Metodo di elettroporazione efficiente ed economico per studiare le vie di segnalazione cilium-dipendenti primarie nel precursore della cella del granulo

Summary

Qui, presentiamo un protocollo di elettroporazione riproducibile in vitro per la manipolazione genetica dei precursori delle cellule del granulo cerebellare primario (GCP) che è economico, efficiente e praticabile. Inoltre, questo protocollo dimostra anche un metodo semplice per lo studio molecolare delle vie di segnalazione primarie del riccio cilio-dipendenti nelle cellule GCP primarie.

Abstract

Il cilio primario è un organello di segnalazione critico che si trova su quasi tutte le cellule che trasducono gli stimoli di segnalazione hedgehog (Hh) dalla superficie cellulare. Nel precursore delle cellule del granulo (GCP), il cilio primario agisce come un centro di segnalazione cardine che orchestra la proliferazione delle cellule precursori modulando la via di segnalazione Hh. Lo studio del meccanismo di segnalazione Hh cilium-dipendente primario è facilitato dalla manipolazione genetica in vitro dei componenti del percorso per visualizzare la loro localizzazione dinamica al cilio primario. Tuttavia, la trasfezione di transgeni nelle colture primarie di GCP utilizzando i metodi di elettroporazione attualmente noti è generalmente costosa e spesso si traduce in bassa vitalità cellulare ed efficienza di trasfezione indesiderata. Questo documento introduce un protocollo di elettroporazione efficiente, economico e semplice che dimostra un'elevata efficienza di trasfezione di ~ 80-90% e una fattibilità ottimale delle celle. Questo è un metodo di modificazione genetica semplice, riproducibile ed efficiente che è applicabile allo studio della via di segnalazione primaria del riccio cilio-dipendente in colture primarie GCP.

Introduction

I GCP cerebellari sono ampiamente utilizzati per studiare il meccanismo della via di segnalazione Hh nei tipi di cellule progenitrici neuronali a causa della loro elevata abbondanza e alta sensibilità alla via di segnalazione Hh in vivo1,2,3,4. Nei GCP, il cilio primario agisce come un hub cardine di trasduzione del segnale ^Hh5 che orchestra la proliferazione delle cellule precursori6,7,8. La visualizzazione in v....

Protocol

Tutte le procedure relative agli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida sulla manipolazione degli animali e il protocollo approvato dal Dipartimento della Salute di Hong Kong. Le licenze per esperimenti sugli animali a seguito dell'ordinanza sugli animali (controllo degli esperimenti) (Cap. 340) sono state ottenute dal Dipartimento della Salute, governo di Hong Kong. Il lavoro sugli animali è stato svolto in conformità con l'etica della sicurezza animale approvata dall'Ufficio ricerche HKBU e dal Comitato per la sicurezza del laboratorio. Fare riferimento alla Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali utilizzati i....

Results

Utilizzando l'Opti-MEM (vedi la Tabella dei materiali) come reagente universale, questa metodologia di elettroporazione proposta potrebbe raggiungere un'efficienza di elettroporazione costantemente elevata a ~ 80-90% (Figura 1). L'efficienza di elettroporazione del vettore Smo-EGFP è stata determinata a DIV 2 post elettroporazione quantificando la percentuale di cellule verdi positive alla fluorescenza in tutte le cellule GCP che esprimono la proteina 6 (Pax6) accoppiata. L'.......

Discussion

La trasfezione di transgeni in coltura GCP primaria con metodo di elettroporazione è tipicamente associata a una bassa vitalità cellulare e a una scarsa efficienza di trasfezione9,10. Questo documento introduce un protocollo di elettroporazione economico e riproducibile che ha dimostrato alta efficienza e fattibilità. Inoltre, dimostriamo anche un metodo semplice per studiare la via di segnalazione Hh primaria cilium-dipendente nelle cellule GCP primarie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
GCP Coltura
B27 integratore	Life Technologies LTD	17504044
Filtro cellulare, 70 &; m	Corning	352350
DNasi I da pancreas bovino	Roche	11284932001
Earle' s Soluzione salina bilanciata	Gibco, Life Technologies	14155063
FBS, qualificato	Thermo Scientific	SH30028.02
GlutamMAXTM-I ,100x	Gibco, Life Technologies	35050061	sostituto della L-glutammina
L-cisteina	Sigma Aldrich	C7352
Matrigel	BD Biosciences	354277	Matrice della membrana basale
Gibco neurobasale	, Life Technologies	21103049
Papaina, sospensione	Worthington Biochemical Corporation	LS003126
Poli-D-lisina Bromidrato	Sigma Aldrich	P6407
SAG	Cayman Chemical	11914-1	Colorazione agonista
IF levigata
Siero bovino Albumina	Sigma Aldrich	A7906
Paraformaldeide	Sigma Aldrich	P6148
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
Miscela di anticorpi primari
Anti-GFP-capra ab	Rockland	600-101-215	Fattore di diluizione: 1 : 1000
del monoclonale del topo anti-Arl13b	ab NeuroMab	75-287	1000
Policlonale di coniglio anti-Pax6 ab	Covance	PRB-278P	Fattore di diluizione: 1: 1000
Miscela di anticorpi secondari
Alexa Fluor 488 asino anti-capra Invitrogen		A-11055	Fattore di diluizione: 1: 1000
Alexa Fluor 555 asino anti-topo IgG	Invitrogen	A-31570	Fattore di diluizione: 1 : 1000
Alexa Fluor 647 asino anti-coniglio	IgG Invitrogen	A-31573	Fattore di diluizione: 1 : 1000
DAPI	Thermo Scientific	62247	Fattore di diluizione: 1 : 1000
Electroporation
CU 500 camera per cuvette	Nepagene	CU500
Cuvetta per elettroporazione EPA (gap 2 mm)	Nepagene	EC-002
Opti-MEM	Life Technologies LTD	31985070	terreno a siero ridotto per trasfezione
pEGFP-mSmo	Addgene	25395
Super Electroporator NEPA21 TYPE II Elettroporazione in vitro e in vivo	Nepagene	NEPA21	electroporator