Microscopia intravitale longitudinale utilizzando una finestra di imaging mammario con coperchio sostituibile

Sommario

Questo protocollo descrive una nuova finestra di imaging mammario con un coperchio sostituibile (R.MIW). La microscopia intravitale dopo l'impianto del R.MIW consente l'imaging longitudinale e di più giorni della ghiandola mammaria sana e malata con una risoluzione cellulare durante le diverse fasi dello sviluppo.

Abstract

La struttura ramificata della ghiandola mammaria è altamente dinamica e subisce diverse fasi di crescita e rimodellamento dopo la nascita. La microscopia intravitale in combinazione con la chirurgia del lembo cutaneo o l'impianto di finestre di imaging è stata utilizzata per studiare la dinamica della ghiandola mammaria sana in diverse fasi dello sviluppo. La maggior parte delle tecnologie di imaging mammario sono limitate a un intervallo di tempo di ore o giorni, mentre la maggior parte dei processi di rimodellamento della ghiandola mammaria si verificano in intervalli di tempo da giorni a settimane. Per studiare il rimodellamento della ghiandola mammaria, sono necessari metodi che consentano l'accesso ottico al tessuto di interesse per periodi di tempo prolungati. Qui, viene descritta una versione migliorata della finestra di imaging mammario in titanio con un coperchio sostituibile (R.MIW) che consente l'imaging ad alta risoluzione della ghiandola mammaria con una risoluzione cellulare fino a diverse settimane. È importante sottolineare che il R.MIW fornisce l'accesso ai tessuti per l'intera durata dell'esperimento di imaging intravitale e potrebbe quindi essere utilizzato per la manipolazione locale dei tessuti, l'etichettatura, la somministrazione di farmaci o la microdissezione guidata da immagini. Nel loro insieme, il R.MIW consente la caratterizzazione ad alta risoluzione delle dinamiche cellulari durante lo sviluppo della ghiandola mammaria, l'omeostasi e la malattia.

Introduzione

L'epitelio mammario è un organo secretorio unico presente nei mammiferi, che produce e secerne latte per nutrire la prole. Nel corso della vita, la ghiandola mammaria subisce più cicli di sviluppo e crescita, che sono accompagnati da cambiamenti strutturali e funzionali del tessuto¹. A seconda dello stadio di sviluppo, i tipi di cellule che contribuiscono al rimodellamento dei tessuti sono diversi, così come la posizione all'interno dell'albero duttale.

La microscopia intravitale multifotonica (IVM) consente lo studio della dinamica delle cellule mammarie in vivo nel setting nativo e minimamente perturbato ^2,3,4. Per ottenere l'accesso visivo alla ghiandola mammaria, sono state pubblicate diverse tecniche temporanee di imaging ex vivo o del lembo cutaneo durante diverse fasi dello sviluppo della ghiandola mammaria, tra cui la pubertà ^4,5,6,7, l'età adulta ^2,8, l'allattamento ^9,10,11,12 e la ^dinamica tumorale ^{13,14 ,15}. Sebbene queste tecniche si traducano in un'elevata risoluzione spaziale e temporale delle dinamiche delle cellule mammarie, il lasso di tempo è limitato a ore, mentre la maggior parte dei processi di rimodellamento della ghiandola mammaria richiede giorni o settimane. Pertanto, sono necessari metodi che consentano l'accesso ottico al tessuto di interesse per intervalli di tempo prolungati. Nel corso degli anni, sono state sviluppate diverse finestre di imaging permanenti per l'imaging del tumore mammario ^15,16,17,18, tra cui una finestra di imaging mammario in titanio (MIW)^2,3,19. Sebbene molto utile per studiare la crescita del tumore mammario, la visualizzazione della struttura della ghiandola mammaria sana è rimasta limitata a pochi giorni. Recentemente, è stata sviluppata una finestra di imaging al silicio flessibile, che consente la visualizzazione della ghiandola mammaria puberale per più settimane²⁰. Tuttavia, la ghiandola mammaria è incorporata in un cuscinetto di grasso ricco di adipociti, che porta a un'ampia diffusione della luce e, di conseguenza, a una visibilità limitata delle strutture duttali mammarie. Pertanto, sono necessarie condizioni di imaging superiori in ogni momento per visualizzare le dinamiche dei tessuti per periodi di tempo prolungati nella ghiandola mammaria. Né il MIW classico, né la finestra flessibile in silicio consentono la manipolazione dei tessuti o l'ottimizzazione della posizione fisica del tessuto prima dell'imaging, poiché la finestra forma un sistema chiuso dopo l'intervento chirurgico e l'impianto. Di conseguenza, è probabile che l'accesso ottico ottimale al tessuto mammario sottostante venga precluso per periodi di tempo più lunghi. Al contrario, la tecnica del lembo cutaneo consente l'ottimizzazione e il riposizionamento del tessuto durante la sessione di imaging e un lembo cutaneo può essere ripetuto più volte². Tuttavia, le sessioni di imaging ripetute attraverso un lembo cutaneo sono possibili solo quando viene assegnato un tempo sufficiente (almeno 7 giorni) tra un intervento chirurgico e l'altro per consentire il recupero della pelle ed è quindi più adatto per studiare processi su scale temporali più lunghe. Inoltre, è consigliabile non eseguire questa procedura molte volte a causa della sua natura invasiva e del grande rischio di infezioni e cicatrici alla chiusura della ferita.

