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Articolo metodologico
Il presente protocollo descrive la progettazione, la preparazione e la microiniezione di un morfolino bloccante la traduzione contro un gene cardiaco rappresentativo; Derivati del cuore e della cresta neurale espressi2 (hand2) nel tuorlo di embrioni di zebrafish appena fecondati per abbattere la funzione genica. Mostra anche un salvataggio transitorio di questi "morfanti" mediante co-iniezione di mRNA che codifica per questo prodotto genico.
Il sistema di knockdown basato su oligomeri morfolino è stato utilizzato per identificare la funzione di vari prodotti genici attraverso la perdita o la riduzione dell'espressione. I morfolini (MO) hanno il vantaggio della stabilità biologica rispetto agli oligo del DNA perché non sono suscettibili alla degradazione enzimatica. Per un'efficacia ottimale, i MO vengono iniettati in embrioni in stadio da 1 a 4 cellule. L'efficacia temporale del knockdown è variabile, ma si ritiene che i MO perdano i loro effetti a causa della diluizione. La diluizione e la quantità di iniezione di morfolino devono essere attentamente controllate per ridurre al minimo l'insorgenza di effetti fuori bersaglio, mantenendo l'efficacia sul bersaglio. Ulteriori strumenti complementari, come CRISPR/Cas9, dovrebbero essere eseguiti contro il gene bersaglio di interesse per generare linee mutanti e per confermare il fenotipo morficante con queste linee. Questo articolo dimostrerà come progettare, preparare e microiniettare un morfolino che blocca la traduzione contro hand2 nel tuorlo di embrioni di zebrafish in stadio 1-4 cellule per abbattere la funzione hand2 e salvare questi "morfanti" mediante co-iniezione di mRNA che codifica il corrispondente cDNA. Successivamente, l'efficacia delle microiniezioni di morfolino viene valutata verificando prima la presenza di morfolino nel tuorlo (co-iniettato con rosso fenolo) e successivamente mediante analisi fenotipica. Inoltre, verrà discussa l'analisi funzionale cardiaca per testare l'efficacia del knockdown. Infine, verrà spiegata la valutazione dell'effetto del blocco della traduzione genica indotto dal morfolino tramite western blotting.
L'utilizzo del pesce zebra come modello per lo studio dello sviluppo e delle malattie cardiovascolari offre una serie di vantaggi, tra cui un'elevata conservazione della funzione genica, trasparenza ottica, rapido sviluppo cardiovascolare e costi più bassi rispetto ai tradizionali modelli in vivo 1. Gli oligonucleotidi morfolini (MO) sono gli strumenti di knockdown genico antisenso più comunemente usati per il modello di zebrafish. I MO sono spesso utilizzati per determinare un fenotipo o per sondare la funzione genica. Il Dr. James Summerton ha inizialmente sviluppato il sistema di somministrazione di....
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Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con gli standard accettati per la cura umana degli animali secondo la regolamentazione dell'IACUC a QU; gli animali sono stati tenuti nella struttura del pesce zebra sotto il Qatar University Biomedical Research Center (QU-BRC). Tutti gli animali utilizzati in questi studi sperimentali erano sotto i 3 giorni dopo la fecondazione (dpf).
NOTA: Per ogni gruppo sperimentale, si consiglia di utilizzare almeno 30 embrioni per rigore statistico. I gruppi sperimentali sono i seguenti:
Gruppo di controllo: Questo gruppo comprende embrioni coltivati i....
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Il grafico nella Figura 6 illustra la percentuale media di embrioni sopravvissuti a 24, 48 e 72 hpf sia per MO specifico per HAND2 che per gli embrioni MO criptati di controllo. Gli embrioni iniettati con MO da 1 mM (8 ng/μL) e 0,8 mM (6,4 ng/μL) hanno mostrato una significativa riduzione della percentuale di sopravvivenza rispetto agli embrioni di controllo con MO iniettati. Questo è stato osservato in ogni punto temporale misurato in cui è stata osservata letalità o malformazione. I risult.......
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La tecnologia Morpholino (MO) è stata ampiamente utilizzata in zebrafish, xenopus, ricci di mare e, più recentemente, in sistemi modello di colture cellulari. Con la maggior parte dei metodi, insieme ai vantaggi, ci sono anche insidie di cui lo sperimentatore dovrebbe essere consapevole. Una delle principali insidie con la tecnologia MO include la preoccupazione che gli effetti fenotipici osservati dall'approccio knockdown genico mediato da MO non siano dovuti alla perdita di funzione as.......
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Gli autori dichiarano interessi finanziari o altri conflitti di interesse.
