Assemblaggio e caratterizzazione di un driver esterno per la generazione di flussi oscillatori sub-kilohertz in microcanali

Summary

Il protocollo dimostra un metodo conveniente per produrre un flusso oscillatorio armonico da 10-1000 Hz in microcanali. Questo viene eseguito interfacciando un diaframma dell'altoparlante controllato dal computer al microcanale in modo modulare.

Abstract

La tecnologia microfluidica è diventata uno strumento standard nei laboratori chimici e biologici sia per l'analisi che per la sintesi. L'iniezione di campioni liquidi, come reagenti chimici e colture cellulari, viene effettuata prevalentemente attraverso flussi costanti che sono tipicamente guidati da pompe a siringa, gravità o forze capillari. L'uso di flussi oscillatori complementari è raramente considerato nelle applicazioni, nonostante i suoi numerosi vantaggi, come recentemente dimostrato in letteratura. La significativa barriera tecnica all'implementazione di flussi oscillatori nei microcanali è probabilmente responsabile della mancanza della sua adozione diffusa. Le pompe a siringa commerciali avanzate in grado di produrre flusso oscillatorio, sono spesso più costose e funzionano solo per frequenze inferiori a 1 Hz. Qui viene dimostrato l'assemblaggio e il funzionamento di un apparato a basso costo, basato su altoparlanti di tipo plug-and-play, che genera flusso oscillatorio in microcanali. Flussi oscillatori armonici ad alta fedeltà con frequenze comprese tra 10 e 1000 Hz possono essere raggiunti insieme al controllo indipendente dell'ampiezza. Ampiezze che vanno da 10-600 μm possono essere raggiunte in tutta la gamma di funzionamento, comprese le ampiezze > 1 mm alla frequenza di risonanza, in un tipico microcanale. Sebbene la frequenza di oscillazione sia determinata dall'altoparlante, illustriamo che l'ampiezza dell'oscillazione è sensibile alle proprietà del fluido e alla geometria del canale. In particolare, l'ampiezza dell'oscillazione diminuisce con l'aumentare della lunghezza del circuito del canale e della viscosità del liquido e, al contrario, l'ampiezza aumenta con l'aumentare dello spessore e della lunghezza del tubo dell'altoparlante. Inoltre, l'apparecchio non richiede caratteristiche precedenti per essere progettato sul microcanale ed è facilmente rimovibile. Può essere utilizzato contemporaneamente a un flusso costante creato da una pompa a siringa per generare flussi pulsatili.

Introduction

Il controllo preciso della portata del liquido nei microcanali è fondamentale per le applicazioni lab-on-a-chip come la produzione di goccioline e l'incapsulamento¹, la miscelazione ^2,3 e lo smistamento e la manipolazione delle particelle sospese ^4,5,6,7. Il metodo prevalentemente utilizzato per il controllo del flusso è una pompa a siringa che produce flussi costanti altamente controllati che erogano un volume fisso di liquido o una portata volumetrica fissa, spesso limitata a un flusso interamente unidirezionale. Le strategie alternative per la produzione di flusso unidirezionale includono l'uso della testa gravitazionale⁸, delle forze capillari⁹ o del flusso elettro-osmotico¹⁰. Le pompe a siringa programmabili consentono un controllo bidirezionale dipendente dal tempo delle portate e dei volumi erogati, ma sono limitate a tempi di risposta superiori a 1 s a causa dell'inerzia meccanica della pompa a siringa.

Il controllo del flusso a scale temporali più brevi sblocca una pletora^di 6,11,12,13,14,15 di possibilità altrimenti inaccessibili a causa di cambiamenti qualitativi nella fisica del flusso. Il mezzo più pratico per sfruttare questa variegata fisica del flusso è attraverso onde acustiche o flussi oscillatori con periodi di tempo che vanno da ^10-1- ^10-9 s o 10¹ -10⁹ Hz. L'estremità superiore di questa gamma di frequenze è accessibile utilizzando dispositivi a onda acustica di massa (BAW; 100 kHz-10 MHz) e onde acustiche di superficie (SAW; 10 MHz-1 GHz). In un tipico dispositivo BAW, l'intero substrato e la colonna di fluido vengono vibrati applicando un segnale di tensione attraverso un piezoelettrico legato. Ciò consente rendimenti relativamente elevati, ma si traduce anche in riscaldamento ad ampiezze più elevate. Nei dispositivi SAW, tuttavia, l'interfaccia solido-liquido viene oscillata applicando tensione a una coppia di elettrodi interdigitati modellati su un substrato piezoelettrico. A causa delle lunghezze d'onda molto corte (1 μm-100 μm) particelle piccole come 300 nm possono essere manipolate con precisione dall'onda di pressione generata nei dispositivi SAW. Nonostante la capacità di manipolare piccole particelle, i metodi SAW sono limitati alla manipolazione delle particelle locali poiché l'onda si attenua rapidamente con la distanza dalla sorgente.

