Progettazione e microiniezione di oligonucleotidi morfolino antisenso e mRNA in embrioni di zebrafish per chiarire la funzione genica specifica nello sviluppo cardiaco

Sommario

Il presente protocollo descrive la progettazione, la preparazione e la microiniezione di un morfolino bloccante la traduzione contro un gene cardiaco rappresentativo; Derivati del cuore e della cresta neurale espressi2 (hand2) nel tuorlo di embrioni di zebrafish appena fecondati per abbattere la funzione genica. Mostra anche un salvataggio transitorio di questi "morfanti" mediante co-iniezione di mRNA che codifica per questo prodotto genico.

Abstract

Il sistema di knockdown basato su oligomeri morfolino è stato utilizzato per identificare la funzione di vari prodotti genici attraverso la perdita o la riduzione dell'espressione. I morfolini (MO) hanno il vantaggio della stabilità biologica rispetto agli oligo del DNA perché non sono suscettibili alla degradazione enzimatica. Per un'efficacia ottimale, i MO vengono iniettati in embrioni in stadio da 1 a 4 cellule. L'efficacia temporale del knockdown è variabile, ma si ritiene che i MO perdano i loro effetti a causa della diluizione. La diluizione e la quantità di iniezione di morfolino devono essere attentamente controllate per ridurre al minimo l'insorgenza di effetti fuori bersaglio, mantenendo l'efficacia sul bersaglio. Ulteriori strumenti complementari, come CRISPR/Cas9, dovrebbero essere eseguiti contro il gene bersaglio di interesse per generare linee mutanti e per confermare il fenotipo morficante con queste linee. Questo articolo dimostrerà come progettare, preparare e microiniettare un morfolino che blocca la traduzione contro hand2 nel tuorlo di embrioni di zebrafish in stadio 1-4 cellule per abbattere la funzione hand2 e salvare questi "morfanti" mediante co-iniezione di mRNA che codifica il corrispondente cDNA. Successivamente, l'efficacia delle microiniezioni di morfolino viene valutata verificando prima la presenza di morfolino nel tuorlo (co-iniettato con rosso fenolo) e successivamente mediante analisi fenotipica. Inoltre, verrà discussa l'analisi funzionale cardiaca per testare l'efficacia del knockdown. Infine, verrà spiegata la valutazione dell'effetto del blocco della traduzione genica indotto dal morfolino tramite western blotting.

Introduzione

L'utilizzo del pesce zebra come modello per lo studio dello sviluppo e delle malattie cardiovascolari offre una serie di vantaggi, tra cui un'elevata conservazione della funzione genica, trasparenza ottica, rapido sviluppo cardiovascolare e costi più bassi rispetto ai tradizionali modelli in vivo ¹. Gli oligonucleotidi morfolini (MO) sono gli strumenti di knockdown genico antisenso più comunemente usati per il modello di zebrafish. I MO sono spesso utilizzati per determinare un fenotipo o per sondare la funzione genica. Il Dr. James Summerton ha inizialmente sviluppato il sistema di somministrazione di morfolino per l'inibizione in vivo della traduzione dell'mRNA come tentativo di sviluppare terapie per i difetti dello sviluppo umano ^2,3. I MO sono stati utilizzati per organismi modello in vitro e in vivo per abbattere i geni e studiare le conseguenze di questo knockdown sul fenotipo. Questo viene fatto osservando alterazioni nello sviluppo di organi specifici, ad esempio il cuore. Il knockdown di geni specifici per il cuore negli embrioni di zebrafish WT ha portato al fallimento di un battito cardiaco adeguato, attestando la funzione indispensabile di questi geni per lo sviluppo del cuore ^4,5. Questi fenotipi sono stati recuperati mediante co-iniezione di mRNA per i geni specifici. Uno studio che ha coinvolto la troponina T cardiaca (Tnnt2) ha dimostrato che l'espressione dell'mRNA tnnt2 a lunghezza intera potrebbe salvare i fenotipi sarcomerici causati dal knockdown del morfolino⁶. Un altro studio ha rivelato che l'integrità delle bande A e dei dischi Z potrebbe essere ripristinata dalla sovraespressione dell'mRNA dell'ortologo regolatorio della catena leggera della miosina (cmlc2) nei morficanti cmcl2 ⁷.