Per superare queste limitazioni, vale a dire per garantire condizioni di imaging ottimali per un periodo di tempo prolungato ad alta frequenza e allo stesso tempo consentire la manipolazione dei tessuti, è stata progettata una versione migliorata in titanio del MIW con un coperchio sostituibile (R.MIW) per visualizzare la ghiandola mammaria sana e malata su più giorni fino alle settimane² (Figura 1A, B). Il R.MIW è stato progettato su misura per fornire un accesso ottimale ai tessuti, consentendo la manipolazione diretta dei tessuti per l'intera durata dell'esperimento IVM, e quindi consente la visualizzazione della ghiandola mammaria al momento giusto e nel luogo giusto per periodi di tempo prolungati. Quando è chiuso, il R.MIW forma un sistema ermetico paragonabile al MIW classico (Figura 1C). Se aperto in condizioni asettiche, il R.MIW consente la manipolazione dei tessuti locali per migliorare l'accesso ottico e consente anche la somministrazione locale di sostanze, come inibitori del percorso o agonisti, l'iniezione di diversi tipi di cellule di interesse, come le cellule tumorali o le popolazioni di cellule immunitarie, o l'aggiunta di coloranti di etichettatura dei tessuti. Il coperchio può essere aperto in qualsiasi momento tra le sessioni di imaging senza causare danni al tessuto sottostante.

Figura 1: Progettazione della finestra di imaging mammario con un coperchio sostituibile. (A) Vista dall'alto e vista laterale del coperchio sostituibile della finestra di imaging mammario con un vetro di copertura da 10 mm incollato all'anello. (B) Vista dall'alto e vista laterale della finestra di imaging mammario, che consiste in un anello esterno e un anello interno con una scanalatura in mezzo per fissare la finestra all'interno della pelle del mouse usando una sutura a cordone di borsa. L'anello esterno ha una piccola scanalatura che si adatta alle quattro proiezioni (bracci) del coperchio. (C) Cartone animato e immagini che dimostrano i meccanismi di apertura e chiusura del coperchio. Le proiezioni inclinate assicurano che il coperchio sia fissato all'interno del telaio della finestra. Questa figura è stata modificata da Messal et al. ². Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Questo protocollo descrive la procedura di progettazione e impianto del R.MIW, nonché una strategia longitudinale IVM per rivisitare gli stessi dotti mammari e la loro visualizzazione a risoluzione cellulare. Il R.MIW consente di seguire le divisioni cellulari e i cambiamenti morfologici durante le diverse fasi di sviluppo della ghiandola mammaria in diversi modelli murini reporter fluorescenti. Nel loro insieme, il R.MIW facilita la caratterizzazione ad alta risoluzione delle dinamiche cellulari durante lo sviluppo della ghiandola mammaria, l'omeostasi e la malattia.

Protocollo

Tutte le procedure descritte in questo documento sono state eseguite in conformità con le linee guida della IACUC e ku Leuven e sono state eseguite nel contesto della domanda di progetto approvata P160/2020. Prima di eseguire questo protocollo, si prega di rivedere la strategia di analgesia con il veterinario istituzionale e somministrare l'analgesia pre e post-operatoria secondo le linee guida istituzionali.

1. Preparazione del R.MIW (tempo stimato: 2 h)

NOTA: Per la costruzione del R.MIW, è consigliabile trovare un produttore locale specializzato nella lavorazione di materiali duri come il titanio, in quanto ciò richiede strumenti e competenze speciali. Le officine specializzate nella progettazione e produzione di protesi in titanio di solito hanno i macchinari e le competenze per produrre le parti R.MIW.