La pubblicazione di questo articolo è stata coperta con un generoso sostegno da parte di BARZAN HOLDINGS. RR è in parte supportato da R61HL154254 e fondi del Dipartimento di Pediatria e dell'Ospedale Pediatrico.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acrilammide 40% | Sigma | Sigma, n. cat. C977M88 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | Sigma-Aldrich n. cat. A9539-250G | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | Qiagen n. cat. 80204. | |
| alfa Tubulina | Abcam | Abcam- ab4074 | Coniglio policlonale a alfa Tubulina lotto GR3 180877-1 (50 kDa) |
| Ammonio persolfato grado molecolare | Sigma | Sigma, cat. no C991U65 | |
| BV10 smussatore capillare | Sutter Instruments Prodotto Sutter Instruments | Catalogo prodotti # BV10 | |
| Chemiluminescenza Imaging Gene Gnome | SYNGENE SYNGENE | ||
| Cleaver Scientific Blotting | CVS10D_OmniPAGEMini | CVS10D_OmniPAGEMini | |
| Coomassie | Thermo | Fisher Thermo Fisher cat. no C861C44 | |
| Kit per elettrochemiluminescenza (ECL) | Abcam Biochemicals | Abcam Biochemicals cat. ab65623 | |
| Glycine | Sigma | Sigma, cat. no C988U91 | |
| Capra anti Coniglio | Abcam | abcam- ab6721 | Capra Anti-Coniglio IgG H& L (HRP) 2nd anticorpi lotto GR3179871-1 |
| HAND2 | Strumenti genetici | Su misura per HAND2 (NM_021973) | 5'-CCTCCAACTAAACTCATGGCGAC AG-3'Hand2 |
| Abcam | Abcam- ab10131 | Coniglio policlonale Anti-HAND2 anticorpo lotto GR143200-9 (24-26 kDa) | |
| HAND2 (NM_021973) Umano Tagged ORF Clone | OriGene Technologies, Inc | RC224436L3 | Vettore: pLenti-C-Myc-DDK-P2A-Puro (PS100092) |
| IBI Kit di estrazione DNA/RNA/Proteine | IBI Scientific | IBI Scientific cat. no -r IB47702 | |
| Sistema di imaging | iBright | iBright CL1000 Sistema | |
| Isopropanolo | Sigma-Aldrich | Sigma-Aldrich cat. no 278475-2L | |
| Tampone di caricamento del campione Laemmli (4x) | Sigma-Aldrich | Sigma-Aldrich cat. no 70607 | |
| Mercaptoetanolo | Sigma | Sigma, cod. M6250-1L | |
| Spettrofotometro per micropiastre con interfaccia software Gen5 | Data Analysis Microscopio Epoch | Epoch | |
| Ziess SteREO Lumar V12 Microscopio a fluorescenza | Ziess SteREO Lumar V12 Microscopio | ||
| Olio minerale | Fisher Scientific | Fisher Scientific cat. no 0121-1 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7/T3/SP6 Kit di trascrizione | Thermo Fisher Thermo | Fisher cat. AM1340 | per la generazione di mRNA |
| Acqua priva di nucleasi | New England Biolabs | New England Biolabs cod. B1500L | |
| PC-100 Estrattore per micropipette | NARISHIGE GROUP Prodotto NARISHIGE | GROUP Catalogo prodotti # PC-100 | |
| Rosso fenolo | Sigma | Sigma, cat. n. P-0290 | |
| Iniettore di picolitre | Harvard | Apparatus Harvard Apparatus cataloge # PLI-90A | |
| Kit per il dosaggio delle proteine del test dell'acido bicinconninico (BCA) | Thermo Fisher | Thermo Fisher n. cat. 23227 | |
| PMSF, Inibitore della proteasi come inibitore della proteasi | Thermo | Fisher Thermo Fisher n. cat. 36978 | |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | Sigma-Aldrich cat. n. 10165921001 | |
| Cocktail di inibitori della proteasi | Thermo | Fisher Thermo Fisher n. cat. 88668 | |
| Scala proteica | SMOBiO | SMOBiO cat. n. PM2500 | |
| Saggio di radioimmunoprecipitazione (RIPA) | Thermo Fisher | Thermo Fisher cat. n. 89900 | |
| Ringer' s soluzione | Thermofisher | Codice prodotto: S25513 | |
| SDS | Sigma | Sigma, cat. no 436143 | |
| Standard Control | Gene tools | SKU: PCO-StandardControl-100 | 5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTAT A-3'- che ha come bersaglio una mutazione dell'introne della beta-globina umana |
| Stripping buffer | Sigma-Aldrich | Sigma-Aldrich cat. 21059 | |
| Temed | IBI scientifico | IBI scientifico cat. no C000A52 | |
| Tris Base | Thermo Fisher | Thermo Fisher cat. no BP-152-500 | |
| Tween | sigma life science | sigma life science cat. no P2287 | |
| Zebra Box Revolution-Danio Camera di sistema Track con il software EthoVision XT 11.5 | Noldus Information Technology, NL | Noldus Information Technology, NL | |
| Zeiss Axiocam ERc 5s | Zeiss | Stemi 508 Zeiss | |
| Zeiss Stemi 2000-C | Zeiss | Stemi 2000-C |
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