Articolo metodologico

Isolamento e profilazione delle cellule endoteliali arteriose mesenteriche primarie umane a livello di trascrittoma

DOI:

10.3791/63307

⸱

14 marzo 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Diabetes Complications and Metabolism, City of Hope, 2Department of Bioengineering, University of California San Diego, 3Irell and Manella Graduate School of Biological Sciences, City of Hope

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo descrive l'isolamento, la coltura e la profilazione delle cellule endoteliali dall'arteria mesenterica umana. Inoltre, viene fornito un metodo per preparare l'arteria umana per la trascrittomica spaziale. Proteomica, trascrittomica e saggi funzionali possono essere eseguiti su cellule isolate. Questo protocollo può essere riproposto per qualsiasi arteria di medie o grandi dimensioni.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule endoteliali (CE) sono cruciali per la funzione vascolare e di tutto il corpo attraverso la loro risposta dinamica ai segnali ambientali. Chiarire il trascrittoma e l'epigenoma delle CE è fondamentale per comprendere i loro ruoli nello sviluppo, nella salute e nella malattia, ma è limitato nella disponibilità di cellule primarie isolate. Le recenti tecnologie hanno permesso la profilazione ad alto rendimento del trascrittoma EC e dell'epigenoma, portando all'identificazione di sottopopolazioni di cellule EC precedentemente sconosciute e traiettorie di sviluppo. Mentre le colture EC sono uno strumento utile nell'esplorazione della funzione e della disfunzione della CE, le condizioni di coltura e i passaggi multipli possono introdurre variabili esterne che alterano le proprietà della CE nativa, tra cui la morfologia, lo stato epigenetico e il programma di espressione genica. Per superare questa limitazione, il presente documento dimostra un metodo per isolare le EC primarie umane dalle arterie mesenteriche dei donatori con l'obiettivo di catturare il loro stato nativo. Le CE nello strato intimale sono dissociate meccanicamente e biochimicamente con l'uso di particolari enzimi. Le cellule risultanti possono essere utilizzate direttamente per il sequenziamento di RNA di massa o RNA a singola cellula o placcate per la coltura. Inoltre, viene descritto un flusso di lavoro per la preparazione del tessuto arterioso umano per la trascrittomica spaziale, in particolare per una piattaforma disponibile in commercio, sebbene questo metodo sia adatto anche per altre tecniche di profilazione del trascrittoma spaziale. Questa metodologia può essere applicata a diversi vasi raccolti da una varietà di donatori in stato di salute o malattia per ottenere informazioni sulla regolazione trascrizionale ed epigenetica della CE, un aspetto fondamentale della biologia cellulare endoteliale.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rivestendo il lume dei vasi sanguigni, le cellule endoteliali (CE) sono regolatori cruciali del tono vascolare e della perfusione tissutale. Le CE sono notevoli nella loro capacità di reagire all'ambiente extracellulare e adattarsi ai cambiamenti nella dinamica e nella composizione del flusso sanguigno. Queste risposte dinamiche sono mediate attraverso una rete di eventi di segnalazione intracellulare, comprese le modulazioni trascrizionali e post-trascrizionali con risoluzione spazio-temporale. La disregolazione di queste risposte è implicata in molte patologie, tra cui, ma non solo, malattie cardiovascolari, diabete e cancro 1,2.

Gran parte degli studi fa uso di linee cellulari o modelli animali per interrogare il trascrittoma CE. Il primo è uno strumento utile, data la relativa facilità d'uso e l'economicità. Tuttavia, la coltivazione seriale può introdurre alterazioni fenotipiche alle CE, come le caratteristiche fibroblastiche e la mancanza di polarizzazione, disconnettendole dal loro stato in vivo 3. Le cellule primarie, ad esempio la vena ombelicale umana EC (HUVEC) sono state una scelta popolare dal 1980, ma derivano da un letto vascolare di sviluppo che non esiste negli adulti, quindi è improbabile che rappresenti pienamente gli EC maturi. Gli animali, in particolare i modelli murini, rappresentano meglio l'ambiente fisiologico o fisiopatologico delle CE e consentono l'interrogazione dei trascrittomi a seguito di perturbazioni genetiche. Le CE murine possono essere isolate da vari tessuti, tra cui l'aorta, i polmoni e i tessuti adiposi utilizzando procedure basate su enzimi 4,5,6,7. Tuttavia, le cellule isolate non possono essere utilizzate per passaggi multipli a meno che non siano trasformate6 e sono spesso limitate in numero, il che richiede il raggruppamento da più animali 5,8,9.