Nella gamma di frequenza 1-100 kHz, i flussi oscillatori sono solitamente generati utilizzando piezo-elementi che sono legati a un microcanale di polidimetilsilossano (PDMS) sopra una cavità progettata^16,17. La membrana PDMS sopra la cavità modellata si comporta come una membrana vibrante o un tamburo che pressurizza il fluido all'interno del canale. A questa gamma di frequenze, la lunghezza d'onda è maggiore della dimensione del canale, ma le ampiezze della velocità di oscillazione sono piccole. Il fenomeno più utile in questo regime di frequenza è la generazione di flussi di flusso acustico/viscoso, che sono flussi costanti rettificati causati dalla non linearità inerente al flusso di liquidi con inerzia¹⁸. I flussi di flusso costante si manifestano tipicamente come vortici controrotanti ad alta velocità in prossimità di ostacoli, spigoli vivi o microbolle. Questi vortici sono utili per miscelare^19,20 e separare particelle di dimensioni 10 μm dal flusso^{di flusso 21}.

Per le frequenze nell'intervallo 10-1000 Hz, sia la velocità della componente oscillatoria che il suo flusso viscoso costante associato sono considerevoli in grandezza e utili. Forti flussi oscillatori in questa gamma di frequenze possono essere utilizzati per la messa a fuoco inerziale²², facilitano la generazione di goccioline²³ e possono generare condizioni di flusso (numeri di Womersley) che imitano il flusso sanguigno per studi in vitro . D'altra parte, i flussi di streaming sono utili per la miscelazione, l'intrappolamento delle particelle e la manipolazione. Il flusso oscillatorio in questa gamma di frequenze può anche essere realizzato utilizzando un elemento piezoelettrico legato al dispositivo come descritto sopra²³. Un ostacolo significativo all'implementazione di flussi oscillatori attraverso un elemento piezoelettrico legato è che richiede che le caratteristiche siano progettate in anticipo. Inoltre, gli elementi degli altoparlanti incollati non sono staccabili e un nuovo elemento deve essere incollato a ciascun dispositivo²⁴. Tuttavia, tali dispositivi presentano il vantaggio di essere compatti. Un metodo alternativo consiste nell'utilizzare una valvola a relè elettromeccanica²⁰. Queste valvole richiedono sorgenti di pressione pneumatiche e software di controllo personalizzato per il funzionamento e quindi aumentano la barriera tecnica al collaudo e all'implementazione. Tuttavia, tali dispositivi consentono l'applicazione dell'ampiezza e della frequenza di pressione impostate.

In questo articolo, viene descritta la costruzione, il funzionamento e la caratterizzazione di un metodo user-friendly per generare flussi oscillatori nella gamma di frequenze di 10-1000 Hz nei microcanali. Il metodo offre numerosi vantaggi come l'assemblaggio economico, la facilità d'uso e la predisposizione per l'interfaccia con canali e accessori microfluidici standard come pompe a siringa e tubi. Inoltre, rispetto ai precedenti approcci simili²⁵, il metodo offre all'utente un controllo selettivo e indipendente delle frequenze e delle ampiezze di oscillazione, compresa la modulazione tra forme d'onda sinusoidali e non sinusoidali. Queste caratteristiche consentono agli utenti di implementare facilmente flussi oscillatori e, quindi, facilitano l'adozione diffusa in una vasta gamma di tecnologie e applicazioni microfluidiche attualmente esistenti nei campi della biologia e della chimica.

