Questa è una guida passo-passo per l'utilizzo di un sistema di coltura cellulare rotante disponibile in commercio per la coltura di linfociti in microgravità simulata utilizzando vasi di coltura monouso specializzati. Questo metodo di coltura può essere applicato a qualsiasi coltura cellulare di tipo sospensione.
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Articolo metodologico
Coltura di linfociti in microgravità simulata utilizzando un sistema di coltura cellulare rotante
In questo articolo
Sommario
Abstract
Dati gli attuali limiti della conduzione della ricerca biologica nello spazio, esistono alcune opzioni per sottoporre la coltura cellulare alla microgravità simulata (SMG) sulla Terra. Queste opzioni variano nei loro metodi, principi e idoneità per l'uso con colture cellulari in sospensione. Qui, viene descritto un metodo di coltura cellulare per sottoporre i linfociti a microgravità simulata utilizzando un sistema di coltura cellulare rotante disponibile in commercio, noto anche come clinostato 2D o dispositivo di vaso a parete rotante (RWV). Questo metodo di coltura cellulare utilizza il principio della nullificazione del vettore gravitazionale mediato nel tempo per simulare la microgravità ruotando le cellule su un asse orizzontale. Le cellule coltivate in questo sistema possono essere raccolte e utilizzate in molti saggi sperimentali diversi per valutare gli effetti della microgravità simulata sulla funzione cellulare e sulla fisiologia. La tecnica di coltura può variare leggermente a seconda del tipo di cellula o della linea utilizzata, ma il metodo qui descritto può essere applicato a qualsiasi coltura cellulare di tipo sospensione.
Introduzione
È stato dimostrato che il volo spaziale ha un impatto su molti aspetti della fisiologia umana, incluso il sistema immunitario. Molti studi hanno dimostrato prove di disregolazione immunitaria a seguito del volo spaziale in vivo e dell'esposizione alla microgravità simulata (SMG) in vitro 1,2,3,4. Un aspetto importante dell'ambiente spaziale che influisce sulla fisiologia umana è la microgravità. La microgravità si riferisce alla "assenza di peso" sperimentata a causa delle basse forze gravitazionali nell'ambiente ....
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Protocollo
NOTA: I seguenti passaggi devono essere completati all'interno di un armadio di sicurezza biologica sterile.
1. Preparazione di vasi per la coltura cellulare
- Estrarre i recipienti di coltura dall'imballaggio di plastica. Etichettare ogni recipiente sul bordo in base al tipo/linea di cellula utilizzata, sia che si tratti del controllo (1G) o del trattamento (SMG) e di qualsiasi altra informazione pertinente.
- Stabilizzare il recipiente e aprire con attenzione la porta di riempimento, senza toccare il piolo / O-ring del tappo della porta di riempimento. Posizionare il tappo su un tampone di etanolo, con il ....
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Risultati
Questo metodo di coltura è considerato efficace se 1) la proliferazione delle cellule è approssimativamente coerente tra i gruppi di controllo (e idealmente tutti i gruppi sperimentali), 2) la proliferazione è appropriata data la densità di semina, la durata del trattamento e il tempo di raddoppio del tipo / linea cellulare, e 3) la vitalità delle cellule raccolte è dell'85% o superiore (Tabella 1 ). Idealmente, le cellule risultanti dovrebbero essere sane come lo sarebbero in coltura cellulare standard,.......
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Discussione
Mentre l'umanità si prepara per missioni spaziali più lunghe sulla Luna e su Marte, è necessario condurre ulteriori ricerche per mitigare i gravi rischi per la salute degli astronauti. Un aspetto importante dell'ambiente spaziale che influisce sulla fisiologia umana è la microgravità. Qui, è stato descritto un metodo di coltura cellulare per sottoporre i linfociti a SMG utilizzando un sistema di coltura cellulare rotante disponibile in commercio.
Questo protocollo contiene alcuni passaggi crit.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è sostenuto dall'Agenzia spaziale canadese (CSA), borsa di ricerca (17ILSRA3, Immuno Profile). Gli autori desiderano riconoscere e ringraziare la dottoressa Roxanne Fournier (Università di Toronto), il dottor Randal Gregg (Lincoln Memorial University) e Preteesh Mylabathula (Università dell'Arizona) per il loro aiuto nella risoluzione dei problemi iniziali di questo protocollo.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Recipiente monouso ad alto rapporto d'aspetto (HARV) (10 mL) | Recipienti per colture sterilizzati con raggi gamma | Synthecon | D-410 |
| Siringhe con punta Luer-Lok (3 mL) | BD | 309657 | Da collegare agli HARV da 10 mL |
| NK92 Linea cellulare | ATCC | CRL-2407 | |
| Sistema di coltura cellulare rotante (RCCS) | Synthecon | RCCS-4D | Dispositivo per recipienti a parete rotante; clinostato 2D |
| Provette coniche Sarsedt da 15 mL | Fisher Scientific | 50-809-220 | |
| Provette coniche Sarsedt da 50 mL | Fisher Scientific | 50-809-218 | |
| Pipette sierologiche sterili Sarsedt | Fisher Scientific | 86.1254.001 | |
| Palloni di coltura in sospensione T25 | Sarsedt | 83.3910.502 | Per il controllo dei palloni |
Riferimenti
- ElGindi, M., et al. May the force be with you (or not): the immune system under microgravity. Cells. 10 (8), 1941(2021).
- Choukèr, A., Ullrich, O. The Immune System in Space: Are we Prepared. , Springer International Publishing. Cham. (2016).
- Crucian, B. E., et al.
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Ristampe e permessi