1. Posizionare il coperchio del R.MIW su una superficie sterile con l'esterno del coperchio rivolto verso l'alto (e le braccia del coperchio inclinate verso il basso; Figura 1A).
2. Applicare la colla adesiva cianoacrilata attorno all'intero bordo del coperchio e posizionare con cura una slitta rotonda in vetro da 10 mm sulla parte superiore del coperchio.
   NOTA: Preparare sempre un coperchio di ricambio con una copertura di vetro come backup durante la procedura chirurgica.
3. Utilizzare un bastoncino di legno sterile per posizionare il coperchio di vetro e applicare una certa forza per spingerlo verso il basso per garantire una tenuta ermetica tra il coperchio di vetro e il telaio del coperchio. Assicurarsi che i fori nei bracci del coperchio non siano coperti dal vetro.
4. Disinfettare i coperchi e il R.MIW immergendo l'80% di etanolo per almeno 30 minuti in una capsula di Petri chiusa.
   NOTA: Non lasciare i coperchi più lunghi di 1 ora in etanolo all'80% per evitare la dissoluzione della colla adesiva cianoacrilata.
5. Rimuovere la colla adesiva cianoacrilata in eccesso dalla copertina del vetro utilizzando una punta di cotone imbevuta di acetone.
6. Conservare i coperchi e il R.MIW in un ambiente sterile fino a nuovo utilizzo.
   NOTA: Il telaio e i coperchi R.MIW possono essere conservati in un tubo o sacchetto sterile per un massimo di 1 settimana. Quando si riprende l'esperimento, esaminare sempre se il coperchio di vetro è ancora correttamente fissato al coperchio prima di procedere con il protocollo.

2. Preparazione per l'intervento chirurgico (tempistica stimata: 15 min)

NOTA: Per la procedura di impianto R.MIW, è possibile utilizzare topi femmina (>3,5 settimane) di qualsiasi ceppo.

1. Mantenere la sterilità utilizzando guanti sterili e sterilizzare tutti gli oggetti che verranno a contatto con il mouse. Lavare gli strumenti chirurgici con acqua e sapone neutro, asciugare all'aria, avvolgere in un foglio di alluminio senza angoli o bordi esposti e sterilizzare con un'autoclave per un ciclo di 20 minuti a 120 ° C prima dell'intervento chirurgico.
2. Preparare una piattaforma chirurgica sterile e sterilizzare le superfici con etanolo all'80%.
   NOTA: Per garantire la sterilità, l'intervento chirurgico può essere eseguito in un armadio a flusso.
3. Accendere la piastra riscaldante e coprire il tappetino con un drappo sterile. Disporre gli strumenti sterili sul drappo sterile e posizionare il R.MIW e un minimo di due coperchi ricoperti di vetro in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) in una capsula di Petri (chiudere il coperchio per evitare contaminazioni esterne).
4. Anestetizzare il mouse in una camera di induzione utilizzando una miscela di isoflurano/O_{2 al} 3%. Assicurati che l'animale sia abbastanza rilassato da essere facilmente manipolato e trasferito alla maschera del naso senza alcuna lotta.
5. Trasferire il topo dalla camera di induzione a una maschera nasale per anestesia e ridurre il livello di isoflurano all'1,5% - 2% di miscela isoflurano/O₂ . Verificare l'anestesia completa eseguendo un test di prelievo della zampa.
6. Per eseguire il test di prelievo della zampa, pizzicare saldamente la zampa animale usando le unghie o la pinza terminale smussata. In assenza di qualsiasi riflesso muscolare, considerare l'animale come incosciente e procedere per la preparazione chirurgica. Eseguire questo test prima della manipolazione animale e ripetere regolarmente durante le procedure anestetiche e chirurgiche per confermare l'anestesia.
7. Applicare unguento per gli occhi per prevenire la disidratazione corneale.
8. Rasare l'area intorno alla^4a ghiandola mammaria usando una lama di rasoio (Figura 2A). Usa il 4^{° capezzolo} come punto di riferimento. Rimuovere i peli sciolti usando del nastro adesivo.
   NOTA: In alternativa, la crema depilatoria può essere utilizzata per rimuovere i peli.
9. Disinfettare la pelle esposta con etanolo all'80% o povidone-iodio e posizionare il topo nell'area chirurgica sterile sulla schiena con il muso in una maschera nasale per anestesia utilizzando una miscela di isoflurano / O₂ all'1,5%.
10. Fissare gli arti anteriori e posteriori del mouse usando del nastro di carta.
    NOTA: Lasciare il mouse anestetizzato e di recupero sulla piastra riscaldante il più possibile, durante e dopo l'intervento chirurgico.
11. Utilizzare un drappo chirurgico sterile pretagliato o una garza per coprire il topo lasciando l'area chirurgica esposta.

