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Articolo metodologico

Robusta differenziazione delle iPSC umane in una popolazione pura di adipociti per studiare i disturbi associati agli adipociti

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DOI:

10.3791/63311

⸱

9 febbraio 2022

 ,  , 
1Diabetes Research Center, Qatar Biomedical Research Institute (QBRI), Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation (QF), 2College of Health and Life Sciences, Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation

In questo articolo

Sommario

Il protocollo consente la generazione di una popolazione di adipociti puri da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). L'acido retinoico viene utilizzato per differenziare le iPSC in cellule staminali mesenchimali (MSC) utilizzate per la produzione di adipociti. Quindi, viene utilizzato un approccio di selezione basato sulla colorazione rossa del Nilo per ottenere adipociti puri.

Abstract

I recenti progressi nella tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) hanno permesso la generazione di diversi tipi di cellule, compresi gli adipociti. Tuttavia, gli attuali metodi di differenziazione hanno una bassa efficienza e non producono una popolazione omogenea di adipociti. Qui, eludiamo questo problema utilizzando un metodo basato sul retinoico completamente trans per produrre cellule staminali mesenchimali (MSC) ad alto rendimento. Regolando i percorsi che regolano la proliferazione, la sopravvivenza e l'adesione cellulare, la nostra strategia di differenziazione consente la generazione efficiente di corpi embrionali (EB) che si differenziano in una popolazione pura di MSC multipotenti. L'elevato numero di MSC generate da questo metodo fornisce una fonte ideale per la generazione di adipociti. Tuttavia, l'eterogeneità del campione derivante dalla differenziazione degli adipociti rimane una sfida. Pertanto, abbiamo utilizzato un metodo a base di rosso del Nilo per purificare gli adipociti maturi portatori di lipidi utilizzando FACS. Questa strategia di selezione ci ha permesso di stabilire un modo affidabile per modellare i disordini metabolici associati agli adipociti utilizzando un pool di adipociti con ridotta eterogeneità del campione e funzionalità cellulare migliorata.

Introduzione

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) agiscono come un'efficace risorsa transitoria per la produzione di cellule di origine mesodermica come adipociti, osteociti e condrociti, che potrebbero essere ulteriormente utilizzate per modellare le rispettive malattie genetiche. Tuttavia, gli approcci precedenti si basavano sul raggiungimento di queste MSC da tessuti adulti 1, il che imponeva la sfida di ottenerle in numero elevato dai donatori e la limitazione di mantenerle funzionalmente vitali in condizioni di coltura in vitro non ottimali 1,2. Questi ostacoli hanno prodotto una grande richiesta di avere un protocollo per la generazione di MSC in vitro. Le cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) possono essere utilizzate come preziosa fonte di MSC, presentando caratteristiche MSC 3,4,5. Le MSC derivate da iPSCs possono essere utilizzate come opzione terapeutica in diverse malattie. Inoltre, la capacità delle MSC derivate da iPSC di generare adipociti, le rende un prezioso modello umano in vitro per studiare l'adipogenesi umana, l'obesità e i disturbi associati agli adipociti.

Gli attuali protocolli di differenziazione degli adipociti possono essere classificati in due gruppi, uno dei quali coinvolge la differenziazione degli adipociti utilizzando cocktail chimici o a base proteica che danno una resa risultante del 30% -60% 6,7,8,9, mentre l'altro che coinvolge la manipolazione genetica per una robusta induzione dei fattori chiave di trascrizione che governano lo sviluppo degli adipociti per ottenere una resa dell'80% -90% 10, 11. Tuttavia, la manipolazione genetica non ricapitola il naturale processo di differenziazione degli adipociti e spesso maschera i sottili paradigmi che arrivano durante l'adipogenesi, rendendola inefficace ai fini della modellizzazione della malattia12,13. Pertanto, presentiamo un modo per ordinare gli adipociti maturi di derivazione chimica da quelli immaturi etichettando in modo fluorescente gli adipociti portatori di lipidi usando il rosso del Nilo.