L'avvento di nuove tecnologie che esplorano l'architettura dei vasi a livello trascrittomico, in particolare con la risoluzione a singola cellula, ha permesso una nuova era della biologia endoteliale rivelando nuove funzioni e proprietà delle CE 5,10,11,12,13,14. Una ricca risorsa costruita dai ricercatori di Tabula Muris ha raccolto profili trascrittomici a singola cellula di 100.000 cellule tra cui EC in 20 diversi organi murini15, che hanno rivelato sia geni marcatori EC comuni che firme trascrittomiche uniche con differenze inter-e intra-tessuto 5,13. Tuttavia, ci sono chiare differenze tra topo e uomo nel genoma, nell'epigenoma e nel trascrittoma, specialmente nelle regioni non codificanti 16,17,18. Questi inconvenienti di cui sopra sottolineano l'importanza dell'analisi delle CE utilizzando campioni umani al fine di ottenere un profilo fedele delle CE nel loro stato nativo in salute e malattia.

La maggior parte dei metodi di isolamento EC si basano sulla dissociazione fisica attraverso l'omogeneizzazione, il taglio fine e la tritatura del tessuto prima dell'incubazione con enzimi proteolitici per tempi diversi. Gli enzimi e le condizioni variano anche considerevolmente tra i tipi di tessuto, dalla tripsina alla collagenasi, usati da soli o in combinazione 19,20,21. Un ulteriore arricchimento o purificazione basato su anticorpi sono spesso inclusi per aumentare la purezza delle CE. Tipicamente, gli anticorpi contro i marcatori di membrana EC, ad esempio CD144 e CD31 sono coniugati a perline magnetiche e aggiunti alla sospensione cellulare22,23. Tale strategia può essere generalmente adattata per l'isolamento CE da più tessuti umani e murini, comprese le tecniche introdotte in questo protocollo.

Nel loro stato nativo, le CE interagiscono con più tipi di cellule e possono esistere in nicchie vascolari in cui la vicinanza cellulare è cruciale per la funzione. Mentre gli studi di sequenziamento dell'RNA monocellulare e mononucleare (scRNA e snRNA-seq) sono stati fondamentali per le recenti scoperte nella descrizione dell'eterogeneità DELLA CE, il processo di dissociazione interrompe il contesto tissutale e il contatto cellula-cellula, che sono anche importanti per comprendere la biologia CE. Sviluppato nel 2012 e nominato Metodo dell'anno nel 202024, il profilo del trascrittoma spaziale è stato utilizzato per profilare l'espressione genica globale mantenendo le caratteristiche spaziali in vari tessuti tra cui il cervello25, il tumore26 e il tessuto adiposo27. Le tecnologie possono essere mirate, utilizzando sonde specializzate specifiche per particolari sequenze di RNA attaccate a reagenti di affinità o tag fluorescenti, rilevando così geni selezionati a risoluzione subcellulare 28,29,30,31. Possono anche essere non mirati32,33, in genere utilizzando oligonucleotidi spazialmente codificati per catturare l'RNA, che insieme vengono convertiti in cDNA per la successiva preparazione della libreria seq e quindi hanno il vantaggio di dedurre l'espressione genica dell'intero tessuto in modo imparziale. Tuttavia, la risoluzione spaziale non è attualmente raggiunta a un singolo livello cellulare con tecnologie disponibili in commercio. Ciò può essere superato in una certa misura con l'integrazione dei dati con i dati scRNA-seq, consentendo in definitiva la mappatura del trascrittoma a singola cellula in un contesto tissutale complesso pur mantenendo le sue informazioni spaziali originali34.

Qui, viene descritto un flusso di lavoro per profilare il trascrittoma EC utilizzando l'arteria mesenterica superiore umana, un'arteria periferica che è stata utilizzata per studiare la vasodilatazione, il rimodellamento vascolare, lo stress ossidativo e l'infiammazione 35,36,37. Vengono descritte due tecniche: 1) isolare e arricchire le CE dall'intima dei vasi sanguigni combinando dissociazione meccanica e digestione enzimatica adatte al sequenziamento del trascrittoma monocellulare o alla successiva coltura in vitro; 2) preparare sezioni arteriose per la profilazione del trascrittoma spaziale (Figura 1). Queste due tecniche possono essere eseguite in modo indipendente o complementare per profilare le CE e le cellule circostanti. Inoltre, questo flusso di lavoro può essere adattato per l'uso su qualsiasi arteria media o grande.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Studi sui tessuti umani sono stati condotti su campioni deidentificati ottenuti dal Southern California Islet Cell Resource Center di City of Hope. I consensi di ricerca per l'uso di tessuti umani post mortem sono stati ottenuti dai parenti più prossimi dei donatori e l'approvazione etica per questo studio è stata concessa dall'Institutional Review Board di City of Hope (IRB n. 01046).