3. Impianto R.MIW (tempo stimato: 30 min)

1. Verificare se l'animale è adeguatamente anestetizzato eseguendo un test di prelievo della zampa. Sollevare delicatamente la pelle usando una pinza Graefe fine e fare un'incisione diagonale di 10-15 mm usando piccole forbici a molla nella pelle sopra il 4^° cuscinetto di grasso mammario usando il 4^° capezzolo come punto di orientamento (Figura 2A). Assicurati di non tagliare o danneggiare il peritoneo o la ghiandola mammaria.
2. Definire la regione di interesse (ROI) in base alle caratteristiche macroscopiche del tessuto mammario, compresa la posizione del linfonodo o di una lesione tumorale, e cercare di mantenere il ROI centrale per quanto riguarda l'incisione.
3. Separare la pelle dal cuscinetto di grasso mammario e dagli strati di tessuto sottostanti utilizzando una dissezione smussata fino a 5-8 mm intorno alla linea di incisione per creare una tasca adatta al telaio R.MIW (Figura 2BI).
4. Prelevare il R.MIW utilizzando una pinza sterile e verificare se l'incisione è abbastanza grande da inserire la finestra. Se necessario, ingrandire leggermente l'incisione fino a quando il R.MIW non si adatta.
5. Rimuovere il R.MIW e posizionare una sutura a cordone di borsa intorno all'incisione utilizzando una sutura di seta 5-0 (intrecciata, non riassorbibile). Posizionare la sutura a 1-2 mm dal bordo dell'incisione dall'esterno all'interno della pelle, a partire dall'estremità caudale dell'incisione.
6. Muoversi di circa 5 mm verso l'alto lungo l'incisione e passare il filo di sutura attraverso la pelle dall'interno verso l'esterno. Ripetere questa procedura lungo il bordo dell'incisione, creando così una sutura circolare composta da 5-6 anelli (Figura 2BII). L'uscita finale del filo di sutura deve essere posizionata a circa 2-5 mm di distanza dal primo ingresso.
   NOTA: Fare attenzione a non posizionare la sutura troppo vicino al bordo dell'incisione, in quanto ciò aumenta il rischio di lacerazione della pelle. Posizionare la sutura troppo lontano dal bordo dell'incisione aumenta il rischio di infezione tra la pelle in eccesso e il solco del R.MIW.
7. Inserire il R.MIW all'interno dell'incisione e utilizzare la pinza Graefe per posizionare con cura la pelle nella scanalatura del R.MIW. Assicurati di lasciare i loop della sutura all'esterno.
8. Tirare i loop della sutura della corda della borsa e stringere la sutura nella scanalatura del R.MIW tirando delicatamente su entrambe le estremità della sutura (Figura 2BIII). Legare con nodi chirurgici e tagliare via il filo in eccesso.
9. Applicare la vaselina sul bordo interno del R.MIW usando uno stuzzicadenti, assicurandosi di evitare il tessuto sottostante. Spingere delicatamente il telaio della finestra verso il basso con una pinza sterile o due punte delle dita e posizionare il coperchio nel telaio R.MIW (Figura 1B). Ciò eviterà un volume d'aria tra il tessuto della ghiandola mammaria e il coperchio R.MIW.
10. Posizionare le punte di pinza sottile attraverso i fori nei bracci del coperchio e stringere il coperchio ruotando il coperchio in senso orario (circa 5°) (Figura 1C e Figura 2BIV).
11. Se rimane dell'aria dopo aver stretto il coperchio R.MIW, utilizzare un ago da insulina sterile per rimuovere l'aria in eccesso. Introdurre l'ago attraverso la pelle nella cavità tra il tessuto mammario e il coperchio e estrarre lentamente lo stantuffo, creando così un vuoto tra il tessuto della ghiandola mammaria e il coperchio R.MIW.
12. Somministrare, dopo l'intervento chirurgico, analgesia come buprenorfina (0,1 mg/kg diluita in NaCl sterile allo 0,9%) mediante iniezione sottocutanea. Ripetere l'iniezione sottocutanea con buprenorfina a 8 ore e 16 ore dopo l'intervento chirurgico.
13. Rimetti il mouse nella gabbia per recuperare e monitorarlo da vicino fino a quando non è completamente sveglio, oppure procedi con il passaggio 4 per l'imaging immediato.
14. In questa fase post-chirurgica, monitorare attentamente i topi per segni di disagio o complicazioni in base a parametri vitali, come la respirazione, la reattività, il comportamento, la postura e il peso corporeo. Monitorare attentamente la pelle che circonda la finestra per segni di infiammazione e necrosi. Se non si verificano complicazioni, il R.MIW consentirà sessioni IVM ripetute per diverse settimane dopo l'impianto.