I MO sono comunemente usati per abbattere l'espressione genica mirando allo splicing del pre-mRNA o bloccando la traduzione. I MO che bloccano lo splicing si legano e inibiscono il pre-mRNA inibendo lo splicesoma. Il blocco traduzionale si verifica quando il MO si lega alla regione 5'-non tradotta dell'mRNA complementare per ostacolare l'assemblaggio del ribosoma. I MO sono il metodo gene-specifico più utilizzato per abbattere l'espressione genica per i modelli in vivo ; sono anche gli agenti bloccanti dell'mRNA più efficienti utilizzati nelle colture cellulari. Il morfolino stesso è tipicamente costituito da una catena corta (circa 25) di basi di subunità del morfolino. Ogni subunità MO include una base di acido nucleico, un anello morfolino e un fosforodiamidato non ionico. I diversi meccanismi d'azione per i due tipi di MO richiedono test diversi per verificare l'efficacia del knockdown. Per i MO che bloccano la traduzione, un'analisi western blot è il test di efficacia più affidabile, poiché la proteina di interesse non dovrebbe essere prodotta a causa del blocco del sito di inizio della traduzione dell'ATG. I MO non degradano direttamente il loro mRNA bersaglio; Invece, si legano a regioni specifiche e inibiscono l'espressione fino a quando non vengono degradate naturalmente. Tuttavia, i MO che bloccano lo splicing modificano il pre-mRNA inducendo la modifica dello splicing, che può essere analizzata mediante reazione a catena della polimerasi trascrittasi inversa (RT-PCR) e elettroforesi su gel.

Tre parti cruciali del processo di screening dei MO devono essere standardizzate: (i) La curva di dose dei MO deve essere regolata per il riconoscimento fenotipico. La curva della dose mostra anche la dose letale 50 (LD50: la dose alla quale muore il 50% degli embrioni iniettati) per ogni MO testato per migliorare la capacità di ottimizzare il "segnale" fenotipico rispetto al "rumore" fuori ^bersaglio3. ii) la nomenclatura fenotipizzante che è stata adattata dovrebbe essere ben documentata; Una descrizione fenotipica precisa e facilmente comprensibile è fondamentale per fornire spiegazioni estese basate sulla letteratura esistente e sull'esperienza degli sperimentatori, al fine di facilitare la condivisione delle informazioni tra coloro che non hanno esaminato direttamente gli embrioni. (iii) Avere un linguaggio ben definito facilita la raccolta centralizzata dei dati da Morpholino^{Database 8}.

Negli studi di knockdown di MO per i geni cardiaci, l'attività cardiaca e la dinamica del flusso sanguigno degli animali devono essere monitorate al fine di determinare l'impatto degli esperimenti di knockdown di MO sulla funzione del sistema cardiovascolare. Tali analisi richiedono la visualizzazione in tempo reale del sistema cardiovascolare ad alta risoluzione. La pelle del pesce zebra è trasparente per la prima settimana di sviluppo, consentendo la visualizzazione del cuore e della circolazione sanguigna tramite microscopia. Per la valutazione della funzione cardiaca, i parametri fisiologici più calcolati sono la frequenza cardiaca e la gittata cardiaca, nonché l'accorciamento frazionario, la variazione frazionaria dell'area e la frazione di eiezione. Le velocità del flusso sanguigno possono essere misurate tracciando i globuli rossi in movimento e queste misurazioni vengono utilizzate per determinare i livelli di stress di taglio, un fattore meccanobiologico cruciale sulle cellule endoteliali. Tale valutazione richiede la registrazione di filmati time-lapse per il battito cardiaco e il flusso di sangue tramite un microscopio invertito o uno stereomicroscopio dotato di una telecamera ad alta velocità.

Questo articolo mostra come progettare, preparare e microiniettare un morfinolino che blocca la traduzione contro un gene di interesse nel tuorlo di embrioni di pesce zebra appena fecondati per abbattere la funzione genica. Mostrerà anche il salvataggio di questi "morfanti" mediante co-iniezione di mRNA che codifica per questo gene. Analizzeremo quindi l'efficacia delle microiniezioni di morfolino attraverso caratterizzazioni fenotipiche e analisi strutturali e funzionali cardiache. Questo approccio sarà dimostrato su un gene cardiaco ampiamente studiato, hand2.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con gli standard accettati per la cura umana degli animali secondo la regolamentazione dell'IACUC a QU; gli animali sono stati tenuti nella struttura del pesce zebra sotto il Qatar University Biomedical Research Center (QU-BRC). Tutti gli animali utilizzati in questi studi sperimentali erano sotto i 3 giorni dopo la fecondazione (dpf).

NOTA: Per ogni gruppo sperimentale, si consiglia di utilizzare almeno 30 embrioni per rigore statistico. I gruppi sperimentali sono i seguenti:

Gruppo di controllo: Questo gruppo comprende embrioni coltivati in acqua d'uovo senza iniezioni. I risultati qui formeranno la linea di base del controllo.

Gruppo di controllo negativo: Questo gruppo comprende embrioni coltivati in acqua d'uovo iniettati con MO strapazzati.