1. Dissociazione fisica (tempo stimato: 1-2 h)

  1. Posizionare un'arteria fresca su un piatto di 10 cm e lavare con soluzione salina sterile tamponata con fosfato di Dulbecco (D-PBS).
  2. Con pinze sterili e forbici di dissezione, rimuovere il grasso e i tessuti connettivi esterni fino a quando il vaso non è pulito. Misurare la lunghezza della nave con un righello posizionato all'esterno del piatto e scattare foto per i record (Figura 1A).
  3. Tampone di digestione appropriato preriscaldato a 37 °C: per scRNA-seq utilizzare l'enzima di dissociazione cellulare; per i saggi di coltura cellulare utilizzare 1-6 mg/mL di collagenasi D, 3 mg/mL di proteasi derivata da batteri, 100 mM di HEPES, 120 mM di NaCl, 50 mM di KCl, 5 mM di glucosio, con 1 mM di CaCl2 6,38 (pH 7,0, non richiede aggiustamento) aggiunto 5 minuti prima dell'uso.
  4. Prendi l'arteria mesenterica (in genere con un diametro di 6-8 mm) e taglia longitudinalmente con le forbici per aprire verticalmente il lume del vaso.
  5. Usando gli aghi, attaccare il recipiente alla cera nera su tutti e quattro gli angoli, lasciando l'intima esposta (Figura 1B).
  6. Aggiungere 1 mL di tampone di digestione preriscaldato all'intima. Prendi un bisturi sterile e raschia delicatamente il lume della nave due volte.
    NOTA: lo scopo di questa procedura è quello di dissociare lo strato intimale, che potrebbe richiedere pratica. È necessario esercitare una forza sufficiente per rimuovere l'endotelio, ma non così tanto da rimuovere anche gli strati più profondi del tessuto, il che ridurrà la rappresentazione CE.
  7. Trasferire il tampone di digestione in un tubo da 5 ml. Aggiungere 1 mL di tampone digestivo all'intima e alla pipetta su e giù con attenzione per raccogliere le cellule rimanenti e aggiungere al tubo da 5 ml. Incubare le celle a 37 °C, ruotando a 150 giri/min per 5 min.
  8. Aggiungere 2 mL di mezzo M199 (o D-PBS se si procede con scRNA-seq) alla sospensione cellulare per spegnere la reazione enzimatica. Mescolare delicatamente e centrifugare a 4 °C, 600 x g per 5 min.
  9. Rimuovere il surnatante e conservare il surnatante separatamente in coltura come controllo per osservare se tutte le cellule vengono catturate nel pellet nel passaggio 1.8. Risospescere il pellet cellulare in 1 mL di mezzo M199 (o D-PBS se si procede con scRNA-seq).
  10. Valutare la vitalità cellulare mescolando 10 μL di tripano blu con 10 μL di stock cellulare. Osservare la morfologia cellulare e contare le cellule usando un emocitometro.
    NOTA: A questo punto, le cellule possono essere utilizzate per la quantificazione di proteine o RNA o coltivate in vitro utilizzando terreni di coltura CE seguendo i protocolli standard39. In alternativa, possono essere preparati per il sequenziamento come descritto nella sezione successiva.
  11. Per la coltura, rivestire due pozzetti di una piastra a 6 pozzetti pipettando 500 μL di reagente di attacco in pozzetti per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo la rimozione del reagente di attacco e il lavaggio con D-PBS sterile, erogare l'intero stock cellulare in un pozzo e il surnatante mantenuto come controllo nel secondo pozzo.