Figura 2: Panoramica della procedura chirurgica e dell'impianto della finestra. (A) Un'incisione diagonale viene praticata vicino al 4^{° capezzolo} di un topo femmina e la pelle e il tessuto sottostante sono scollegati da una dissezione smussata. (B) Il linfonodo inguinale e la forma del cuscinetto adiposo possono essere utilizzati per il corretto orientamento del tessuto (I). Una sutura a corda di borsa viene posizionata nella pelle attorno all'incisione (II) e, dopo il montaggio nel telaio della finestra, la sutura viene serrata nella scanalatura per fissare il telaio della finestra e fissata da nodi chirurgici (III). L'ultimo passaggio è l'inserimento e il bloccaggio del coperchio nel telaio della finestra (IV). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Microscopia intravitale ripetuta tramite R.MIW

NOTA: La strategia IVM ripetuta qui descritta è stata ottimizzata per un sistema confocale multifotonico invertito dotato di uno stadio motorizzato e di una camera climatica scura a 35,8 °C.

1. Anestetizzare il mouse in una camera di induzione utilizzando una miscela di isoflurano/O_{2 al} 3%. Verificare la perdita di coscienza eseguendo un test di prelievo della zampa (descritto nel passaggio 2.6). Applicare unguento per gli occhi per prevenire la disidratazione corneale durante la sessione di imaging.
2. Ispezionare le condizioni del telaio e del coperchio R.MIW, compresa la stabilità delle suture o qualsiasi potenziale danno al coperchio. In caso di danni al coperchio, il coperchio può essere sostituito come descritto nel passaggio 5.
3. Trasferire il mouse in una scatola di imaging preriscaldata (37 °C) personalizzata (Figura 3A) e posizionare il mouse con la testa nel cono del naso. La scatola di imaging è costituita da una cornice che si inserisce nella fase automatizzata del microscopio. Il telaio è progettato per contenere un intarsio su misura con un foro del diametro del R.MIW (Figura 3A).
4. Un ingresso con un cono nasale è collegato alla parte anteriore della scatola e collegato a una stazione di vaporizzazione isoflurano utilizzando una miscela di isoflurano / O_{2 del 2}% -3%. Una presa è collegata a un'unità di scavenging anestetico per garantire la circolazione e prevenire l'accumulo di isoflurano nella scatola. La scatola di imaging può essere chiusa utilizzando un coperchio trasparente.
5. Posizionare il mouse sull'intarsio in modo tale che il R.MIW cada nel foro dell'intarsio della scatola di imaging (Figura 3A). Applicare parafilm e nastro di carta sul retro del mouse per stabilizzare il mouse e ridurre il movimento dei tessuti dovuto alla respirazione.
6. Chiudere la scatola di imaging con il coperchio e inserire la scatola di imaging nella fase del microscopio.
7. Ridurre gradualmente la dose di isoflurano nel corso della sessione di imaging per sostenere un'anestesia stabile ma superficiale (in genere tra l'1,5% e lo 0,8% di isoflurano/O₂ miscela).
8. Fornire una corretta alimentazione durante l'imaging come descritto di seguito.
   1. Per le sessioni di imaging <3 ore, iniettare il topo per via sottocutanea con 200-300 μL di PBS sterile per l'idratazione.
   2. Per le sessioni di imaging >3 ore, seguire i passaggi descritti di seguito.
      1. Per l'imaging a lungo termine, infondere al topo sostanze nutritive. Per questo, utilizzare una miscela di infusi sterili disponibile in commercio contenente aminoacidi e glucosio. Posizionare un ago flessibile per via sottocutanea nel collo del mouse e fissarlo con nastro di carta.
      2. Attaccare una siringa da 10 ml con la miscela di nutrienti preparata a un tubo di silicio flessibile e spingere la miscela di nutrienti fino a raggiungere l'estremità del tubo.
      3. Collegare il tubo di silicone all'ago flessibile. Prendi l'estremità del tubo e posizionalo attraverso uno dei fori della scatola di imaging (dall'interno all'esterno, lasciando il lato di attacco dell'ago nella scatola).
      4. Iniettare 50 μL di soluzione in infusione ogni 30 minuti.
9. Fissare la scatola di imaging nella fase del microscopio e definire l'area di interesse utilizzando la modalità di epifluorescenza del microscopio.
10. Applicare le impostazioni del microscopio desiderate a seconda del modello di mouse (Figura 3B). Le strutture dei vasi, i modelli di collagene (visualizzati dalla seconda generazione armonica) e altre strutture anatomiche stabili, incluso il linfonodo inguinale, possono essere utilizzati come punti di riferimento. Acquisisci immagini utilizzando un microscopio confocale multifotone invertito a una profondità di 12 bit e un obiettivo ad acqua 25x utilizzando una dimensione Z-step che va da 1,0 a 4,0 μm (z-stack totale che va da 150 a 800 μm). Applicare le seguenti impostazioni standard: formato 1024 x 1024, velocità di scansione 600 Hz, modalità bidirezionale.
11. Visualizza le fibre di collagene I eseguendo la seconda generazione armonica utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 860 nm e il rilevamento a 425-435 nm. Le lunghezze d'onda di eccitazione e di rilevamento per i diversi fluorofori sono indicate nella Tabella 1.