Protocol

1. Progettazione e fabbricazione rapida di stampi prototipali

1. Aprire AutoCAD su un PC. Selezionare File sulla barra delle applicazioni, quindi selezionare Apri e individuare e fare clic su un file di modello tridimensionale (3D) dello stampo del canale con estensione .dxf o .dwg.
2. Selezionate l'intero modello facendo clic su di esso e trascinando una casella attorno ad esso. Esportare il progetto come file con estensione stl selezionando File | Esporta, quindi Altri formati e scegliendo .stl dalla casella a discesa. 
3. Carica il file su una stampante stereolitografica a resina (SLA) ad alta precisione come Formlabs FORM3. Versare la resina nella camera di resina e avviare la stampa e produrre lo stampo con i più piccoli gradini dell'asse z (25 micron per la resina Formlabs CLEAR).
4. Attendere il completamento della stampa automatica delle parti.
   NOTA: gli stampi con caratteristiche di soli 0,1 mm possono essere fabbricati in questo modo.
5. Dopo aver rimosso la parte dalla resina, agitarla in isopropanolo per 5 minuti per rimuovere la resina rimanente.
6. Asciugare lo stampo con aria o azoto gassoso per 2 min.
   NOTA: Le fabbricazioni di stampi microfluidici convenzionali con wafer di silicio e la fotolitografia con qualsiasi fotoresist SU8 o KMPR possono anche essere utilizzate per produrre uno stampo con caratteristiche più piccole.
7. Polimerizzare lo stampo essiccato a 60 °C in luce UV per un massimo di 1 ora.

2. Fabbricazione di microcanali PDMS

1. Posizionare lo stampo su un foglio di alluminio. Per facilitare la delaminazione del PDMS, rivestire a spruzzo lo stampo con rilascio dello stampo in silicone in 1 o 2 passaggi.
2. Versare la resina PDMS e il reticolante in una tazza usa e getta nel rapporto di 10: 1 in peso e mescolare con un cucchiaio usa e getta.
3. Versare la miscela risultante sullo stampo per produrre un film di spessore richiesto. Per evitare deformazioni della parete del canale di grandi dimensioni, mantenere uno spessore PDMS superiore a 5 mm o 3-4 volte lo spessore massimo della feature.
4. Posizionare lo stampo con PDMS versato nella camera di degas e chiudere il coperchio. Assicurarsi che l'O-ring sigilli ermeticamente la camera.
5. Chiudere la valvola di scarico e accendere la pompa grezza per vuoto per avviare il degasaggio.
6. Degassare la miscela versata in una pompa per vuoto per oltre 4-6 cicli con ogni ciclo della durata di circa 5 min. Rimuovere manualmente le bolle rimanenti (negli angoli e nelle trincee) usando un filo sottile.
7. Impostare la temperatura del forno a 80 °C e lasciarlo preriscaldare. Mettere la miscela in forno a 80 °C per 2 ore per polimerizzare.
8. Rimuovere lo stampo indurito dal forno e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente per 10 minuti.
9. Usando un bisturi, ritaglia con cura i bordi dello stampo. Per una delaminazione ottimale, utilizzare una siringa per iniettare isopropanolo tra lo stampo e il PDMS indurito.
10. Staccare il PDMS indurito dallo stampo e tagliarlo in singoli dispositivi con una lama di rasoio. Le dimensioni di ciascun dispositivo devono variare da 10 mm x 10 mm a 30 mm x 70 mm per essere incollate con la slitta di vetro.
11. Praticare un foro di 1,0-3,0 mm di diametro all'ingresso e all'uscita utilizzando un punzone per biopsia.
12. Accendere il generatore di plasma a radiofrequenza (RF) portatile. Per attivare il vetrino, passare costantemente l'elettrodo a filo su una slitta di vetro asciutta e pulita più volte per 2 minuti. Mantenere uno spazio tra filo e vetro di circa 5 mm. Posizionare il lato del dispositivo del PDMS indurito a contatto con il vetrino attivato e quindi posizionarlo in un forno a 80 °C per 2 ore.
13. Tagliare i tubi di ingresso e di uscita in polietilene alla lunghezza richiesta e inserirli nei fori di ingresso e di uscita.
14. Per evitare il distacco del tubo durante il funzionamento, applicare il sigillante siliconico sulla superficie di contatto e lasciare polimerizzare per 2 ore per fissare il tubo.

3. Assemblaggio del driver oscillatorio

1. Blocca le estremità della clip a coccodrillo di una coppia di fili alligatore-pin ai terminali di un altoparlante. Qui è stato utilizzato un altoparlante da 15 W con un cono di 8 cm, anche se possono essere utilizzati anche altri altoparlanti.
2. Posizionare il chip del controller aux su un contenitore isolante. Inserire le estremità del perno nelle prese a vite del chip del controller aux e stringere saldamente con un cacciavite per garantire la connettività.
3. Collegare un'estremità di un cavo aux al chip del controller e l'altra estremità a una porta aux su un computer o uno smartphone.
4. Collegare un adattatore per corrente continua (DC) da 12 V all'alimentatore. Accendere il chip del controller collegando l'estremità coassiale dell'adattatore CC alla presa di corrente.
5. Utilizzando un browser Internet, accedere a un sito Web generatore di toni online (ad esempio, https://www.szynalski.com/tone-generator/ ).
6. Digitare la frequenza desiderata (5-1200 Hz) nell'applicazione online. Scorrere la barra del volume fino alla quantità richiesta (ad esempio, 100%).
7. Fare clic sul simbolo Generatore di tipo onda e selezionare la forma d'onda desiderata (seno, quadrato, triangolo, dente di sega). Si noti che il valore predefinito è una forma d'onda sinusoidale. Premere Riproduci per azionare l'altoparlante.