2. Preparazione per studi scRNA-seq (tempo stimato: 3-4 h)

  1. Centrifugare il materiale cellulare dal punto 1.11 a 4 °C, 600 x g per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospesciare delicatamente il pellet con una pipetta P1000 e una punta a foro largo in 1 mL di albumina sierica bovina allo 0,04% (BSA) in D-PBS. Mescolare bene per garantire una sospensione monocellulare.
  2. Passare la soluzione attraverso un filtro da 40 μm per rimuovere i detriti cellulari. Se i detriti rimangono, passare attraverso un secondo filtro in 4 ml di BSA allo 0,04% in D-PBS.
  3. Centrifugare a 4 °C, 600 x g per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospese il pellet in 500 μL di BSA allo 0,04% in D-PBS utilizzando una pipetta P1000 con una punta di pipetta a foro largo. Mescolare bene per garantire una sospensione monocellulare.
  4. Valutare la vitalità cellulare mescolando 10 μL di stock cellulare con 10 μL di tripano blu. Usando un emocitometro, osservare la morfologia, determinare se esiste una sospensione a singola cellula senza cluster, verificare la presenza di detriti tissutali e calcolare il numero di cellule vive e morte.
  5. Se le cellule sono raggruppate o i detriti rimangono, ripetere il lavaggio con lo 0,04% di BSA in D-PBS o passare nuovamente attraverso il filtro da 40 μm.
    NOTA: mentre questo ridurrà la resa, è importante che le cellule esistano in una sospensione a cella singola pulita per un sequenziamento ottimale.
  6. La sospensione monocellulare può essere utilizzata per scRNA-seq.

3. Profilazione del trascrittoma spaziale (tempo stimato: 3-4 h)

  1. Aggiungere isopentano (2-metilbutano) a un contenitore metallico e raffreddare in azoto liquido (LN2) o ghiaccio secco (LN2 è preferito in quanto porterà la temperatura inferiore al ghiaccio secco). Versare il composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) in pozzetti di criostampi di plastica etichettati facendo attenzione a non creare bolle e rimuovere quelli che appaiono. Lasciare raffreddare il criostampo sul ghiaccio secco.
  2. Tagliare almeno due sezioni coronali, 1 cm di lunghezza della nave. Utilizzando una pinza lunga (12"), immergere il tessuto in isopentano fino a quando non viene congelato. Immergere rapidamente il tessuto in OCT all'orientamento con il lume visibile al centro. Fare attenzione a rimuovere eventuali bolle, specialmente quelle accanto al tessuto.
  3. Usando una pinza lunga (12"), afferrare i criomoli e tenerli nel contenitore metallico. Mentre la base degli stampi dovrebbe essere nel liquido, non dovrebbe essere troppo profonda per consentire all'isopentano di scorrere sul tessuto. Osserva il congelamento, l'OCT diventerà bianco progressivamente dall'esterno in 1-2 min.
  4. Conservare queste sezioni in un contenitore sigillato a -80 °C per un massimo di 6 mesi.
    NOTA: Mantenere i campioni su ghiaccio secco in ogni momento e non consentire più di un ciclo di congelamento-disgelo. Questo tessuto può essere utilizzato per l'analisi istologica, l'ibridazione in situ a fluorescenza RNA/DNA (FISH) o la trascrittomica spaziale, che verrà descritta ora.
  5. Impostare la temperatura del criostato a -20 °C per la camera e -10 °C per la testa del campione. Equilibrare sezioni di recipienti incorporati OCT, coltelli, spazzole e vetrini a -20 °C nel criostato per circa 30 minuti. Durante l'equilibratura, pulire la macchina e tutte le attrezzature che possono toccare le sezioni, compresa la lama, con etanolo al 70% seguito da soluzione di decontaminazione RNasi.