Tabella 1. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

12. Utilizzare la funzione Spirale in modalità navigatore software di imaging per generare una panoramica di grandi dimensioni tilescan per creare una mappa di riferimento del tessuto (Figura 3B). Definite i ROI all'interno della panoramica a spirale, definite i piani Z superiore e inferiore per determinare lo stack Z. Premere Start per ottenere pile Z tridimensionali (xyz) o quadridimensionali (xyzt) dettagliate del tessuto.
    NOTA: durante l'intero esperimento di imaging il mouse deve essere attentamente monitorato. Per lunghe sessioni di imaging, si consiglia un pulsossimetro e una sonda di temperatura. La respirazione del topo dovrebbe essere regolare e allo stesso ritmo. Se il mouse inizia a mostrare segni di respiro affannoso, la quantità di isoflurano deve essere ridotta.
13. Alla fine di ogni sessione di imaging, tenere il mouse su una piastra riscaldante fino a quando non è completamente sveglio. Se il topo mostra segni di disagio o mobilità ridotta, tenere la gabbia per un tempo più lungo sulla piastra riscaldante e fornire gel nutrienti invece del normale chow.
    NOTA: tra una sessione di imaging e l'altra, il topo deve essere attentamente monitorato per segni di disagio come diminuzione del consumo di cibo e acqua, respirazione rapida, diminuzione del movimento, tremore, postura anormale del corpo o pelliccia non curata. In caso di chiari segni di disagio, seguire le linee guida istituzionali in materia di benessere degli animali e terminare l'esperimento quando viene raggiunto l'endpoint umano.
14. Ripetere i passaggi 4.1-4.12 per ogni sessione di imaging ripetuta e utilizzare il riquadro di panoramica per ripercorrere le stesse posizioni su più punti temporali (Figura 3B). La frequenza di imaging dipenderà dalla domanda di ricerca e dai tempi del processo studiato e in genere varia da sessioni di imaging due volte al giorno a una volta alla settimana.
15. Al termine del periodo sperimentale desiderato, eutanasizzare gli animali con un R.MIW impiantato utilizzando l'anestesia profonda con isoflurano seguita da lussazione cervicale. Se lo si desidera, sezionare gli organi di interesse per ulteriori analisi ex vivo .
16. In alternativa, mantenere in vita l'animale per future analisi in vivo . In tal caso, rimuovere la sutura della sacca che tiene il R.MIW tagliandolo con forbici a molla e staccare con cura l'anello della finestra dalla pelle del topo usando una pinza smussata. Pulire i bordi della pelle che in precedenza conteneva la finestra e procedere con una semplice sutura continua (materiale assorbibile, come l'acido poliglicolico).
17. Una volta chiusa la pelle, legare i fili di sutura iniziali e finali con due nodi quadrati (4 lanci). Per ridurre al minimo l'ischemia tissutale, i nodi dovrebbero essere abbastanza sciolti da consentire il flusso sanguigno sul bordo della pelle. Disinfettare la ferita con povidone-iodio per prevenire l'infiammazione e promuovere la guarigione della pelle.

Figura 3: Flusso di lavoro IVM longitudinale. (A) Rappresentazione schematica di un tipico esperimento IVM di più giorni. (B) Imaging di una regione tumorigenica all'interno della ghiandola mammaria adulta. Prima di ogni sessione di imaging, una panoramica a bassa risoluzione (pannello superiore) può facilitare l'identificazione delle regioni di interesse nei giorni di imaging successivi. Il modello di collagene I (seconda generazione armonica, magenta), la struttura tissutale e i modelli di cellule marcate in modo differenziale con proteine fluorescenti (raffigurate in verde, giallo e rosso) possono essere utilizzati per ripercorrere la stessa area tissutale. Le barre di scala rappresentano 1 mm (panoramica tilescan) e 100 μm (pannelli inferiori). (C) Rappresentazione schematica del costrutto reporter R26-Confetti . Dopo la ricombinazione cre indotta dal tamoxifene, i confetti costruiscono stocasticamente ricombinazioni, con conseguente espressione di uno dei quattro fluorofori (nGFP, YFP, RFP o mCFP). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Apertura e chiusura del coperchio del R.MIW tra le sessioni di imaging