Gruppo iniettato: Questo gruppo comprende embrioni iniettati con l'mRNA hand2 MO da solo e hand2 MO con l'mRNA hand2 per salvare il fenotipo. I risultati qui confermeranno che i fenotipi osservati sono apparsi a causa di MO iniettati. Il confronto tra i gruppi sperimentali consentirà di valutare con precisione l'influenza dell'inibizione e del salvataggio della mano2 sulla funzione cardiaca.

1. Disegni Morpholino per mano2.

NOTA: Le sequenze MO possono essere adattate dalla letteratura ^9,10,11. In alternativa, questi oligo possono essere progettati online da Gene-tools. Gene-tools offre un servizio di progettazione online gratuito e veloce, a cui è possibile accedere tramite il loro sito web¹². Un MO personalizzato può essere facilmente progettato fornendo informazioni sui geni di interesse, come le informazioni sulla sequenza o i numeri di accesso. I seguenti passaggi specifici riassumono come progettare MO contro hand2 in zebrafish:

1. Innanzitutto, cerca i dettagli del gene di interesse dal database NCBI. Per hand2, in zebrafish¹³.
2. Ottieni l'ID della trascrizione dell'mRNA GenBank da NCBI¹⁴.
3. Ottenere la sequenza di mRNA da NCBI¹⁵.
   NOTA: Gli oligonucleotidi antisenso modificati con morfolino (MO) per il gene hand2 del pesce zebra sono disponibili e sono stati precedentemente pubblicati. mano2 Sequenza MO ^9,10,11: 5'-CCTCCAACTAAACTCATGGCGACAG-3', le sequenze MO utilizzate nello studio sono elencate nella Tabella dei Materiali.
4. Ottenere un controllo negativo da un MO non corrispondente o criptato (sequenze simili con cambiamenti casuali di coppie di basi) dagli strumenti genetici¹⁶ da iniettare. Ciò aiuterebbe ad attestare la specificità del/i fenotipo/i osservato/i in specifiche iniezioni di MO e a ridurre al minimo il rischio che gli effetti osservati derivino da un artefatto della procedura di iniezione.