  6. Collegare il campione erogando una piccola quantità di OCT sul blocco criostato circolare e posizionando il campione sopra prima che si congeli. Posizionare il blocco al centro della testa del campione e avvitare il blocco in posizione utilizzando un'alta maniglia nera a sinistra. Tagliare via qualsiasi PTOM in eccesso che circonda la nave.
  7. Impostando lo spessore di taglio a 10 μm sul criostato, tagliare circa 60 sezioni e posizionarle in un tubo pre-raffreddato da 1,5 ml. Queste sezioni saranno utilizzate per valutare la qualità dell'RNA. Al momento della rimozione dal criostato, aggiungere immediatamente 1 mL di reagente di estrazione dell'RNA e vortice fino a quando le sezioni sono completamente dissolte.
  8. Aggiungere 200 μL di cloroformio e mescolare fino a quando la soluzione assomiglia a un frappè alla fragola. Centrifugare a 11.200 x g per 10 min a 4 °C.
  9. Raccogliere la fase acquosa (fase chiara sopra gli strati bianchi e rosa) e aggiungere 500 μL di isopropanolo ad essa. Mescolare invertendo i tubi oltre 10 volte e posizionare a -80 °C per almeno 20 minuti.
  10. Centrifugare a 11.200 x g per 10 min a 4 °C. Sciogliere il pellet di RNA purificato in 5 μL di acqua priva di RNasi. Esaminare il numero di integrità dell'RNA (RIN).
    NOTA: i campioni con RIN ≥ 7 sono preferiti, ma RIN ≥ 6 è accettabile. Il numero di sezioni tissutali e il volume di soluzione per la dissoluzione dell'RNA possono richiedere un'ottimizzazione a seconda del sistema utilizzato per garantire che la concentrazione finale di RNA rientri nell'intervallo di funzioni RIN per consentire un'accurata valutazione RIN.
  11. Esercitati a tagliare e posizionare correttamente le sezioni all'interno dei telai fiduciali utilizzando vetrini di vetro normale prima di procedere all'ottimizzazione dei tessuti o ai vetrini di espressione genica disponibili in commercio. Ciò può essere ottenuto disegnando quadrati di 6,5 mm x 6,5 mm su una semplice slitta di vetro, raffreddando a -20 °C nel criostato e posizionando sezioni in questa area di cattura.
  12. Tagliare sezioni da 10 μm con piastra antirollio in posizione, capovolgere e appiattire con cura toccando delicatamente la sezione attraverso l'OCT circostante.
  13. Utilizzando spazzole criostatiche prive di RNasi, posizionare la sezione del tessuto all'interno del quadrato, utilizzando solo l'OCT circostante. Posizionare immediatamente un dito (nei guanti) sul retro dell'area di cattura per fondere la sezione sul vetrino.
  14. Una volta che la sezione ha aderito, posizionare la diapositiva sulla criobare per consentire alla sezione di congelarsi. Bisogna fare attenzione ad evitare il ripiegamento dei tessuti e il tessuto sovrastante i bordi delimitati del telaio fiduciario. Se necessario, tagliare il tessuto a metà o quarti lungo il lume usando una lama per assicurarsi che la sezione del vaso si adatti al telaio di 6,5 mm x 6,5 mm.
  15. Tagliare sezioni di tessuto da 10 μm come da 3.12-3.14 su vetrini di ottimizzazione tissutale o di espressione genica. Trasferire la diapositiva su un mailer a scorrimento posto su ghiaccio secco. Conservare le diapositive a -80 °C per un massimo di 4 settimane prima di procedere con i protocolli spaziali pubblicati33,34.