4. Assemblaggio dell'adattatore

NOTA: l'intero gruppo adattatore altoparlante-tubo è illustrato dallo schema illustrato nella Figura 1.

1. Fissare l'altoparlante (Figura 1(I)) sul supporto per altoparlanti stampato in 3D (Figura 1(II)) (vedere speakermount.stl nel file supplementare 1) attaccando un nastro sulla superficie curva e su entrambi i lati del supporto.
2. Orientare l'altoparlante verticalmente con la superficie del cono dell'altoparlante rivolta verso l'alto. Posizionare l'adattatore stampato in 3D (Figura 1 (III)) (vedere speakertubeadapter.stl nel file supplementare 2) in modo concentrico sul cono dell'altoparlante.
3. Applicare generosamente il sigillante siliconico lungo i bordi dell'adattatore e lasciare polimerizzare per 2 ore.
4. Posizionare l'altoparlante e il supporto dell'altoparlante sul palco del microscopio e abbassare il nastro adesivo per impedire il movimento durante il funzionamento.
5. Tagliare una punta di micro-pipetta da 200 μL a circa 2 cm dalla sua estremità stretta e disporre della metà più ampia della punta. L'estremità conica stretta fungerà da sigillo a cuneo per l'attacco reversibile.
6. Collegare il tubo di polietilene (Figura 1(V)) all'uscita del microcanale (Figura 1(VI)) prima filettando attraverso la punta della micropipetta (Figura 1(IV)), quindi attraverso l'estremità coassiale dell'adattatore e infine attraverso il lato.
7. Incuneare saldamente l'estremità stretta della punta della pipetta nell'estremità coassiale dell'adattatore per creare una tenuta ermetica rimovibile.

5. Funzionamento del setup sperimentale per flussi oscillatori in microcanali

1. Aggiungere particelle traccianti in un flaconcino di soluzione di glicerolo al 22% peso/peso (p/p) per produrre una sospensione a galleggiamento neutro con una frazione volumetrica dello 0,01%-0,1% di polistirene in liquido a 20 °C. Mescolare vigorosamente agitando per produrre una sospensione omogenea.
2. Caricare una siringa di ingresso da 1 mL con 1 mL di campione. Montare e fissare la siringa caricata su una pompa a siringa automatica. Inserire l'ago della siringa nel tubo di ingresso del dispositivo per creare una tenuta stagna.
3. Assicurarsi che il tubo di uscita sia instradato attraverso l'assieme adattatore e in un serbatoio (vedere la sezione precedente sull'assemblaggio dell'adattatore).
4. Accendere la pompa della siringa. Utilizzando il touch screen, selezionare il tipo di siringa come Becton-Dickinson 1 mL. Quindi, seleziona Infondere. Quindi selezionare la portata richiesta (0-1 mL/min) o il volume di portata (< 1 mL).
5. Avviare il flusso costante utilizzando la pompa a siringa. Attendere che il volume sufficiente di fluido sia fluito e che il tubo di uscita sia pieno di liquido fino all'altoparlante.
   NOTA: l'ampiezza oscillatoria per una determinata impostazione non varierà con il flusso di trasporto costante se il tubo di uscita è innescato.
6. Selezionare una frequenza, un'ampiezza e una forma d'onda richieste nell'applicazione del generatore di toni come descritto nel passaggio 3.5 e premere Play per generare un flusso oscillatorio all'interno del microcanale.