1. Mantenere la sterilità utilizzando guanti sterili e sterilizzare tutti gli oggetti che verranno a contatto con il mouse. Strumenti chirurgici in autoclave prima dell'intervento (vedere il passaggio 2 per i dettagli).
2. Accendere la piastra riscaldante e coprire il tappetino con un drappo sterile e anestetizzare il mouse in una camera di induzione utilizzando una miscela di isoflurano/O₂ del 3%. Verificare un'anestesia adeguata eseguendo un test del riflesso di prelievo della zampa.
3. Trasferire il mouse dalla camera di induzione a una maschera nasale per anestesia e ridurre il livello di isoflurano all'1,5%-2% di miscela isoflurano/O₂ .
4. Posizionare le punte di pinze sottili attraverso i fori nei bracci del coperchio e allentare il coperchio ruotando il coperchio in senso antiorario. Se necessario, applicare alcuni PBS sterili preriscaldati (37 °C) sulla finestra per facilitare l'allentamento del coperchio.
5. Posizionare il coperchio del R.MIW in un piatto sterile con PBS sterile fino a nuovo utilizzo. Pulire il vetro di copertura del coperchio con demi-acqua e successivamente etanolo all'80%. Conservare il coperchio in PBS sterile fino a nuovo utilizzo.
6. Evitare che il tessuto esposto si secchi aggiungendo alcune gocce di PBS sterile sulla superficie del tessuto.
7. Applicare o iniettare qualsiasi sostanza o cellule di interesse sul tessuto esposto, è possibile utilizzare un volume massimo di 50 μL. Attendere alcuni minuti fino a quando il liquido non viene assorbito dal tessuto. In alternativa, il tessuto può essere manipolato o riposizionato utilizzando pinze sterili e smussate per ottimizzare le condizioni di imaging per specifici ROI.
8. Applicare vaselina sul bordo interno del R.MIW, assicurandosi di evitare il tessuto sottostante. Posizionare il coperchio nel telaio R.MIW come descritto al punto 3.9, posizionare le punte di pinza sottile attraverso i fori nei bracci del coperchio e stringere il coperchio ruotando il coperchio in senso orario (circa 5°).

Risultati

Per studiare la dinamica proliferativa delle cellule epiteliali mammarie durante le diverse fasi di sviluppo della ghiandola mammaria è stato eseguito il protocollo descritto. Il design del R.MIW è illustrato nella Figura 1 e la procedura per impiantare un R.MIW è riassunta nella Figura 2. Il R.MIW viene impiantato chirurgicamente tra la ghiandola mammaria e la pelle. Una sutura viene utilizzata per tenere all'interno dell'anello della finestra e impedire ai topi di tirare le suture (Figura 2). Le suture che contengono il R.MIW sono realizzate in seta non assorbibile, che ha proprietà ipoallergeniche, una consistenza morbida ed è facile da maneggiare. L'anello R.MIW è realizzato in titanio, uno dei materiali più biocompatibili che non favoriscono l'infiammazione o la necrosi dopo l'impianto²¹. Se le condizioni asettiche sono seguite e le suture sono ben eseguite, l'impianto della ghiandola mammaria R.MIW presenta un basso rischio di complicanze postoperatorie. Inoltre, a differenza dell'impianto di finestre di imaging addominale²², l'impianto R.MIW non è un fattore limitante per la sopravvivenza del topo perché la ghiandola mammaria non è un organo vitale e consente l'imaging quotidiano fino al limite specificato nel protocollo etico. L'unico fattore che limita la durata dell'impianto della finestra è il turnover omeostatico della pelle, che alla fine porterà alla caduta delle suture dopo 4 - 6 settimane. Pertanto, è importante ispezionare regolarmente la stabilità delle suture. Se lo si desidera, le suture possono essere rimosse e sostituite da una nuova sutura a cordone di borsa in condizioni asettiche (come descritto nei passaggi 3.5 - 3.8) per garantire la stabilità della finestra.