Qui presentiamo un protocollo che prevede l'incubazione transitoria di corpi embrioidi derivati da iPSCs (EB) con acido retinoico all-trans per produrre un elevato numero di MSC in rapida proliferazione, che potrebbero essere ulteriormente utilizzati per generare adipociti14. Presentiamo anche un modo per ordinare gli adipociti maturi di derivazione chimica dal pool di differenziazione eterogenea etichettando fluorescentmente le loro goccioline lipidiche usando un colorante lipofilo; Rosso Nilo. Ciò consentirebbe la generazione di una popolazione pura di adipociti maturi con funzionalità migliorata per modellare accuratamente i disturbi metabolici associati agli adipociti.

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Protocollo

Lo studio è stato approvato dal comitato etico di ricerca istituzionale competente ed eseguito seguendo gli standard etici stabiliti nella Dichiarazione di Helsinki del 1964 e nei suoi successivi emendamenti o standard etici comparabili. Il protocollo è stato approvato dall'Institutional Review Board (IRB) di HMC (n. 16260/16) e QBRI (n. 2016-003). Questo lavoro è ottimizzato anche per hESC come H1 e H9. I campioni di sangue sono stati ottenuti da individui sani con pieno consenso informato. Le iPSC sono generate da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di individui sani.

1. Coltura e mantenimento delle iPSC

  1. Preparare le piastre rivestite con matrice di membrana basale ricostituendo la matrice di rivestimento in DMEM knockout in un rapporto di 1:80 e conservare a 4 °C.
  2. Preparare i terreni di coltura per iPSC aggiungendo 50 ml di 10 volte i terreni di integrazione delle cellule staminali a 500 ml di terreni basali delle cellule staminali, insieme a 5 ml di 100 volte la penicillina-streptomicina (P/S) e conservare a 4 °C per un breve termine o a -20 °C per l'uso a lungo termine.
  3. Foderare le piastre con una matrice di rivestimento - 1 mL per una piastra a 6 pozzetti, 500 μL per una piastra a 12 pozzetti, 250 μL per una piastra da 24 pozzetti - e incubare la piastra a 37 °C per 1-2 ore.
  4. Rimuovere un'aliquota di terreni di coltura iPSCs e preriscaldare a temperatura ambiente prima dell'uso.
  5. Scongelare un flaconcino di iPSC (ESC o iPSC) a bagnomaria a 37 °C e trasferirlo in un tubo conico da 15 mL contenente 2-3 mL di terreno di coltura.
  6. Centrifugare il tubo a 120 x g per 4 minuti a temperatura ambiente (RT-23 °C).
  7. Rimuovere il surnatante e aggiungere 2 ml di terreno di coltura fresco integrato con inibitore di 10 μM ROCK (Y-27632). Placcare le celle in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti rivestita di matrice e posizionare la piastra a 37 °C.
  8. Dopo 24 ore, rimuovere il supporto e sostituirlo con nuovi terreni di coltura.
  9. Cambiare il supporto ogni giorno fino a quando le celle raggiungono l'80% -90% di confluenza.
  10. Al raggiungimento della confluenza, le celle di passaggio seguendo i passaggi descritti di seguito.
    1. Rimuovere il mezzo e lavare le cellule con soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco (DPBS).
    2. Aggiungere il reagente di dissociazione delle iPSC (vedere la tabella dei materiali) - 500 μL per un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, 250 μL per un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti - e incubare per 1 minuto a 37 °C.
    3. Rimuovere il reagente di dissociazione e incubare le cellule asciutte per 1 minuto a 37 °C.
    4. Raccogliere le cellule usando terreni di coltura - 1 ml per un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e 250 μL per un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti - in un tubo conico da 15 ml e centrifugare a 120 x g per 4 minuti.
    5. Risospendere le cellule in terreni di coltura-2 ml per un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e 500 μL per un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti integrata con inibitore ROCK 10 μM e placcarle su piastre rivestite di matrice fresca a confluenza del 40%.

