Imaging ad autofluorescenza per valutare il metabolismo cellulare

Sommario

Questo protocollo descrive l'imaging a fluorescenza e l'analisi dei coenzimi metabolici endogeni, della nicotinamide adenina ridotta (fosfato), del dinucleotide (NAD(P)H) e dell'adenina dinucleotide della flavina ossidata (FAD). L'imaging a autofluorescenza di NAD(P)H e FAD fornisce un metodo non distruttivo privo di etichette per valutare il metabolismo cellulare.

Abstract

Il metabolismo cellulare è il processo attraverso il quale le cellule generano energia e molte malattie, incluso il cancro, sono caratterizzate da un metabolismo anormale. Nicotinamide adenina (fosfato) dinucleotide (NAD(P)H) ridotta e flavina adenina dinucleotide ossidata (FAD) sono coenzimi delle reazioni metaboliche. NAD(P)H e FAD mostrano autofluorescenza e possono essere isolati spettralmente da lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione. Entrambi i coenzimi, NAD(P)H e FAD, possono esistere in una configurazione libera o legata alle proteine, ognuno dei quali ha una durata di fluorescenza distinta, il tempo per il quale il fluoroforo rimane nello stato eccitato. L'imaging a vita di fluorescenza (FLIM) consente di quantificare l'intensità di fluorescenza e la durata di NAD(P)H e FAD per l'analisi senza etichetta del metabolismo cellulare. I microscopi a intensità di fluorescenza e durata possono essere ottimizzati per l'imaging di NAD(P)H e FAD selezionando le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione appropriate. Le perturbazioni metaboliche da parte del cianuro verificano i protocolli di imaging ad autofluorescenza per rilevare i cambiamenti metabolici all'interno delle cellule. Questo articolo dimostrerà la tecnica di imaging ad autofluorescenza di NAD(P)H e FAD per misurare il metabolismo cellulare.

Introduzione

Il metabolismo è il processo cellulare di produzione di energia. Il metabolismo cellulare comprende più vie, tra cui glicolisi, fosforilazione ossidativa e glutaminolisi. Le cellule sane utilizzano queste vie metaboliche per generare energia per la proliferazione e la funzione, come la produzione di citochine da parte delle cellule immunitarie. Molte malattie, tra cui i disturbi metabolici, il cancro e la neurodegenerazione, sono caratterizzate da un metabolismo cellulare ^alterato1. Ad esempio, alcuni tipi di cellule tumorali hanno tassi elevati di glicolisi, anche in presenza di ossigeno, per generare molecole per la sintesi di acidi nucleici,....

Protocollo

1. Placcatura cellulare per l'imaging

1. Aspirare il mezzo da un pallone T-75 confluente all'80-90% di cellule MCF-7, sciacquare le cellule con 10 ml di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) e aggiungere 2 ml di tripsina allo 0,25% (1x) per staccare le cellule dal fondo del pallone.
2. Incubare il matraccio a 37 °C per ~4 min. Controllare le cellule al microscopio per confermare il distacco.
3. Aggiungere immediatamente 8 ml di terreno di coltura per disattivare la tripsina.
4. Raccogliere le cellule in un tubo conico (15 ml o 50 ml). Contare le cellule usando un emocitometro.
5. Centrifugare le celle ....

Risultati

La linea cellulare epiteliale del cancro al seno, MCF-7, è stata coltivata in DMEM integrata con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina. Per l'imaging a fluorescenza, le cellule sono state seminate a una densità di 4 × ¹⁰⁵ cellule per piatto di imaging con fondo di vetro da 35 mm 48 ore prima dell'imaging. Le cellule sono state fotografate prima e dopo il trattamento con cianuro utilizzando i protocolli sopra indicati. L'obiettivo dell'esperimento al cianuro è confermare l'isol.......

Discussione

L'intensità di autofluorescenza e l'imaging a vita sono stati ampiamente utilizzati per valutare il metabolismo nelle ^cellule21,55. FLIM è ad alta risoluzione e quindi risolve singole cellule, che è importante per gli studi sul cancro perché l'eterogeneità cellulare contribuisce all'aggressività tumorale e alla resistenza ai farmaci7,39,41,44,45,46,58.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2-deossi-d-glucosio (2-DG)	Sigma	AC111980000; AC111980010; AC111980050;
Antibiotico Antimicrobico (penna-streptococco)	Gibco	15240096
Campioni di cellule Tipo	americano Collezione di colture	N/A	Linea oncologica MCF-7
CellProfiler	Broad Institute	N/A Software	di analisi delle immagini
Tubo conico	VWR	89039-664	Tubo conico da 15 mL
DMEM	ThermoFisher	11965092	Terreni di coltura
Specchio dicroico FAD	Semrock	FF495-Di03-25x36	495 nm
Filtro di emissione FAD	Semrock	FF01-550/88-25	550/88 nm
Filtro di eccitazione FAD	Semrock	FF01-458/64-25	458/64 nm
FBS	ThermoFisher	16000036
Microscopio a fluorescenza 3i		N/A
Piatto inferiore in vetro	MatTek Corp	P35G-1.0-14-C
Laser multifotone	coerente	N/A	Laser coerente 2P, sintonizzabile 680 nm-1080 nm
NAD(P)H specchio dicroico	Semrock	FF409-Di03-25x36	409 nm
NAD(P)H filtro di emissione	Semrock	FF02-447/60-25	447/60 nm
NAD(P)H filtro di eccitazione	Semrock	FF01-357/44-25	357/44 nm
PBS	ThermoFisher	70011044
cianuro di potassio	Sigma-Aldrich	380970
SlideBooks 6	3i	N/A	Software di acquisizione immagini
SPCImage	Becker & Hickl GmbH	N/A	Software per l'analisi del tempo di vita della fluorescenza
Stage Top Incubator	okoLab	N/A
Trypsin	Biosciences	786-262
Urea	Sigma-Aldrich	U5128
YG beads	Polysciences	19096-2	Yg microsfere (20.0 µ m)

AC111980250