4. Sequenziamento dell'analisi dei dati (tempo stimato: fino a 1 settimana a seconda della familiarità con il software)

NOTA: solo per l'analisi trascrittomica spaziale, andare al passaggio 4.8. I dati scRNA-seq vengono elaborati utilizzando la pipeline standardizzata allineata al trascrittoma di riferimento hg38 umano. Il pacchetto R Seurat (v3.2.2) viene utilizzato per analizzare i dati scRNA-seq seguendo le linee guidapubblicate 40.

  1. Filtra utilizzando metriche di controllo di qualità consolidate: vengono rimosse cellule rare con un numero molto elevato di geni (potenzialmente multipletti) e cellule con alte percentuali mitocondriali (cellule di bassa qualità o morenti spesso presentano contaminazione mitocondriale).
  2. Normalizzare i dati utilizzando "sctransform", un metodo per migliorare l'integrazione dei campioni rispetto alla normalizzazione dei log. Questi dati normalizzati vengono utilizzati per la riduzione della dimensionalità e il clustering, mentre i livelli di espressione normalizzati dai log vengono utilizzati per l'analisi basata sui livelli di espressione genica, come la classificazione del tipo di cellula41.
  3. Selezionare i geni marcatori per tipo di cellula, ad esempio la molecola di adesione delle cellule endoteliali piastriniche-1 (PECAM1) e il fattore di von Willebrand (VWF) per le CE, il lumicano (LUM) e il procollagene C-Endopeptidasi Enhancer (PCOLCE) per i fibroblasti, il gene di traslocazione delle cellule B 1 (BTG1) e CD52 per i macrofagi, C1QA e C1QB per i monociti e la catena pesante della miosina 11 (MYH11) e transgelina (TAGLN) per le cellule muscolari lisce vascolari36.
  4. Calcolare il livello di espressione medio tra singole celle tra ogni coppia di marcatori in modo da avere un singolo marcatore con un livello di espressione medio associato a ciascun tipo di cella42.
  5. Applicare un gaussian mixture model (GMM) con due componenti ai dati di espressione di ciascun marcatore su singole celle al fine di separare le celle in due insiemi, vale a dire, esprimendo altamente il marcatore ed esprimendo in modo modesto il marcatore. In questo modo, per ogni marcatore, ogni singola cella viene assegnata ad una delle due componenti42.
  6. Utilizzare l'arricchimento statistico per l'insieme dei geni marcatori, un test esatto di Fisher, per assegnare un tipo di cellula a ciascun cluster. In questo modo, si ottiene un insieme di valori p per cluster, ciascuno corrispondente a un tipo di cella. Il tipo di cella con il valore p più basso viene assegnato a tale cluster.
  7. Elaborare i dati trascrittomici spaziali utilizzando le pipeline Space Ranger con conseguente de-barcoding spaziale e generazione di metriche di controllo di qualità (QC), comprese le letture allineate totali al trascrittoma umano hg38, il numero mediano di identificatori molecolari univoci (UMI) o geni per spot35.
    NOTA: Il pacchetto R Seurat (v3.2.2) viene utilizzato per analizzare i dati elaborati da Space Ranger seguendo le linee guida pubblicate40.
  8. Normalizzare i dati utilizzando "sctransform", un metodo che ha dimostrato di migliorare l'analisi a valle rispetto alla normalizzazione dei log data l'eterogeneità del tessuto e l'altissima varianza nei conteggi tra i punti.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'analisi delle CE dell'arteria mesenterica utilizzando una combinazione di dissociazione meccanica ed enzimatica o crioconservazione per l'uso in vari saggi a valle è descritta qui (Figura 1). Le EC possono essere profilate nelle arterie mesenteriche utilizzando i seguenti passaggi: A) dissociazione meccanica dall'intima accoppiata con la digestione della collagenasi alle cellule di coltura; B) generazione di sospensione monocellulare per scRNA-seq; o C) le sezioni trasversali dell'arteria ...