Qui, forniamo miRNA esogeni sintetizzati artificialmente al rene tramite iniezione di vena della coda di un vettore non virale e nanoparticelle di polietilenimina in diversi modelli murini di malattie renali. Ciò ha portato a una significativa sovraespressione del miRNA bersaglio nel rene, con conseguente progressione inibita della malattia renale in diversi modelli murini.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Rilascio di miRNA esogeno sintetizzato artificialmente al rene utilizzando nanoparticelle di polietilenimina in diversi modelli murini di malattie renali
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I microRNA (miRNA), piccoli RNA non codificanti (21-25 basi) che non sono tradotti in proteine, inibiscono molti RNA messaggeri bersaglio (mRNA) destabilizzando e inibendo la loro traduzione in varie malattie renali. Pertanto, l'alternanza dell'espressione di miRNA da parte di miRNA esogeni sintetizzati artificialmente è un'opzione di trattamento potenzialmente utile per inibire lo sviluppo di molte malattie renali. Tuttavia, poiché la RNAasi sierica degrada immediatamente i miRNA esogeni sistematicamente somministrati in vivo, la consegna di miRNA al rene rimane una sfida. Pertanto, sono necessari vettori in grado di proteggere i miRNA esogeni dalla degradazione da parte della RNAasi e consegnarli significativamente al rene. Molti studi hanno utilizzato vettori virali per fornire miRNA esogeni o inibitori al rene. Tuttavia, i vettori virali possono causare una risposta all'interferone e/o instabilità genetica. Pertanto, lo sviluppo di vettori virali è anche un ostacolo per l'uso clinico di miRNA esogeni o inibitori. Per superare queste preoccupazioni riguardanti i vettori virali, abbiamo sviluppato un metodo vettoriale non virale per fornire miRNA imitatori al rene utilizzando l'iniezione di nanoparticelle di polietilenimina (PEI-NP), che ha portato a una significativa sovraespressione dei miRNA bersaglio in diversi modelli murini di malattia renale.
Introduzione
I miRNA, piccoli RNA non codificanti (21-25 basi) che non sono tradotti in proteine, inibiscono molti RNA messaggeri bersaglio (mRNA) destabilizzandoli e inibendo la loro traduzione in varie malattie renali 1,2. Pertanto, la terapia genica che impiega miRNA esogeni sintetizzati artificialmente o inibitori è una potenziale nuova opzione per inibire lo sviluppo di molte malattie renali 3,4,5.
Nonostante la promessa di miRNA imitatori o inibitori per la terapia genica, la consegna agli organi ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutti i protocolli sperimentali sugli animali sono stati approvati dal comitato etico animale della Jichi Medical University ed eseguiti in conformità con le linee guida sull'uso e la cura degli animali sperimentali della Guida della Jichi Medical University per gli animali da laboratorio. Qui, abbiamo dimostrato la consegna miRNA mimica al rene con conseguente sovraespressione utilizzando topi UUO. Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico della Jichi Medical University [Approvazione n. 19-12 per la fibrosi renale, 17-024 per l'infezione renale acuta (AKI) e 19-11 per la nefropatia diabetica].
1. Preparazione del complesso P....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
I miRNA target per la fibrosi renale, la nefropatia diabetica e l'AKI descritti di seguito sono stati selezionati sulla base della ricerca di microarray, qRT-PCR e / o database per applicazioni di terapia genica. Per ulteriori dettagli si rimanda alle precedenti pubblicazioni13,14,15.
Rilascio ed effetti di miRNA-146a-5p-mimic utilizzando PEI-NPs in topi con fibrosi renale
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Utilizzando il protocollo presentato in questo manoscritto, le PEI-NP possono fornire miRNA imitazioni al rene per indurre la sovraespressione dei miRNA bersaglio, con conseguenti effetti del trattamento in modelli murini in vivo di diverse malattie renali, tra cui la fibrosi renale, la malattia renale diabetica e l'AKI.