2. Preparazione dell'iniezione di morfolino

1. Preparazione del brodo
   1. Sciogliere le scorte di MO con ddH₂O; Il dietil pirocarbonato (DEPC) può danneggiare i MO ed essere tossico per gli embrioni. Quindi, utilizzare ddH₂O senza DEPC. Al momento dell'ordine, i MO vengono consegnati in una fiala a una concentrazione di 300 nM.
      NOTA: Sebbene Gene Tools raccomandi 1 mM di soluzioni stock (~8 ng/nL), questo può essere troppo basso, soprattutto se il morfolino richiede una dose elevata o è miscelato con altri MO. Pertanto, è ideale per realizzare varie concentrazioni di soluzioni stock MO (2 o 3 mM).
   2. Preparare una soluzione di lavoro 0,2 mM subdiluendo la soluzione di lavoro (ad esempio, per 2 mM di materiale, diluizione 1:10). Preparare 10 μl di soluzione di lavoro aggiungendo la soluzione di Danieaux (7 μl), il morfolino madre (1 μl) e il rosso fenolo (2 μl da 10 μl). Il rosso fenolo conferisce alla soluzione un colore rosso scuro per aiutare a tracciare il materiale iniettato nell'embrione.
   3. Conservare i MO a temperatura ambiente (RT) in contenitori ermetici per evitare l'evaporazione. Non tenere i MO sul ghiaccio sul piano di lavoro, poiché la soluzione potrebbe precipitare. La gestione RT è la più appropriata.
      NOTA: Gene Tools raccomanda uno dei due metodi di conservazione per i MO: la soluzione di lavoro può essere conservata a -20 °C (per molti mesi o anni) o RT in una provetta sigillata per la conservazione a lungo termine. Se mantenuto a -20 °C, riscaldare la soluzione oligonucleotidica a 65 °C per 10 minuti e agitare per sciogliere completamente il morfolino prima dell'uso (non è necessario riscaldarlo se tenuto a RT).
2. Trascrizione in vitro dell'mRNA
   NOTA: La trascrizione in vitro è stata utilizzata per generare mRNA di Hand2 da Plasmid HAND2 (NM_021973) Human Tagged ORF Clone da microiniettare in embrioni di zebrafish per salvare il fenotipo dovuto all'abbattimento di zebrafish hand2 utilizzando morfolini, i dettagli del plasmide utilizzati nello studio sono elencati nella Tabella dei materiali.
   1. Linearizzare il DNA plasmidico con un enzima di restrizione appropriato e purificarlo utilizzando un kit di purificazione del DNA (Tabella dei materiali). Utilizzare il DNA linearizzato purificato come modello per la trascrizione in vitro per generare mRNA iniettabile secondo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali).
   2. Infine, iniettare 250 pg di mRNA umano per il gene di interesse per eseguire il salvataggio del fenotipo per verificare se la mancanza di un fenotipo è effettivamente dovuta alla perdita del gene del pesce zebra da parte di MO.
3. Preparazione all'iniezione
   1. Estrarre un ago utilizzando un estrattore per micropipette (Tabella dei materiali), seguendo i passaggi 2.3.2-2.3.6.
   2. Utilizzare tubi capillari da 1 mm con filamenti e un estrattore per micropipette. Accendere la macchina e aprire il coperchio
   3. Ruotare la manopola di selezione della modalità su NO.2 Riscaldatore. Utilizzando il riscaldatore NO.2 , regolare la manopola per portare il calore a 68 °C
   4. Riportare la manopola di selezione della modalità sulla posizione del passaggio 1 . Usa quattro pesi (2 tipo leggero / 2 tipo pesante)
   5. Posizionare il capillare sul supporto e chiudere il coperchio. Premere il pulsante Start per ottenere l'ago estratto.
      NOTA: Questo genererà aghi capillari con una lunga conicità
   6. Tagliare brevemente la punta degli aghi, usando una pinza. Affilare la punta dell'ago tirato per una facile penetrazione negli embrioni di zebrafish utilizzando uno smussatore capillare per circa 30 s, ottenendo punte con diametri di circa 15-25 μm.
   7. Calibrare l'ago per stimare la quantità di iniezione seguendo i passaggi 2.3.8-2.3.13.
   8. Mescolare brevemente la soluzione di mRNA/morfolino prima di caricarla nell'ago per sciogliere le particelle che potrebbero ostruire completamente l'ago.
   9. Aggiungere ~3-4 μL di soluzione di MO nella parte posteriore dell'ago per iniezione utilizzando una punta per pipetta con punta in micron. Gli aghi per iniezione sono dotati di una piccola trincea per facilitare il riempimento capillare.
   10. Verificare che non ci siano bolle nell'ago per iniezione. Montare l'ago sul microiniettore.
   11. Verificare che la punta dell'ago non sia ostruita e che la soluzione di MO possa fuoriuscire dall'ago premendo il pedale di iniezione.
   12. Calibrare il volume di iniezione misurando la dimensione delle goccioline. Mettere la punta dell'ago in olio minerale su un vetrino micrometrico. Premere il pedale di iniezione e regolare la pressione di iniezione (espulsione) (psi) e/o il tempo di iniezione (ms) fino a quando il diametro della goccia espulsa è di 0,1 mm, corrispondente a 0,5 nL.
   13. Assicurarsi che il volume di iniezione sia di circa 0,5-1 nL. Regolare il volume modificando la pressione di iniezione (espulsione) (psi) o il tempo (ms).
   14. Per il protocollo di configurazione dell'iniettore picolitro, seguire i passaggi 2.3.15-2.3.16
   15. Utilizzare l'iniettore di picolitri per le iniezioni di pesce zebra. Accendere la pompa di alimentazione dell'iniettore.
   16. Preparare l'iniettore secondo i requisiti mostrati di seguito:
       1. Saldo P: Assicurati che il saldo P sia intorno a 0. Assicurarsi che sia leggermente negativo per evitare che il tuorlo rifluisca nell'ago, diluendo la soluzione di MO nell'ago. Al contrario, se la contropressione è troppo alta, il MO uscirà costantemente dall'ago anche senza l'esercizio di pressione sul pedale, con conseguente variabilità e incongruenze nella dose iniettata e nei fenotipi osservati.
       2. Iniezione P: 20-25 psi è l'ideale; Modificare questa opzione per regolare il volume di iniezione. Questo può variare da 10 a 30 psi, ma inizia con ~20 psi per verificare se fornisce il volume desiderato.
       3. Tempo di iniezione: Assicurarsi di ridurre il tempo di iniezione a 300 ms. Prima di regolare il volume di iniezione, regolare il tempo di iniezione.
   17. Per l'iniezione di morfinolino, seguire i passaggi 2.3.18-2.3.19.
   18. Preparare la camera di iniezione come segue: Produrre il 2% di agarosio da 0,6 g di agarosio e 30 ml di terreno E3. Versare l'agarosio in una capsula di Petri e posizionare uno stampo a iniezione sull'agarosio utilizzando uno stampo a iniezione TU-1. Una volta raffreddati in un congelatore, si formeranno solchi per il posizionamento e la stabilizzazione degli embrioni (Figura 1A).
       NOTA: La ricetta della soluzione madre 60x E3M è composta da 5,0 mM di NaCl, 0,17 mM di KCl, 0,16 mM di MgSO 4,7H ₂O, 0,4 mM di CaCl₂·2H₂O in 1 L ddH₂O con un pH finale di 7,6.
   19. Trasferire gli embrioni raccolti nei solchi utilizzando una pipetta di trasferimento, rimuovere tutto il terreno E3 in eccesso intorno agli embrioni per evitare che gli embrioni galleggino (Figura 1B).