6. Osservazione e misurazione dell'ampiezza

1. Montare il dispositivo sul microscopio. Impostare la configurazione ottica selezionando un obiettivo con un ingrandimento compreso tra 10x e 40x regolando il piano focale e posizionando il palco.
2. Per ottenere misurazioni su un piano focale ben definito, assicurarsi che la profondità di campo dell'obiettivo sia inferiore alla profondità del canale di un fattore di 5 o più.
3. Per osservare il flusso oscillatorio, utilizzare una telecamera ad alta velocità con un frame rate di almeno il doppio della frequenza di oscillazione calcolata utilizzando il teorema di campionamento di Nyquist. Per una risoluzione praticamente utile della forma d'onda, misurare almeno 10 punti per periodo di tempo utilizzando un framerate > 10 volte quello della frequenza di oscillazione.
4. In alternativa, per osservare solo gli effetti rettificati o a lungo termine dei flussi pulsatili, eseguire l'imaging stroboscopico impostando la frequenza di osservazione su qualsiasi divisore perfetto della frequenza di oscillazione.
5. Sia per l'imaging diretto che per quello stroboscopico, utilizzare una fotocamera dotata di un otturatore globale per evitare l'effetto jello. In entrambi i casi, mantenere il tempo di esposizione considerevolmente più piccolo del periodo di oscillazione (di un fattore di 10 o più) per evitare striature.
6. Per misurare l'ampiezza dell'oscillazione senza una telecamera ad alta velocità, registrare a un framerate mantenuto vicino ma non uguale al frame rate stroboscopico (ad esempio, 49 fotogrammi/s per un segnale a 50 Hz). Ciò si traduce in un'oscillazione altamente rallentata da cui è possibile misurare con precisione l'ampiezza.
7. Osservare e registrare le misure di ampiezza.

Results

Per illustrare la capacità e le prestazioni della configurazione di cui sopra, vengono presentati i risultati rappresentativi del flusso oscillatorio in un semplice microcanale lineare con una sezione trasversale quadrata. La larghezza e l'altezza del canale sono 110 μm e la sua lunghezza è di 5 cm. In primo luogo, descriviamo il movimento delle particelle traccianti sferiche di polistirene e come queste possono essere utilizzate per verificare la fedeltà del segnale oscillatorio e la gamma di ampiezze di oscillazione ra...

Discussion

Abbiamo dimostrato l'assemblaggio (vedi protocolli critici 3 e 4) e il funzionamento (vedi protocolli critici passaggi 5 e 6) di un apparato esterno basato su altoparlanti per la generazione di flusso oscillatorio con frequenze comprese tra 10 e 1000 Hz in dispositivi microfluidici. Il tracciamento delle particelle traccianti sospese è necessario per determinare la fedeltà del moto armonico e per calibrare l'intervallo di ampiezze di oscillazione ottenibili nell'intervallo delle frequenze operative. La curva ampiezza-fre...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Driver Oscillatory Driver Assembly
Cavo a coccodrillo-pin	Adafruit	3255	Piccolo morsetto a coccodrillo per ponticello maschio (12)
Cavo Aux	Adafruit	2698	3,5 mm Cavo stereo maschio/maschio 1 m
Chip controller	Damgoo	TPA3116	50w+50w Amplificatore audio a 2 canali (bluetooth e AUX)
DC adattatore	Adafruit	798	12 V DC 1A adattatore di alimentazione switching regolato
Puntale per micropipette	VWR Signature	37001-532	200 ul puntale per micropipette
Sigillante siliconico	Loctite	908570	Sigillante siliconico trasparente impermeabile (80 ml)
Altoparlante	Drok	6843996	4,5 pollici 4 Ohm 40 W
Supporto			per altoparlanteStampato in 3D da 'speakermount.stl' in file supplementari
Adattatore altoparlante-tubo Stampato			in 3D da 'speaketubeadapter.stl' in file supplementari
Microchannel Manufacture
biopsia	Miltex	15110	Punzone per biopsia con stantuffo (1 - 4 mm)
Degasatore
			usa e getta
Cucchiaio
Vetrini	VWR Signature	16004-430	3" x 1" pre clean 1 mm di spessore
Stampo			Si - SU-8 o Forno stampato in 3D
Fischer	Scientific		Isotemp
PDMS resina e reticolante	Dow Chemical	4019862	Sylgard 184 PDMS resina e reticolante (500 g)
Tubo in polietilene	Becton Dickinson Intramedic	427440	Tubo in polietilene (PE 60 - PE 200)
Lamette da barba	VWR	55411-050	Lamette da barba industriali a filo singolo
Generatore di plasma RF	Electro-Technic Products	BD - 20	Generatore ad alta frequenza
Silicone Mold Release	CRC	03301	Rilascio dello stampo in silicone alimentare (16 oz)
Osservazione e caratterizzazione
Fotocamera	Edgertronic		SC2 +
Obiettivo	Nikon		Plan Fluor 10x
Microscopio	Nikon		Ti Eclipse stadio manuale
Aghi	Becton Dickinson	305175	Siringa PrecisionGlide 20G
	Becton Dickinson	1180100555	Monoject 1 ml
Pompa siringa	Harvard Apparatus		Pompa siringa programmabile a doppia siringa
Particelle traccianti	Spherotech	PP-10-10	Particelle traccianti in polistirene 1 um