Differenziazione di cellule staminali pluripotenti umane in precursori di cellule beta pancreatiche in un sistema di coltura 2D

Sommario

Il presente protocollo descrive un metodo potenziato per aumentare la co-espressione dei fattori di trascrizione PDX1 e NKX6.1 nei progenitori pancreatici derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in monostrati planari. Ciò si ottiene reintegrando la matrice fresca, manipolando la densità cellulare e dissociando le cellule endodermiche.

Abstract

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) sono uno strumento eccellente per studiare lo sviluppo pancreatico precoce e studiare i fattori genetici che contribuiscono al diabete. Le cellule secernenti insulina derivate da hPSC possono essere generate per la terapia cellulare e la modellizzazione della malattia, tuttavia, con efficienza e proprietà funzionali limitate. I progenitori pancreatici derivati da hPSC che sono precursori delle cellule beta e di altre cellule endocrine, quando co-esprimono i due fattori di trascrizione PDX1 e NKX6.1, specificano i progenitori delle cellule beta funzionali che secernono insulina sia in vitro che in vivo. I progenitori pancreatici derivati da hPSC sono attualmente utilizzati per la terapia cellulare nei pazienti con diabete di tipo 1 come parte di studi clinici. Tuttavia, le procedure attuali non generano un'alta percentuale di NKX6.1 e progenitori pancreatici, portando alla cogenerazione di cellule endocrine non funzionali e poche cellule sensibili al glucosio e secernenti insulina. Questo lavoro ha quindi sviluppato un protocollo avanzato per la generazione di progenitori pancreatici derivati da hPSC che massimizzano la co-espressione di PDX1 e NKX6.1 in un monostrato 2D. I fattori come la densità cellulare, la disponibilità di matrice fresca e la dissociazione delle cellule endodermiche derivate da hPSC sono modulati che hanno aumentato i livelli di PDX1 e NKX6.1 nei progenitori pancreatici generati e ridotto al minimo l'impegno ad alternare la linea epatica. Lo studio evidenzia che la manipolazione dell'ambiente fisico della cellula durante la differenziazione in vitro può influire sulla specificazione del lignaggio e sull'espressione genica. Pertanto, l'attuale protocollo ottimizzato facilita la generazione scalabile di progenitori co-espressivi PDX1 e NKX6.1 per la terapia cellulare e la modellazione della malattia.

Introduzione

Il diabete è una malattia metabolica complessa che colpisce milioni di persone in tutto il mondo. L'integrazione di insulina è considerata l'unica opzione di trattamento per il diabete. I casi più avanzati sono trattati con la terapia sostitutiva delle cellule beta, ottenuta attraverso il trapianto di pancreas cadaverico intero o isole ^1,2. Diverse questioni circondano la terapia dei trapianti, come la limitazione della disponibilità e della qualità del tessuto, l'invasività delle procedure di trapianto oltre alla continua necessità di immunosoppressori. Ciò richiede la necessità di scoprire opzioni nuove e al....

Protocollo

Lo studio è stato approvato dal comitato etico di ricerca istituzionale competente ed eseguito seguendo gli standard etici stabiliti nella Dichiarazione di Helsinki del 1964 e nei suoi successivi emendamenti o standard etici comparabili. Il protocollo è stato approvato dall'Institutional Review Board (IRB) di HMC (n. 16260/16) e dal Qatar Biomedical Research Institute (QBRI) (n. 2016-003). Questo lavoro è ottimizzato per hESC come H1, H9 e HUES8. I campioni di sangue sono stati ottenuti da individui sani dall'ospedale Hamad Medical Corporation (HMC) con pieno consenso informato. Le iPSC sono generate da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di controllo, i....

Risultati

I risultati mostrano che il protocollo ottimizzato P2-D (Figure 1A) ha migliorato l'efficienza di differenziazione dei progenitori pancreatici sovraregolando la co-espressione di PDX1 e NKX6.1 (Figura 2A, B e Figura 3A). In particolare, i risultati hanno mostrato che la dissociazione delle cellule endodermiche e il loro replating sulla matrice di membrana fresca insieme a una maggiore durata dello stadio 3 hanno mig.......

Discussione

Questo lavoro descrive un protocollo avanzato per la generazione di progenitori pancreatici da hPSC con un'elevata co-espressione di PDX1 e NKX6.1. La dissociazione e la riplaccatura dell'endoderma derivato da hPSC a metà densità sulla matrice fresca hanno portato a PDX1 e NKX6.1 più elevati nei progenitori pancreatici derivati da hPSC.