3. Iniezione di MO e soluzione di mRNA nel tuorlo

1. Inserire l'ago attraverso il corion, iniettare vicino al confine della cellula/tuorlo sul lato dell'embrione e premere il pedale di iniezione (Figura 1C).
   NOTA: La soluzione di MO iniettata/rosso fenolo non si diffonderà immediatamente all'interno del tuorlo. Si osserverà una macchia rossa nel tuorlo che si dissipa gradualmente. Il materiale iniettato non deve superare il 10% della dimensione dell'embrione. I MO possono essere microiniettati nel tuorlo delle uova di zebrafish appena deposte fino allo stadio di 8 cellule perché i MO possono essere facilmente assorbiti nel flusso citoplasmatico del sacco vitellino dalle cellule in via di sviluppo^17,18. Nelle iniezioni di plasmidi o di mRNA tappato, l'iniezione deve essere eseguita in un singolo blastomero di un embrione in stadio unicellulare.
2. Trasferire gli embrioni in una capsula di Petri con terreno E3 e incubarli a 28 °C fino a 3 dpf, con rifornimento giornaliero di terreno E3. A quel punto, eseguire la valutazione fenotipica utilizzando un microscopio.
   NOTA: Le soluzioni di MO devono essere accuratamente diluite per ogni indagine per stabilire la concentrazione più bassa necessaria per indurre un fenotipo specifico. Deve essere determinata anche la letalità embrionale per ciascun MO. A concentrazioni più elevate (superiori a 4-10 ng, a seconda del MO), i MO tendono a suscitare effetti non specifici, come la morte cerebrale o cellulare generale.
3. Co-iniettare MO con 250 pg di mRNA di mano umana2 allo stesso modo per confermare il salvataggio del fenotipo indotto dalla perdita del gene hand2 del pesce zebra da parte di MO.

4. Western blot per verificare il successo del knockdown di morfolino

1. Raccogli gli embrioni in momenti specifici (48 hpf, 72 hpf) e dechorionato se necessario utilizzando l'enzima pronasi.
2. Deyolk degli embrioni per rimuovere la Vitellogenina utilizzando una metodologia precedentemente nota¹⁹.
   NOTA: La vitellogenina è una fosfolilipo-glicoproteina che funge da fonte di nutrienti per l'embrione in crescita. L'elettroforesi su gel 2D ad alta risoluzione e il western blotting notevolmente migliorati sono resi possibili dal deyolking degli embrioni e dalla rimozione della vitellogenina.
3. Eseguire il western blotting come descritto in precedenza²⁰.