2. Differenziazione delle iPSC in MSC

  1. Preparare i terreni di differenziazione MSC aggiungendo il 15% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di P/S a basso glucosio DMEM + piruvato e conservare a 4 °C.
  2. Al raggiungimento dell'80% di confluenza, utilizzare le iPSC per la formazione del corpo embrioide (EB) seguendo i passaggi descritti di seguito.
    1. Lavare le cellule con DPBS e incubarle con mezzo di dissociazione / EDTA-500 μL per un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, 250 μL per un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti.
    2. Incubare a 37 °C per 1 minuto, aspirare il reagente di dissociazione e mantenere le cellule a 37 °C per un ulteriore 1 minuto. Per iniziare la differenziazione MSC, sono necessarie ~10-12 x 106 celle.
    3. Raccogliere le cellule in un tubo conico da 15 mL utilizzando terreni di coltura. Assicurati di essere molto delicato durante la raccolta per evitare che le cellule diventino singole e consentire la formazione di EB. Centrifugare le celle a 120 x g per 4 minuti.
    4. Risospendere le cellule in 3 mL di mezzi di differenziazione MSC contenenti 10 μM di inibitore ROCK.
    5. Mescolare e distribuire 0,5 ml/pozzetto in una piastra di fissaggio ultra-bassa da 24 pozzetti.
      NOTA: L'uso di una piastra di attacco ultra-bassa incoraggerebbe l'aggregazione cellulare in EB piuttosto che il loro attaccamento sulla superficie.
    6. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C.
  3. Dopo 24 ore, indurre gli EB raggiunti con trattamento con acido retinoico (RA) seguendo i passaggi descritti di seguito.
    1. Aggiungere 10 μM RA a 3 mL di mezzi di differenziazione MSC. Raccogliere gli EB in un tubo da 15 ml e lasciarli riposare per 15 minuti.
    2. Rimuovere il surnatante dagli EB e aggiungere i mezzi di differenziazione MSC integrati con 10 μM RA.
    3. Risospendere delicatamente e distribuire 0,5 mL/pozzetto nella stessa piastra di attacco ultra-bassa a 24 pozzetti.
    4. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C. Non disturbare gli EB per le successive 48 ore.
    5. Dopo 48 ore, raccogliere gli EB in una provetta da 15 ml e lasciarli riposare per 15 minuti.
    6. Rimuovere il surnatante dagli EB e aggiungere i mezzi di differenziazione MSC integrati con 0,1 μM RA.
    7. Risospendere delicatamente e distribuire 0,5 mL/pozzetto nella stessa piastra di attacco ultra-bassa a 24 pozzetti.
    8. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C. Non disturbare gli EB per le successive 48 ore.
  4. Rimuovere l'RA aggiunto alle celle seguendo i passaggi descritti di seguito.
    1. Dopo 48 ore dell'ultimo trattamento RA, raccogliere gli EB e lasciarli riposare per 15 minuti.
    2. Rimuovere il surnatante e aggiungere DMEM a basso contenuto di glucosio senza citochine.
    3. Risospendere delicatamente e distribuire 0,5 ml/pozzetto in una piastra di fissaggio ultrabassa da 24 pozzetti. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C.
  5. Placcare gli EB derivati da iPSC seguendo i passaggi descritti di seguito.
    1. Dopo 48 ore dal passaggio precedente (punto 2.4), raccogliere gli EB in una provetta da 15 ml e lasciarli riposare per 15 minuti.
    2. Rimuovere il surnatante e risospendere in 2 mL di nuovo terreno di differenziazione MSC.
    3. Trasferimento in due pozzetti di una piastra a 6 pozzetti rivestita con matrice di membrana basale.
    4. Cambia il supporto a giorni alterni per altri 5 giorni.
    5. Dopo 5 giorni, rimuovere il terreno esaurito e sostituirlo con nuovi terreni di differenziazione MSC contenenti 2,5 ng/ml di fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF).
  6. Passare gli EB placcati quando raggiungono l'80% -90% di confluenza, seguendo i passaggi descritti di seguito.
    1. Lavare le cellule con DPBS, aggiungere tripsina-EDTA-500 μL per un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e incubare le cellule a 37 °C per 3 minuti.
    2. Raccogliere le cellule utilizzando il mezzo di differenziazione MSC in un tubo conico da 15 mL e ruotare a 750 x g per 4 minuti.
    3. Risospendere nei mezzi di differenziazione MSC con 2,5 ng/mL di bFGF e placcare le celle su piastre rivestite con matrice di membrana basale con un rapporto di 1:3.
    4. Ripeti il passaggio quando le celle raggiungono il 70% -80% di confluenza. Si prevede di guadagnare 3-6 milioni di cellule da 2-3 passaggi.