Sebbene il cocktail di fattori di crescita per ogni stadio sia molto simile a P1-ND 27, è stato dimostrato che un trattamento più esteso dello stadio 3 che inc.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette da centrifuga coniche da 15 mL	Thermo Scientific	339651
20X TBS Tween 20	Thermo Scientific	28360
Piastre di coltura a 24 pozzetti, fondo piatto con coperchio	Costar	3524
50 mL, coniche, provette da centrifuga	Thermo Scientific	339652
piastre di coltura a 6 pozzetti, multipiatto	Thermo Scientific
Accutase	Stem Cell Technologies	0-7920
Activina A	R& D	338-AC	Ricostituito in 4 mM HCl
Anti NKX6.1 anticorpo, monoclonale di topo	DSHB	F55A12-C	Diluito a 1:100 per citometria a flusso e 1:2000 per l'immunocolorazione
Anti-PDX1 anticorpale, cavia policlonale	Abcam	ab47308	Diluito a 1:100 per citometria a flusso e 1:1000 per l'immunocolorazione
B27 meno Vit A	ThermoFisher	12587010
Albumina sierica bovina, frazione da shock termico, senza acidi grassi	Sigma	A7030
CHIR 99021	Tocris	4423	ricostituito in
DMSO DMEM, alto glucosio	ThermoFisher	41965047
asino anti-topo IgG (H + L) Anticorpo secondario altamente adsorbito, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10037
Anticorpo secondario altamente adsorbito anti-coniglio IgG (H + L) dell'asino, Alexa Fluor 488		A-21206
DPBS 1X	ThermoFisher	14190144
EGF	ThermoFisher	PHG0313	ricostituito allo 0,1% BSA in PBS
FGF10	R& D	345-FG	Ricostituito in PBS
Glucosio	Sigma Aldrich	G8644
Hoechst 33258	Sigma	23491-45-4
Microscopio invertito	Olympus	IX73
KnockOut DMEM/F-12 (1X)	Gibco	12660-012
KnockOut SR di ricambio del siero	Gibco	10828-028
Acido L-ascorbico (vitamina C)	Sigma	A92902	Ricostituito in acqua distillata
Matrigel Fattore di crescita ridotto (GFR) Matrice della membrana basale	Corning	354230	Aliquotare lo stock scongelato e congelare a -20C.
MCDB131	ThermoFisher	10372019
Mouse anti-SOX17	ORIGENE	CF500096	Diluito a 1:100 per la citometria a flusso e a 1:2000 per l'immunocolorazione
mTeSR Plus	Stem Cell Technologies	85850	Mescolare il terreno basale con l'integratore. Aliquotare e conservare a -20 ° C per un tempo più lungo o a 4 gradi C per uso istantaneo
Unità filtranti Nalgene, 0,2 & micro; m PES	ThermoFisher	566-0020
Nicotinamide	Sigma	72340	Ricostituito in acqua distillata
NOGGIN	R& D	6057-NG	Ricostituito in 0,1% BSA in
PBS Soluzione di paraformaldeide 4% in PBS	ChemCruz	sc-281692
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)	ThermoFisher	15140122
Aspiratore
Coniglio anti-FOXA2	Tecnologia di segnalazione cellulare	3143	Diluito a 1:100 per citometria a flusso e 1:500 per immunocolorante
Acido retinoico	Sigma Aldrich	R2625	Ricostituito in DMSO
Agente di Roccia inibitore (Y-27632)	ReproCell	04-0012-02	Ricostituito in DMSO
Tondo Fondo Polistirene FACS Tubi con Tappi, STERILE	Stellar Scientific	FSC-9010
SANT-1	Sigma Aldrich	S4572	Ricostituito in DMSO
Sodico bicarbonato	Sigma	S5761-500G
StemFlex	ThermoFisher	A3349401	Miscelare il terreno basale con l'integratore. Aliquotare e conservare a -20 ° C per un tempo più lungo o a 4 gradi C per l'uso immediato
Vetrino per analisi cellulare TALI	Invitrogen	T10794
Citometro a immagini Tali contatore di cellule automatizzato	Invitrogen	T10796
Triton X-100	Sigma	9002-93-1
TrypLE 100 mL	ThermoFisher	12563011
Tween 20	Sigma	P2287
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575-038

140685portatile a vuoto