di B-HEPES ^medium28. Coltura le cellule a 30 °C sotto 50 μmol fotoni ^{m-2 s-1} (LED a luce bianca) in 1% (v/v) di

Results

Le cellule Syn6803 e JSC-1 sono state coltivate in palloni conici con agitazione costante in mezzo B-HEPES a 30 °C, sotto una luce bianca a LED (50 fotoni μmol ^m-2s-1) in una camera di crescita riempita con l'1% (v/v) di _CO2. Nella fase di crescita esponenziale (_OD750 = ~0,5), le cellule sono state sottocoltate in mezzo fresco con una densità ottica finale _OD750 = ~0,2. Dopo aver raggiunto la fase di crescita esponenziale tardiva (_OD750 = 0,6-0,8), le colt.......

Discussion

Questo protocollo descrive un metodo semplice e standard per isolare PBS intatto in due tipi di cianobatteri, il modello unicellulare Syn6803 e il filamentoso non modello JSC-1. Le fasi critiche del protocollo sono l'omogeneizzazione cellulare e l'ultracentrifugazione su un gradiente di densità discontinuo di saccarosio. Generalmente, la distruzione delle cellule filamentose è più complicata di quelle unicellulari. L'aumento della quantità di materiale di partenza (il peso umido del pellet cellulare) e la ripetizione del.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Perle di vetro da 0,1 mm BioSpec		per l'estrazione PBS
Provetta da centrifugazione da 13 mL	Ultracentrifugazione	Hitachi	13PA
Provetta da centrifugazione da 40 mL	Ultracentrifugazione	Hitachi	40PA
Acido acetico	Merck	8.1875.2500	per Coomassie Blue Colorazione
B-HEPES medium			Un mezzo cianobatterico modificato dal terreno BG-11
Blu brillante R-250	Sigma	B-0149	per Coomassie Colorazione blu
bromofenolo	Wako pure chemical industries	2-291	tampone di caricamento delle proteine
Bilancia elettronica	Radwag	WLC 2/A2/C/2	per la misurazione del peso umido dei pellet cellulari
Spettrofotometro a fluorescenza	Hitachi	F-7000	Spettrofotometro
Glicerolo	BioShop	Gly001.500	tampone di caricamento delle proteine
Centrifuga refrigerata ad alta velocità	Hitachi	CR22N	per scambio di tampone
Leptolyngbya sp. JSC-1			del Dr. Donald A. Bryant presso la Pennsylvania State University, USA.
Accessorio per la misurazione delle basse temperature	Hitachi	5J0-0112	L'accessorio include un contenitore Dewar trasparente per la spettroscopia di fluorescenza 77K.
Metanolo	Merck	1.07018,2511	per colorazione Coomassie Blue
Microcentrifuge	Thermo Fisher	Pico 21	per estrazione PBS
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	Model 607	per estrazione PBS
Fosfato di potassio bibasico	PanReac AppliChem	121512.121	per estrazione PBS
Fosfato di potassio monobasico	PanReac AppliChem	141509.121	per l'estrazione di PBS
Fiala con tappo a vite	BioSpec	10832	per l'estrazione di PBS
SmartView Pro Imager	Major Science	UVCI-2300	per il rilevamento del segnale di colorazione Znic
Dodecil solfato di sodio	Zymeset	BSD101	tampone di caricamento delle proteine
Saccarosio	Zymeset	BSU101	per l'isolamento
di PBSSynechocystis sp. Ceppo tollerante al glucosio PCC 6803			del Dr. Chu, Hsiu-An presso Academia Sinica, Taiwan
Tris	BioShop	TRS 011.1	tampone di caricamento delle proteine
Triton X-100	BioShop	TRX 506.500	per l'estrazione PBS
Filtro centrifugo a membrana Ultra 10 K	UFC901024 Millipore		per la sostituzione
del tamponeFiltro centrifugo a membrana Ultra 3 K	Millipore	UFC500324	per scambio tampone
Ultracentrifuga Spettrofotometro	ultracentrifugazione	Hitachi	CP80WX
Spettrofotometro		Agilent	Cary 60
Solfato di zinco	PanReac AppliChem	131787.121	per colorazione Znic
β-Mercaptoethanol	BioBasic	MB0338	tampone di caricamento proteico