3. Analisi citometrica a flusso di MSC derivate da iPSCs

NOTA: Dopo aver subito 2-3 passaggi, è necessario accedere alle celle per l'efficienza della differenziazione MSC. La differenziazione sarà considerata di successo se le cellule esprimono marcatori di differenziazione MSC - CD44, CD73, CD90 e CD105 con un'efficienza superiore al 90% e non esprimono alti livelli di marcatori ematopoietici - CD14, CD19, CD34 e CD45. È possibile accedere all'efficienza di questi marcatori seguendo i passaggi seguenti.

  1. Far passare le celle utilizzando i passaggi descritti sopra (passo 2.6) e ottenere 1 x 105 celle in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo a V.
  2. Centrifugare la piastra a 375 x g per 4 minuti a 4 °C.
  3. Risospendere 1 x 105 cellule in 100 μL di DPBS freddo con 1 μL di anticorpo coniugato (Ab) (vedere Tabella dei materiali) e incubare a 4 °C per 30-40 minuti evitando l'esposizione alla luce.
  4. Risospendere altre 1 x 105 cellule in 100 μL di DPBS freddo con il rispettivo controllo isotipo dell'Ab coniugato ad una concentrazione di 1:100 ) e incubare a 4 °C per 30-40 minuti evitando l'esposizione alla luce.
  5. Dopo l'incubazione, centrifugare la piastra a 375 x g per 4 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante scuotendo la piastra sopra il lavandino.
  6. Risospendere le cellule in 100 μL di DPBS freddo.
  7. Centrifugare le celle a 375 x g per 4 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
  8. Risospendere le cellule in 200 μL di DPBS freddo e raccogliere in provette di microcentrifuga da 1,5 mL buie e fredde e tenerle sul ghiaccio fino a quando non vengono analizzate mediante selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS).
  9. Per l'analisi FACS, distribuire le celle utilizzando il lato sparso (SSC-A) rispetto al diffuso in avanti (FSC-A) per escludere i detriti. Inoltre, distribuire le cellule gated utilizzando l'altezza diffusa in avanti (FSC-H) rispetto all'area diffusa in avanti (FSC-A) per distinguere i singoletti dai doppietti dalla popolazione di cellule vive.
    NOTA: Le celle sono state controllate rispetto allo spostamento del controllo isotipo per ogni marcatore e per l'analisi è stato utilizzato un minimo di 10.000 eventi controllati da ogni campione colorato.

4. Differenziazione delle MSC in adipociti

  1. Preparare i terreni basali di differenziazione degli adipociti aggiungendo il 10% di siero sostitutivo knockout (KOSR), l'1% di glutammina, l'1% di P/S, 4,5 ng/μL di glucosio al minimo di media essenziali (MEM)-alfa e conservare a 4 °C.
  2. Consentire alle MSC di raggiungere una confluenza superiore al 90%. Continuare a coltivarli per altre 48 ore per consentire loro di subire un periodo di arresto della crescita.
  3. Preparare mezzi completi di differenziazione degli adipociti aggiungendo 100 μg/mL di 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), 1 μM di desametasone, 0,2 U/ml di insulina, 100 μM di indometacina e 10 μM di rosiglitazone ai terreni basali.
  4. Rimuovere i mezzi di differenziazione MSC e lavare le celle utilizzando DPBS.
  5. Aggiungere un mezzo completo di differenziazione degli adipociti - 2 ml per un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e 1 ml per un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti - e incubare le cellule a 37 °C. Cambiare i mezzi di differenziazione completi a giorni alterni per 14 giorni.