5. Valutazione della struttura e della funzione cardiaca:

1. Imaging dal vivo del pesce zebra: Imaging del ventricolo
   NOTA: Diversi parametri di funzione cardiaca/emodinamica possono essere calcolati visualizzando il cuore pulsante dell'embrione di zebrafish^21,22. Questi parametri includono la gittata cardiaca (CO), la frazione di eiezione (EF), la gittata sistolica (SV), l'accorciamento frazionario (FS) e la variazione frazionaria dell'area (FAC) (si vedano i documenti precedenti che coinvolgono protocolli dettagliati per la valutazione della funzione cardiaca per gli embrioni di zebrafish^22,23). I passaggi seguenti spiegano brevemente come calcolare questi parametri per gli embrioni di zebrafish a ~3 dpf, una fase in cui la pelle di questi organismi è trasparente, consentendo la visualizzazione con la microscopia a campo chiaro.
   1. Inserire una goccia di soluzione di metilcellulosa (RT) al 3% nel vetrino di imaging del pozzetto concavo.
   2. Posizionare l'embrione di Zebrafish nel pozzetto utilizzando un contagocce di plastica adatto (Figura 2A, B)
      NOTA: Un riempimento eccessivo del pozzo può causare lo spostamento dei pesci fuori dal pozzo.
   3. Mescolare delicatamente la goccia di metilcellulosa al 3% con il terreno E3 per stabilizzare l'embrione schiuso.
      NOTA: Per preparare una soluzione di metilcellulosa al 3%, sciogliere 3 g di polvere di metilcellulosa in 100 mL di PBS, o altro mezzo di montaggio, in un pallone. Posizionare un magnete per mescolare nel pallone della miscela e posizionare il pallone su una piastra magnetica per agitare. Impostare la velocità su "bassa" e mantenerla a 4 °C per ~1 giorno per sciogliere tutti i grumi. Una volta che la metilcellulosa è completamente disciolta, aliquotare in piccole provette e conservare a -20 °C.
   4. Posizionare il pesce alla sua sinistra, con il lato destro rivolto verso l'alto e la punta anteriore a sinistra per facilitare l'imaging inequivocabile per il ventricolo (Figura 2C).
   5. Al microscopio, ingrandisci il cuore dell'embrione con un ingrandimento di 100x e inizia a registrare per ~5 s. Assicurarsi che i bordi del ventricolo siano all'interno della finestra di imaging (Figura 2D).
   6. Registra filmati time-lapse utilizzando una fotocamera ad alta velocità e uno stereomicroscopio a circa 100 fotogrammi al secondo (fps) dell'intero embrione (Figura 2C), del ventricolo battente (Figura 2D) e dei globuli rossi in movimento (RBC) nei vasi principali, come l'aorta dorsale o la vena cardinale posteriore (Figura 2E), per l'analisi della funzione cardiaca.
   7. Salvate il filmato in formato AVI o in formato TIFF (o JPEG) delle sequenze di immagini.
2. Calcola la frequenza cardiaca
   1. Calcola il tempo necessario per registrare due fotogrammi consecutivi. Per 100 fps l'intervallo di tempo è pari a 0,01 s.
   2. Scegli un punto noto da qualsiasi ciclo cardiaco registrato (ad esempio, fine diastole o fine sistole). Calcola il numero di fotogrammi necessari per ripetere il ciclo.
   3. Moltiplicare l'intervallo di tempo dal passaggio 5.2.1 per il numero di fotogrammi dal passaggio 5.2.2. Il risultato è la durata (in secondi) di un heartbeat.
   4. Per calcolare i battiti al minuto, dividere 60 per il numero ottenuto nel passaggio precedente. Per gli embrioni normali a 3 dpf, questo dovrebbe essere di circa 150 bpm (2,5 Hz).
      NOTA: Molte applicazioni software possono calcolare automaticamente la frequenza cardiaca dalle registrazioni del battito cardiaco come ViewPoint²⁴ e DanioVision²⁵.
   5. Analizzare la struttura cardiaca utilizzando un filmato time-lapse a circa 100 fps per controllare l'intero cuore per rilevare la presenza di edema cardiaco o qualsiasi altro difetto strutturale.
      NOTA: La Figura 3A mostra un cuore di embrione normale con 3 dpf e la Figura 3B mostra un cuore con 3 dpf con edema cardiaco e difetto di loop cardiaco (ventricolo allungato).
3. Calcola la variazione frazionaria dell'area (FAC):
   NOTA: La variazione frazionaria dell'area (FAC) è un parametro utilizzato per confrontare le aree di telediastole ventricolare e di fine sistole per valutare la contrattilità del ventricolo.
   1. Utilizzare un filmato time-lapse di registrazione a circa 100 fps per determinare i fotogrammi che rappresentano un ciclo cardiaco. Estrarre i fotogrammi che mostrano la fine sia dell'estremità della sistole che dell'estremità diastole.
   2. Calcola sia l'area di fine diastole (EDA) che l'area di fine sistole (ESA) utilizzando ImageJ o un software di analisi delle immagini simile.
