Articolo metodologico
Il protocollo consente la generazione di una popolazione di adipociti puri da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). L'acido retinoico viene utilizzato per differenziare le iPSC in cellule staminali mesenchimali (MSC) utilizzate per la produzione di adipociti. Quindi, viene utilizzato un approccio di selezione basato sulla colorazione rossa del Nilo per ottenere adipociti puri.
I recenti progressi nella tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) hanno permesso la generazione di diversi tipi di cellule, compresi gli adipociti. Tuttavia, gli attuali metodi di differenziazione hanno una bassa efficienza e non producono una popolazione omogenea di adipociti. Qui, eludiamo questo problema utilizzando un metodo basato sul retinoico completamente trans per produrre cellule staminali mesenchimali (MSC) ad alto rendimento. Regolando i percorsi che regolano la proliferazione, la sopravvivenza e l'adesione cellulare, la nostra strategia di differenziazione consente la generazione efficiente di corpi embrionali (EB) che si differenziano in una popolazione pura di MSC multipotenti. L'elevato numero di MSC generate da questo metodo fornisce una fonte ideale per la generazione di adipociti. Tuttavia, l'eterogeneità del campione derivante dalla differenziazione degli adipociti rimane una sfida. Pertanto, abbiamo utilizzato un metodo a base di rosso del Nilo per purificare gli adipociti maturi portatori di lipidi utilizzando FACS. Questa strategia di selezione ci ha permesso di stabilire un modo affidabile per modellare i disordini metabolici associati agli adipociti utilizzando un pool di adipociti con ridotta eterogeneità del campione e funzionalità cellulare migliorata.
Le cellule staminali mesenchimali (MSC) agiscono come un'efficace risorsa transitoria per la produzione di cellule di origine mesodermica come adipociti, osteociti e condrociti, che potrebbero essere ulteriormente utilizzate per modellare le rispettive malattie genetiche. Tuttavia, gli approcci precedenti si basavano sul raggiungimento di queste MSC da tessuti adulti 1, il che imponeva la sfida di ottenerle in numero elevato dai donatori e la limitazione di mantenerle funzionalmente vitali in condizioni di coltura in vitro non ottimali 1,2. Questi ostacoli hanno prodotto una gr....
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Lo studio è stato approvato dal comitato etico di ricerca istituzionale competente ed eseguito seguendo gli standard etici stabiliti nella Dichiarazione di Helsinki del 1964 e nei suoi successivi emendamenti o standard etici comparabili. Il protocollo è stato approvato dall'Institutional Review Board (IRB) di HMC (n. 16260/16) e QBRI (n. 2016-003). Questo lavoro è ottimizzato anche per hESC come H1 e H9. I campioni di sangue sono stati ottenuti da individui sani con pieno consenso informato. Le iPSC sono generate da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di individui sani.
1. Coltura e mantenimento delle iPSC
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Schema e morfologia delle cellule durante il differenziamento mesenchimale: La differenziazione delle iPSC in MSC coinvolge varie fasi di sviluppo che vanno dalla formazione di EB, alla differenziazione delle MSC e all'espansione delle MSC (Figura 1). Durante queste fasi di sviluppo, le cellule acquisiscono morfologia diversa a causa delle diverse sostanze chimiche stimolatorie a cui sono sottoposte. All'inizio della differenziazione, le celle sono placcate in sospensione e ci si aspetta che.......
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Questo protocollo riveste un'importanza fondamentale grazie alla sua capacità di fornire MSC in termini di rendimento ed efficienza elevati. Questa produzione su larga scala di MSC è stata resa possibile dall'incubazione transitoria di EB derivate da iPSCs con 10 μM di RA14,15. Il trattamento transitorio con 10 μM di RA ha aumentato la resa MSC da 11,2 a 1542 volte14,15, con questo protocollo applicabile .......
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Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi è stata sostenuta dalla borsa di studio GSRA del Qatar National Research Fund (QNRF).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Adiponectina | Abcam | ab22554 | Marker di maturazione degli adipociti |
| anti-CD105 | BD Pharmingen | 560839 | Marker di differenziazione MSC |
| anti-CD14 | BD Pharmingen | 561712 | Marcatore di differenziazione MSC |
| anti-CD19 | BD Pharmingen | 555415 | Marker di differenziazione MSC |
| anti-CD34 | BD Pharmingen | 555824 | Marcatore di differenziazione MSC |
| anti-CD44 | abcam | ab93758 | Marcatore di differenziazione MSC |
| anti-CD45 | BD Pharmingen | 560975 | Marcatore di differenziazione MSC |
| anti-CD73 | BD Pharmingen | 550256 | Marcatore di differenziazione MSC |
| anti-CD90 | BD Pharmingen | 555596 | Marcatore di differenziazione MSC |
| bFGF | R& D | 233-FP | Integratore di terreni di coltura MSC |
| C/EBPA | Abcam | ab40761 | Marcatore di maturazione degli adipociti |
| Desametasone | Torics | 1126 | Integratore di terreni di differenziazione degli adipociti |
| FABP4 | Abcam | ab93945 | Marcatore di maturazione degli adipociti |
| Siero fetale bovino | ThermoFisher | 10082147 | Integratore di terreni di coltura MSC |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050-061 | Integratore per terreni di coltura MSC |
| IBMX | Sigma Aldrich | I5879 | Integratore per terreni di differenziazione degli adipociti |
| Indometacina | Sigma Aldrich | I7378 | Integratore per terreni di differenziazione degli adipociti |
| Insulina | Sigma Aldrich | 91077C | Integratore per terreni di differenziazione degli adipociti |
| Knockout DMEM | ThermoFisher | 12660012 | Terreni basali per la preparazione di matrigel |
| DMEM a basso contenuto di glucosio | ThermoFisher | 11885084 | Terreni di coltura MSC |
| Matrigel | Corning | 354230 | Matrice di rivestimento |
| MEM-alfa | ThermoFisher | 12561056 | Terreni di differenziazione degli adipociti |
| Nilered | Sigma | Aldrich 19123 | Marcatore di selezione per adipociti |
| Penicillina | ThermoFisher | 15140122 | Integratore di terreni MSC/Adipocyte |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | ThermoFisher | 14190144 | tampone |
| di lavaggio Pierce™ 20X TBS Buffer | Thermo Fisher | 28358 | tampone di lavaggio |
| PPARG | Tecnologia di segnalazione cellulare | 2443 | Marcatore di maturazione degli adipociti |
| ReLeSR | Stem Cell Tecnologie | 5872 | Reagente di dissociazione |
| Acido retinoico | Sigma Aldrich | R2625 | Integratore di terreni di differenziazione MSC |
| Inibitore delle rocce | Tocris | 1254/10 | Integratore di terreni di coltura hPSC |
| Roziglitazone | Sigma Aldrich | R2408 | Integratore di terreni di differenziazione degli adipociti |
| StemFlex | ThermoFisher | A334901 | hPSC terreni di coltura |
| Triton | Thermo Fisher | 28314 | Reagente di permebealizzazione |
| Tripsina | ThermoFisher | 25200072 | Reagente di dissociazione |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7942 | Tampone di lavaggio |
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