5. Valutazione dell'efficienza differenziativa degli adipociti

  1. Il giorno 14 della differenziazione, controllare l'efficienza della differenziazione mediante colorazione delle cellule per i marcatori di maturazione degli adipociti, FABP4 e adiponectina.
  2. Rimuovere il supporto e lavare le celle con DPBS.
  3. Fissare le cellule usando il 4% di paraformaldeide (PFA) - 200 μL in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti - e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
  4. Scartare il PFA e lavare con soluzione salina tris-buffered con interpolazione allo 0,5% (TBST) e posizionarlo su uno shaker a temperatura ambiente per 15 minuti. Ripeti il processo due volte.
  5. Permeabilizzare le celle fisse con soluzione salina tamponata fosfato allo 0,5% Triton X-100 (PBST) e posizionarlo su uno shaker a temperatura ambiente per 15-20 minuti.
  6. Scartare il PBST e aggiungere il tampone bloccante (5%-6% albumina sierica bovina (BSA) in PBST)-500 μL per un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e 250 μL per un pozzetto di una piastra da 12 pozzetti - e incubare a temperatura ambiente sullo shaker per 40-60 minuti.
  7. Diluire gli anticorpi primari contro FABP4, adiponectina in 2%-3% BSA, ad una concentrazione di 1:500 (vedere Tabella dei materiali). Sommare questi anticorpi solo se allevati in animali diversi e posizionare la piastra sull'agitatore a 4 °C, durante la notte.
  8. Rimuovere gli anticorpi primari e lavare le cellule tre volte con TBST (15 minuti ciascuna) e posizionarlo su uno shaker a temperatura ambiente.
  9. Preparare gli anticorpi secondari Alexa Fluor in PBST (1:500). Incubare le cellule nelle combinazioni di anticorpi secondari (secondo la specie in cui viene sollevato l'anticorpo primario) per 60 minuti a temperatura ambiente e coprire la piastra con un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce.
  10. Scartare gli anticorpi secondari, lavare con TBST tre volte e posizionare la piastra sullo shaker.
  11. Per colorare i nuclei, aggiungere 1 μg/mL di Hoechst 33342-200 μL per un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti diluita in PBS e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
  12. Scartare la soluzione di Hoechst e aggiungere PBS-500 μL per un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti alle cellule. Tenere le lastre coperte dalla luce fino a quando non vengono visualizzate utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita.

6. Ordinamento degli adipociti con il rosso del Nilo

  1. Preparare la soluzione di lavoro rosso del Nilo aggiungendo 1 mg/mL di brodo rosso del Nilo in DMSO e conservare a -20 °C. Subito prima dell'uso, scongelare il brodo rosso del Nilo e ricostituire in DPBS per raggiungere una concentrazione della soluzione di lavoro di 300 nM.
  2. Durante o dopo il giorno 14 della differenziazione degli adipociti, eliminare il terreno dalle cellule e lavare utilizzando DPBS.
  3. Aggiungere la soluzione di lavoro rosso del Nilo -1 mL in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti- e incubare a 37 °C per 15 minuti.
  4. Rimuovere la soluzione di rosso del Nilo e aggiungere tripsina-EDTA -500 μL in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e incubare a 37 °C per 4 minuti.
  5. Raccogliere le cellule utilizzando DMEM contenente il 5% di FBS in un tubo conico da 15 ml. Centrifugare a 750 x g per 4 min.
  6. Rimuovere il surnatante e risospendere in DPBS-1 mL per 1 x 106 cellule. Centrifugare a 750 x g per 4 min.
  7. Rimuovere il surnatante e risospendere in DPBS-1 mL per 1 x 106 cellule. Utilizzare uno smistatore FACS per isolare i globuli rossi positivi del Nilo utilizzando il canale FL1.
  8. Ri-coltura delle cellule selezionate in mezzi di differenziazione degli adipociti o raccogliere le cellule selezionate per l'isolamento di RNA e proteine.
  9. Estrarre l'RNA dalle cellule selezionate ed eseguire analisi quantitative relative dei marcatori di differenziazione degli adipociti, tra cui FABP4, PPARG e C / EBPA. I globuli rossi del Nilo mostrano una significativa sovraregolazione nell'espressione genica di almeno due volte rispetto alle cellule non selezionate.