   3. Utilizzare la seguente formula per calcolare FAC 22,26,27:
      FAC
4. Calcola l'accorciamento frazionario (FS):
   NOTA: L'accorciamento frazionario (FS) è un altro parametro utilizzato per valutare la contrattilità del ventricolo; per determinare la FS, i diametri telediastolico e telesistolico dei ventricoli devono essere misurati²¹.
   1. Ripetere il passaggio 5.3.1
   2. Utilizzare ImageJ o qualsiasi altro programma di analisi delle immagini equivalente per misurare i diametri delle pareti ventricolari nei punti D_d della diastole e D_s della sistole terminale. Nella maggior parte dei casi, i diametri dell'asse corto vengono utilizzati per determinare la levigatezza frazionaria (FS) (Figura 4).
   3. Utilizzare la seguente formula per calcolare FS^22,27:
      FS
5. Calcolo della gittata sistolica (SV):
   NOTA: Per ogni battito cardiaco, la SV è la quantità di sangue pompata dal ventricolo, che è facilmente calcolabile dai volumi di fine diastole e fine sistole dei ventricoli²⁸.
   1. Ripetere i passaggi 5.3.1 e 5.3.2
   2. Misurare i diametri della diastole (D_L) e della sistole (DS) come mostrato nella Figura 4.
      NOTA: Supponendo che i ventricoli dei cuori di pesce zebra abbiano una forma di sferoidale prolato ^21,22, il volume del ventricolo viene calcolato utilizzando la seguente formula.
      Volume
      SV può essere calcolato seguendo la seguente formula²⁷. L'intervallo SV normale è 0,15-0,3 nL per embrioni^{2-6 dpf 29}. In questo caso, l'EDV è il volume di fine diastole e l'ESV è il volume di fine sistole.
      SV = (EDV - ESV)
6. Calcola la frazione di eiezione (EF):
   NOTA: La FE è definita come la frazione di sangue espulsa dal ventricolo ad ogni battito cardiaco²⁸.
   1. Dalle formule di cui sopra, estrarre EDV ed ESV per il pesce.
   2. Calcola EF come segue^22,27:
      FE (%)
7. Calcola la gittata cardiaca (CO):
   NOTA: CO è il volume di sangue pompato dal cuore²⁸. Il CO ha un valore di 10-55 nL/min per embrioni^{2-6 dpf 29}.
   1. Calcolare SV e HR come indicato nelle precedenti sottosezioni 5.5 e 5.2.
   2. Utilizzare la seguente formula per calcolare il CO ^22,27:
      CO (nL/min) = SV (nL/battito) x HR (battiti/min).
8. Misura le velocità dei globuli rossi:
   NOTA: La determinazione della velocità delle cellule è fondamentale per valutare la velocità di flusso, il diametro del vaso e calcolare lo sforzo di taglio esercitato sulle cellule endoteliali del vaso (ad esempio, lo stress di taglio, d'altra parte, è la forza di attrito imposta alle cellule endoteliali dal movimento del sangue). Per gli embrioni con 2-5 dpf, la velocità media dei globuli rossi (RBC) è di circa 300-750 μm/s²⁹. Per misurare le velocità dei globuli rossi:
   1. Al microscopio, ingrandire la coda dell'animale con un ingrandimento di 100x. Il movimento dei globuli rossi dovrebbe essere visibile a questo ingrandimento (Figura 5A, B).
   2. Inizia a registrare per circa 8 s. Assicurarsi che l'aorta dorsale (DA) e la vena cardinale posteriore (PCV), le due arterie assiali più importanti, siano a 100-120 fps all'interno della finestra di imaging. Traccia le singole celle da fotogrammi sequenziali (Figura 5A, B).
   3. Estrai diversi fotogrammi utilizzando ImageJ o altri software di analisi delle immagini simili.
   4. Calcola la differenza di distanza percorsa da un singolo RBC (Δx).
   5. Determinare la differenza di tempo tra i fotogrammi consecutivi (Δt).
   6. Utilizzare la seguente formula per la velocità RBC ^22,27:
      Velocità RBC (μm/s)
      NOTA: La velocità massima e media può essere estratta dalla ripetizione di fotogrammi consecutivi per le singole celle²¹. La velocità dei globuli rossi rappresenta anche la velocità del flusso sanguigno. In alternativa, è possibile utilizzare una varietà di applicazioni software disponibili in commercio per misurare automaticamente la velocità dei globuli rossi. ViewPoint²⁴, così come DanioVision²⁵, hanno tali applicazioni (Figura 5C). Inoltre, ci sono pochi plugin disponibili con ImageJ, come TrackMate³⁰ e MTrackJ³¹, compatibili con filmati registrati sopra i 100 fps.
9. Calcolo dello sforzo di taglio dalle velocità delle celle misurate
   Anche le velocità dei globuli rossi misurate nei vasi sanguigni rappresentano le velocità del flusso sanguigno (Figura 5C). Da queste misurazioni, calcolare la sollecitazione di taglio τ in un recipiente di interesse come segue con l'ipotesi di Poiseuille Flow^22,27:
   