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il flusso di lavoro presentato descrive in dettaglio una serie di tecniche per profilare gli EC da un singolo pezzo di arteria umana con risoluzione a singola cellula e spaziale. Ci sono diversi passaggi critici e fattori limitanti nel protocollo. Una chiave per la profilazione del trascrittoma è la freschezza del tessuto e l'integrità dell'RNA. È importante mantenere i tessuti sul ghiaccio il più possibile prima dell'elaborazione per ridurre al minimo la degradazione dell'RNA. Tipicamente, i tessuti post-mortem vengono ...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.Z. è fondatore e membro del consiglio di amministrazione di Genemo, Inc.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01HL108735, R01HL145170, R01HL106089 (a Z.B.C.); DP1DK126138 e DP1HD087990 (a S.Z.); una sovvenzione della Fondazione Ella Fitzgerald e un Progetto della Famiglia Wanek (a Z.B.C.); e una sovvenzione per la rete di semi Human Cell Atlas (a Z.B.C. e S.Z.). La ricerca riportata in questa pubblicazione ha incluso il lavoro svolto nel nucleo di genomica integrativa presso City of Hope supportato dal National Cancer Institute del National Institutes of Health con il numero di premio P30CA033572. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Ismail Al-Abdullah e il Dr. Meirigeng Qi del team di trapianto di isole presso City of Hope per l'isolamento dei tessuti umani, il Dr. Dongqiang Yuan presso City of Hope per la sua assistenza con l'analisi scRNA-seq e il Dr. Marc Halushka presso la Divisione di Patologia Cardiovascolare, Johns Hopkins University School of Medicine per le sue preziose intuizioni sull'istologia vascolare.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provetta per microcentrifuga da 1,5 mLUSA Scientific1615-5500
piatto da 10 cmGenesee Scientific25-202
aghi 23GBD305145
2-metilbutanoThermo FisherAC327270010
40 &; filtro Fisher14100150
4200 Sistema TapeStationAgilent TechnologiesG2991BA
provetta da 5 mLThermo Fisher14282300
piastra a 6 pozzettiGreiner Bio-One07-000-208
Fattore di attaccoApplicazioni della cella123-500Reagente di attacco nel protocollo
CeraÈ possibile utilizzare qualsiasi cera nera commerciale
Albumina sierica bovina trattata con shock termicoFisherBP1600-100
CaCl2FisherBP510
CentrifugaEppendorf
CloroformioFisherC607
Collagenasi DRoche11088866001
CriostatoSpazzole
Cryostat
D-GlucosioFisherD16-1
DimetilsolfossidoFisherMT25950CQC
Dispase IIRoche4942078001Proteasi derivata da batteri nel protocollo
Bisturi di sicurezza monousoMyco Instrumentation6008TR-10
D-PBSThermo Fisher14080055
EthanolFisherBP2818-4
Siero fetale bovinoFisher10437028
EmocitometroFisher267110
HEPESSigma AldrichH3375-100g
Tampone campione D1000 ad alta sensibilitàAgilent Technologies5067-5603
Nastro dello schermo D1000 ad alta sensibilitàAgilent Technologies5067-5584
IncubatoreMantenuto a 37 ° C 5% CO2
IsopropanoloFisherBP26324
KClFisherP217-3
Terreno di azoto
199Sigma AldrichM2520-10X
Microscopio a bombola
LeicaPer valutare la morfologia cellulare
Terreno di coltura endoteliale microvascolareApplicazioni cellulari111-500
NaClFisherS271-1
New Brunswick Innova 44/44R Agitatore orbitaleEppendorf
Composto di temperatura di taglio ottimaleFisher4585
Criostampi in plasticaFisher22363553
nastro per schermoa RNAAgilent Technologies5067-5576
Schermo per RNA Tampone per campioni su nastroAgilent Technologies5067-5577
RNase ZAPThermo FisherAM9780
Acqua priva di RNasiTakaraRR036BAcqua priva di RNasi (2) in kit
Pinza sterile lunga 12"F.S.T91100-16
Pinza fine sterileF.S.T11050-10
Forbici fini steriliF.S.T14061-11
Superfrost PLUS Gold SlidesFisher1518848
TRIzol reagenteFisher15596018
Trypan BlueCorningMT25900CI
TrypLE Express Enzyme (1X) rosso fenoloThermo Fisher12605010Enzima di dissociazione cellulare nel protocollo
Kit di accessori Visium10X GenomicsPN-1000215
Pacchetto Visium Gateway, 2rxns10X GenomicsPN-1000316
Vetrino e diapositiva di espressione genica spaziale Visium Kit di reagenti, 4 rxns10X GenomicsPN-1000184
neraLeicaliquidometallica