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Risultati

Schema e morfologia delle cellule durante il differenziamento mesenchimale: La differenziazione delle iPSC in MSC coinvolge varie fasi di sviluppo che vanno dalla formazione di EB, alla differenziazione delle MSC e all'espansione delle MSC (Figura 1). Durante queste fasi di sviluppo, le cellule acquisiscono morfologia diversa a causa delle diverse sostanze chimiche stimolatorie a cui sono sottoposte. All'inizio della differenziazione, le celle sono placcate in sospensione e ci si aspetta che...

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Discussione

Questo protocollo riveste un'importanza fondamentale grazie alla sua capacità di fornire MSC in termini di rendimento ed efficienza elevati. Questa produzione su larga scala di MSC è stata resa possibile dall'incubazione transitoria di EB derivate da iPSCs con 10 μM di RA14,15. Il trattamento transitorio con 10 μM di RA ha aumentato la resa MSC da 11,2 a 1542 volte14,15, con questo protocollo applicabile ...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi è stata sostenuta dalla borsa di studio GSRA del Qatar National Research Fund (QNRF).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AdiponectinaAbcamab22554Marker di maturazione degli adipociti
anti-CD105BD Pharmingen560839Marker di differenziazione MSC
anti-CD14BD Pharmingen561712Marcatore di differenziazione MSC
anti-CD19BD Pharmingen555415Marker di differenziazione MSC
anti-CD34BD Pharmingen555824Marcatore di differenziazione MSC
anti-CD44abcamab93758Marcatore di differenziazione MSC
anti-CD45BD Pharmingen
560975		Marcatore di differenziazione MSC
anti-CD73BD Pharmingen550256Marcatore di differenziazione MSC
anti-CD90BD Pharmingen555596Marcatore di differenziazione MSC
bFGFR& D233-FPIntegratore di terreni di coltura MSC
C/EBPAAbcamab40761Marcatore di maturazione degli adipociti
DesametasoneTorics1126Integratore di terreni di differenziazione degli adipociti
FABP4Abcamab93945Marcatore di maturazione degli adipociti
Siero fetale bovinoThermoFisher10082147Integratore di terreni di coltura MSC
GlutamaxThermoFisher35050-061Integratore per terreni di coltura MSC
IBMXSigma AldrichI5879Integratore per terreni di differenziazione degli adipociti
IndometacinaSigma AldrichI7378Integratore per terreni di differenziazione degli adipociti
InsulinaSigma Aldrich91077CIntegratore per terreni di differenziazione degli adipociti
Knockout DMEMThermoFisher12660012Terreni basali per la preparazione di matrigel
DMEM a basso contenuto di glucosioThermoFisher11885084Terreni di coltura MSC
MatrigelCorning354230Matrice di rivestimento
MEM-alfaThermoFisher12561056Terreni di differenziazione degli adipociti
NileredSigmaAldrich 19123Marcatore di selezione per adipociti
PenicillinaThermoFisher15140122Integratore di terreni MSC/Adipocyte
Soluzione salina tamponata con fosfatoThermoFisher14190144tampone
di lavaggio Pierce™ 20X TBS BufferThermo Fisher28358tampone di lavaggio
PPARGTecnologia di segnalazione cellulare2443Marcatore di maturazione degli adipociti
ReLeSRStem Cell Tecnologie5872Reagente di dissociazione
Acido retinoicoSigma AldrichR2625Integratore di terreni di differenziazione MSC
Inibitore delle rocceTocris1254/10Integratore di terreni di coltura hPSC
RoziglitazoneSigma AldrichR2408Integratore di terreni di differenziazione degli adipociti
StemFlexThermoFisherA334901hPSC terreni di coltura
TritonThermo Fisher28314Reagente di permebealizzazione
TripsinaThermoFisher25200072Reagente di dissociazione
Tween 20Sigma AldrichP7942Tampone di lavaggio

Riferimenti

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