   Dove V è la velocità media del sangue (μm/s), μ è la viscosità del sangue (dine/cm²) e D è il diametro del vaso (μm). Per 3 embrioni dpf, lo sforzo di taglio in DA 22,26,27 è di circa 4 dine/cm 2.

Risultati

Il grafico nella Figura 6 illustra la percentuale media di embrioni sopravvissuti a 24, 48 e 72 hpf sia per MO specifico per HAND2 che per gli embrioni MO criptati di controllo. Gli embrioni iniettati con MO da 1 mM (8 ng/μL) e 0,8 mM (6,4 ng/μL) hanno mostrato una significativa riduzione della percentuale di sopravvivenza rispetto agli embrioni di controllo con MO iniettati. Questo è stato osservato in ogni punto temporale misurato in cui è stata osservata letalità o malformazione. I risult...

Discussione

La tecnologia Morpholino (MO) è stata ampiamente utilizzata in zebrafish, xenopus, ricci di mare e, più recentemente, in sistemi modello di colture cellulari. Con la maggior parte dei metodi, insieme ai vantaggi, ci sono anche insidie di cui lo sperimentatore dovrebbe essere consapevole. Una delle principali insidie con la tecnologia MO include la preoccupazione che gli effetti fenotipici osservati dall'approccio knockdown genico mediato da MO non siano dovuti alla perdita di funzione as...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acrilammide 40%	Sigma	Sigma, n. cat. C977M88
Agarose	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich n. cat. A9539-250G
All Prep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	Qiagen n. cat. 80204.
alfa Tubulina	Abcam	Abcam- ab4074	Coniglio policlonale a alfa Tubulina lotto GR3 180877-1 (50 kDa)
Ammonio persolfato grado molecolare	Sigma	Sigma, cat. no C991U65
BV10 smussatore capillare	Sutter Instruments Prodotto Sutter Instruments	Catalogo prodotti # BV10
Chemiluminescenza Imaging Gene Gnome	SYNGENE SYNGENE
Cleaver Scientific Blotting	CVS10D_OmniPAGEMini	CVS10D_OmniPAGEMini
Coomassie	Thermo	Fisher Thermo Fisher cat. no C861C44
Kit per elettrochemiluminescenza (ECL)	Abcam Biochemicals	Abcam Biochemicals cat. ab65623
Glycine	Sigma	Sigma, cat. no C988U91
Capra anti Coniglio	Abcam	abcam-  ab6721	Capra Anti-Coniglio IgG H& L (HRP) 2nd anticorpi lotto GR3179871-1
HAND2	Strumenti genetici	Su misura per HAND2 (NM_021973)	5'-CCTCCAACTAAACTCATGGCGAC AG-3'Hand2
	Abcam	Abcam- ab10131	Coniglio policlonale Anti-HAND2 anticorpo lotto GR143200-9 (24-26 kDa)
HAND2 (NM_021973) Umano Tagged ORF Clone	OriGene Technologies, Inc	RC224436L3	Vettore: pLenti-C-Myc-DDK-P2A-Puro (PS100092)
IBI Kit di estrazione DNA/RNA/Proteine	IBI Scientific	IBI Scientific cat. no -r IB47702
Sistema di imaging	iBright	iBright CL1000 Sistema
Isopropanolo	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich cat. no 278475-2L
Tampone di caricamento del campione Laemmli (4x)	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich cat. no 70607
Mercaptoetanolo	Sigma	Sigma, cod. M6250-1L
Spettrofotometro per micropiastre con interfaccia software Gen5	Data Analysis Microscopio Epoch	Epoch
	Ziess SteREO Lumar V12 Microscopio a fluorescenza	Ziess SteREO Lumar V12 Microscopio
Olio minerale	Fisher Scientific	Fisher Scientific cat. no 0121-1
mMESSAGE mMACHINE T7/T3/SP6 Kit di trascrizione	Thermo Fisher Thermo	Fisher cat. AM1340	per la generazione di mRNA
Acqua priva di nucleasi	New England Biolabs	New England Biolabs cod. B1500L
PC-100 Estrattore per micropipette	NARISHIGE GROUP Prodotto NARISHIGE	GROUP Catalogo prodotti # PC-100
Rosso fenolo	Sigma	Sigma, cat. n. P-0290
Iniettore di picolitre	Harvard	Apparatus Harvard Apparatus cataloge # PLI-90A
Kit per il dosaggio delle proteine del test dell'acido bicinconninico (BCA)	Thermo Fisher	Thermo Fisher n. cat. 23227
PMSF, Inibitore della proteasi come inibitore della proteasi	Thermo	Fisher Thermo Fisher n. cat. 36978
Ponceau S	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich cat. n. 10165921001
Cocktail di inibitori della proteasi	Thermo	Fisher Thermo Fisher n. cat. 88668
Scala proteica	SMOBiO	SMOBiO cat. n. PM2500
Saggio di radioimmunoprecipitazione (RIPA)	Thermo Fisher	Thermo Fisher cat. n. 89900
Ringer' s soluzione	Thermofisher	Codice prodotto: S25513
SDS	Sigma	Sigma, cat. no 436143
Standard Control	Gene tools	SKU: PCO-StandardControl-100	5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTAT A-3'- che ha come bersaglio una mutazione dell'introne della beta-globina umana
Stripping buffer	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich cat. 21059
Temed	IBI scientifico	IBI scientifico cat. no C000A52
Tris Base	Thermo Fisher	Thermo Fisher cat. no BP-152-500
Tween	sigma life science	sigma life science cat. no P2287
Zebra Box Revolution-Danio Camera di sistema Track con il software EthoVision XT 11.5	Noldus Information Technology, NL	Noldus Information Technology, NL
Zeiss Axiocam ERc 5s	Zeiss	Stemi 508 Zeiss
Zeiss Stemi 2000-C	Zeiss	Stemi 2000-C