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thorin, E., Shreeve, S. M. Heterogeneity of vascular endothelial cells in normal and disease states. Pharmacology & Therapeutics. 78 (3), 155-166 (1998).
  2. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  3. Hillen, H. F., Melotte, V., van Beijnum, J. R., Griffioen, A. W. Endothelial cell biology. Angiogenesis Assays: A Critical Appraisal of Current Techniques. , John Wiley & Sons. Chichester, West Sussex, UK. 1-38 (2007).
  4. Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
  5. Kalucka, J., et al. Single-cell transcriptome atlas of murine endothelial cells. Cell. 180 (4), 764-779 (2020).
  6. Tang, X., et al. Suppression of endothelial AGO1 promotes adipose tissue browning and improves metabolic dysfunction. Circulation. 142 (4), 365-379 (2020).
  7. Ni, C. W., Kumar, S., Ankeny, C. J., Jo, H. Development of immortalized mouse aortic endothelial cell lines. Vascular Cell. 6 (1), 7(2014).
  8. Kalluri, A. S., et al. Single-cell analysis of the normal mouse aorta reveals functionally distinct endothelial cell populations. Circulation. 140 (2), 147-163 (2019).
  9. Wirka, R. C., et al. Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis. Nature Medicine. 25, 1280-1289 (2019).
  10. Widyantoro, B., et al. Endothelial cell-derived endothelin-1 promotes cardiac fibrosis in diabetic hearts through stimulation of endothelial-to-mesenchymal transition. Circulation. 121 (22), 2407-2418 (2010).
  11. Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
  12. Stuart, T., Satija, R. Integrative single-cell analysis. Nature Reviews Genetics. 20, 257-272 (2019).
  13. Paik, D. T., et al. Single-cell RNA sequencing unveils unique transcriptomic signatures of organ-specific endothelial cells. Circulation. 142 (19), 1848-1862 (2020).
  14. Palikuqi, B., et al. Adaptable haemodynamic endothelial cells for organogenesis and tumorigenesis. Nature. 585 (7825), 426-432 (2020).
  15. The Tabula Muris Consortium. et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  16. Hezroni, H., et al. Principles of long noncoding RNA evolution derived from direct comparison of transcriptomes in 17 species. Cell Reports. 11 (7), 1110-1122 (2015).
  17. Washietl, S., Kellis, M., Garber, M. Evolutionary dynamics and tissue specificity of human long noncoding RNAs in six mammals. Genome Research. 24 (4), 616-628 (2014).
  18. Chen, J., et al. Evolutionary analysis across mammals reveals distinct classes of long non-coding RNAs. Genome Biology. 17 (19), 19(2016).
  19. Drake, B. L., Loke, Y. W. Isolation of endothelial cells from first trimester decidua using immunomagnetic beads. Human Reproduction. 6, 1156-1159 (1991).
  20. McDouall, R. M., Yacoub, M., Rose, M. L. Isolation, culture and characterization of MHC class II-positive microvascular endothelial cells from the human heart. Microvascular Research. 51, 137-152 (1996).
  21. Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protocols. 2 (2), 100489(2021).
  22. Springhorn, J. P., Madri, J. A., Squinto, S. P. Human capillary endothelial cells from abdominal wall adipose tissue: isolation using an anti-pecam antibody. In Vitro Cellular Developmental Biology Animal. 31 (6), 473-481 (1995).
  23. Hewett, P. W., Murray, J. C. Immunomagnetic purification of human microvessel endothelial cells using Dynabeads coated with monoclonal antibodies to PECAM-1. European Journal of Cell Biology. 62 (2), 451-454 (1993).
  24. Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nature Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
  25. Maynard, K. R., et al. Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex. Nature Neuroscience. 24 (3), 425-436 (2021).
  26. Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
  27. Bäckdahl, J., et al. Spatial mapping reveals human adipocyte subpopulations with distinct sensitivities to insulin. Cell Metabolism. 33 (9), 1869-1882 (2021).
  28. Wang, J., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
  29. Codeluppi, S., et al. Spatial organization of the somatosensory cortex revealed by osmFISH. Nature Methods. 15, 932-935 (2018).
  30. Eng, C. H. L., et al. Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH. Nature. 568, 235-239 (2019).
  31. Eng, C. H. L., Shah, S., Thomassie, J., Cai, L. Profiling the transcriptome with RNA SPOTs. Nature Methods. 14, 1153-1155 (2017).
  32. Rodriques, S. G., et al. Slide-seq: a scalable technology for measuring genome-wide expression at high spatial resolution. Science. 363 (6434), 1463-1467 (2019).
  33. Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), 78-82 (2016).
  34. Rao, A., et al. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature. 596 (7871), 211-220 (2021).
  35. Sachidanandam, K., et al. Differential effects of diet-induced dyslipidemia and hyperglycemia on mesenteric resistance artery structure and function in type 2 diabetes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 328 (1), 123-130 (2009).
  36. Calandrelli, R., et al. Stress-induced RNA-chromatin interactions promote endothelial dysfunction. Nature Communications. 11 (1), 5211(2020).
  37. Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in Type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), 23337(2011).
  38. Asterholm, I., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
  39. Marin, V., et al. Endothelial cell culture: protocol to obtain and cultivate human umbilical endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 254 (1-2), 183-190 (2001).
  40. Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
  41. Hafemeister, C., Satija, R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biology. 20 (1), 296(2019).
  42. Bonnycastle, L. L., et al. Single-cell transcriptomics from human pancreatic islets: sample preparation matters. Biology Methods Protocols. 5 (1), (2020).
  43. Espitia, O., et al. Implication of molecular vascular smooth muscle cell heterogeneity among arterial beds in arterial calcification. PLoS One. 13 (1), 0191976(2018).
  44. Engelbrecht, E., et al. Sphingosine 1-phosphate-regulated transcriptomes in heterogenous arterial and lymphatic endothelium of the aorta. eLife. 9, 52690(2020).
  45. Hu, H., et al. Single-cell transcriptomic atlas of different human cardiac arteries identifies cell types associated with vascular physiology. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1408-1427 (2021).
  46. van Beijnum, J., et al. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
  47. Jin, S., et al. Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. Nature Communications. 12 (1), 1088(2021).
  48. Efremova, M., Vento-Tormo, M., Teichmann, S. A., Vento-Tormo, R. CellPhoneDB: inferring cell-cell communication from combined expression of multi-subunit ligand-receptor complexes. Nature Protocols. 15 (4), 1484-1506 (2020).
  49. Hu, Y., Peng, T., Gao, L., Tan, K. CytoTalk: de novo construction of signal transduction networks using single-cell RNA-Seq data. Science Advances. 7 (16), (2020).
  50. Sanchez-Ferras, O., et al. A coordinated progression of progenitor cell states initiates urinary tract development. Nature Communications. 12 (1), 2627(2021).
  51. Mantri, M., et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis. Nature Communications. 12 (1), 1771(2021).
  52. Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
  53. Moffit, J. R., et al. High-throughput MERFISH. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 11046-11051 (2016).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Mesenteric ArteryCell IsolationTranscriptome ProfilingSingle Cell RNASpatial TranscriptomicsCell ViabilityImmunofluorescence StainingRNA ExtractionHematoxylin Eosin Staining

Articoli correlati