Il metodo per preparare il complesso di PEI-NPs e miRNA mimic è molto semplice. La superficie caricata positivamente delle NP PEI intrappola il miRNA mimo quando sono.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato parzialmente supportato da JSPS KAKENHI (Grant No. 21K08233). Ringraziamo Edanz (https://jp.edanz.com/ac) per aver curato le bozze di questo manoscritto.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 4',6-diamidino-2-fenilindolo per la colorazione al nucleo | Thermo Fisher Scientific | D-1306 | |
| Buffer RPE | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | Wash Buffer 1 |
| Control-miRNA-mimic (miRNA sintetizzato artificialmente) | Thermo Fisher Scientific | Non assegnato | 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3' (senso) 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisenso) |
| Oligonucleotidi a doppio filamento marcati con Cy3 | Takara Bio Inc. | ||
| Lotus tetragonolobus lectina marcata con fluoresceina | Vector Laboratories Inc | FL-1321 | |
| In vivo-jetPEI | Polyplus | 101000021 | |
| MicroAmp Piastra di reazione ottica a 96 pozzetti per qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific 4316813 | Piastra di reazione a 96 pozzetti | |
| MicroAmp Pellicola adesiva ottica | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Pellicola adesiva per piastra di reazione a 96 pozzetti |
| miRNA-146a-5p mimic (miRNA sintetizzato artificialmente) | Thermo Fisher Scientific | Non assegnato | 5'-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (senso) 5'-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisenso) |
| Primer miRNA-146a-5p | Qiagen | MS00001638 | Non disponibile perché Qiagen ha cambiato i kit qRT-PCR (dal sistema miScript miRNA PCR al sistema miRCURY LNA miRNA PCR da maggio 2021) |
| miRNA-181b-5p mimic (miRNA sintetizzato artificialmente) | Design del gene | Non assegnato | 5'-AACAUUCAUUGCAUGCGGUGG GUU-3' |
| Primer miRNA-181b-5p | Qiagen | MS00006083 | Non disponibile perché Qiagen ha cambiato i kit qRT-PCR (dal sistema miScript miRNA PCR al sistema miRCURY LNA miRNA PCR da maggio 2021) |
| miRNA-5100-mimic (miRNA sintetizzato artificialmente) | Design del gene | Non assegnato | 5'-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′ |
| miRNA-5100-primer | Qiagen | MS00042952 | Non disponibile perché Qiagen ha cambiato i kit qRT-PCR (dal sistema miScript miRNA PCR al sistema miRCURY LNA miRNA PCR da maggio 2021) |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Colonna di spin ancorata alla membrana in una provetta di raccolta da 2,0 mL |
| kit miScript II RT | Qiagen | 218161 | Non disponibile perché Qiagen ha cambiato i kit qRT-PCR (dal sistema miScript miRNA PCR al sistema miRCURY LNA miRNA PCR da maggio 2021) |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Non disponibile perché Qiagen ha cambiato i kit qRT-PCR (dal sistema miScript miRNA PCR al sistema miRCURY LNA miRNA PCR da maggio 2021) |
| Trituratore QIA | Qiagen | 79654 | Colonne di centrifugazione in biopolimero in una provetta |
| di raccolta da 2,0 mLReagente per lisi QIAzol | Qiagen | 79306 | Reagente per lisi a base di fenolo/guanidina |
| QuantStudio 12K Flex Flex Sistema di PCR in tempo reale | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Strumento per PCR in tempo reale |
| QuantStudio 12K Flex Software versione 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Software per strumenti PCR in tempo reale |
| Acqua priva di RNasi | Qiagen | 129112 | |
| Primer RNU6-2 | Qiagen | MS00033740 | Non disponibile perché Qiagen ha cambiato i kit qRT-PCR (dal sistema miScript miRNA PCR al sistema miRCURY LNA miRNA PCR da maggio 2021) |
| Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Sakura Finetek Japan Co., Ltd. | Non assegnato |
Riferimenti
- Mohr, A. M., Mott, J. L. Overview of microRNA biology. Seminars in Liver Disease. 35 (1), 3-11 (2015).
- Bushati, N., Cohen, S. M. microRNA functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).
- Simpson, K., Wonnacott, A., Fraser, D. J., Bowen, T.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