Una delle principali sfide quando si utilizza l'approccio di imaging multiday è la riduzione di un ROI in giorni consecutivi. A tal fine, è possibile includere una rapida scansione di panoramica prima di selezionare i ROI (Figura 3B). Più punti di riferimento tissutali possono essere utilizzati per ripercorrere la stessa regione del tessuto, incluso il segnale della rete di collagene (visualizzato dalla seconda generazione armonica), la struttura tissutale e i modelli locali di cellule etichettate in modo differenziale o stocastico con coloranti o proteine fluorescenti (Figura 3B). In questo esempio rappresentativo, un R.MIW è stato impiantato sulla 4a ghiandola mammaria di un MMTV-PyMT; R26-CreERT2^het; R26-Confetti^het topo femmina all'inizio della formazione di tumore palpabile. Successivamente, la ricombinazione stocastica è stata indotta mediante iniezione di 1,5 mg di tamoxifene, con conseguente ricombinazione del costrutto Confetti in alcune cellule (Figura 3C). Le cellule tumorali ricombinate sono state seguite per un periodo di 20 giorni (Figura 3B,C). Se l'imaging della stessa regione della ghiandola mammaria per giorni consecutivi è precluso, la finestra può essere aperta in un ambiente asettico (come descritto nel passaggio 5.1) per chiarire ulteriormente e riposizionare il tessuto per migliorare la visibilità e l'acquisizione delle immagini (Figura 3A).

Usando questo metodo, la ghiandola mammaria in via di sviluppo durante la pubertà è stata seguita a livello di singola cellula. L'IVM ripetuto attraverso un R.MIW è stato eseguito utilizzando R26-CreERT2^het; R26-mTmG^het topi femmina tra le 4-6 settimane di età, in cui tutte le cellule sono etichettate con tdTomato di membrana (Figura 4A)²³. Ai topi è stata iniettata una bassa dose di tamoxifene (0,2 mg/25 g di peso corporeo), con conseguente ricombinazione sporadica del costrutto mTmG, causando un cambiamento da rosso a verde in alcune cellule di tutti i tessuti, compresa la ghiandola mammaria (Figura 4B). Gli stessi ROI sono stati rivisitati in più giorni per visualizzare i cambiamenti morfologici all'interno della ghiandola mammaria, tra cui l'allungamento duttale e la ramificazione duttale (Figura 4C) a risoluzione cellulare. È importante sottolineare che questa combinazione di etichettatura delle cellule stocastiche e IVM di più giorni consente anche di visualizzare i cambiamenti dinamici dell'ambiente duttale, come la dinamica delle singole cellule nello stroma che circonda i dotti di allungamento e ramificazione (Figura 4D) e la dinamica cellulare all'interno del linfonodo inguinale (Figura 4E).

Figura 4: IVM di più giorni della morfogenesi delle ramificazioni puberali. (A) R26-CreERT2 puberale; I topi R26-mTmG di età compresa tra 4-6 settimane sono stati iniettati con una bassa dose di tamoxifene che ha portato alla ricombinazione cre-mediata dell'allele R26-mTmG e sono stati ripresi nei giorni 1, 3 e 5 per seguire i cambiamenti dinamici nello sviluppo della ghiandola mammaria. (B) Rappresentazione schematica del costrutto del topo R26-mTmG , che in condizioni non ricombinate provoca l'espressione ubiquitaria di tdTomato di membrana (mT). In caso di ricombinazione mediata da Cre, mT viene commutato per l'espressione eGFP (mG) di membrana. (C) rendering 3D di un dotto mammario allungato e ramificato per più giorni ripreso attraverso un R.MIW in un R26-CreERT2; R26-mTmG topo femmina a 6 settimane di età. (D) Singole immagini del piano Z della punta ramificata (pannelli superiori) e del ramo allungato (pannelli inferiori). mT è raffigurato in rosso e mG in ciano, le barre della scala rappresentano 100 μm (A e B). Le singole cellule nello stroma sono evidenziate da asterischi bianchi. Si noti che l'intensità del segnale è stata aumentata manualmente per evidenziare le singole cellule nello stroma, portando ad un aspetto leggermente sovraesposto delle cellule epiteliali mammarie. (E) Immagini rappresentative del linfonodo inguinale di un R26-CreERT2; Mouse femmina R26-mTmG ripreso attraverso un R.MIW, che mostra una scansione dei riquadri di panoramica (pannello di sinistra), immagini di zoom (pannelli a destra) di un singolo piano Z (in alto) e un rendering 3D (in basso). La seconda generazione armonica (collagene I) è mostrata in verde, mT in rosso e mG in ciano. Le barre di scala rappresentano 500 μm (panoramica tilescan) e 100 μm (zoom immagini). I pannelli di figura C e D sono modificati da Messal et al. ². Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Allo stesso modo, nella ghiandola mammaria adulta, l'approccio R.MIW proposto consente la visualizzazione delle stesse strutture duttali su più giorni con visibilità senza compromessi. Anche l'uso di modelli reporter fluorescenti meno luminosi²⁴, come il modello murino Cdh1-mCFP (Ecadherin-mCFP), consente la visualizzazione della stabilità duttale e dei sottili cambiamenti morfologici a risoluzione cellulare (Figura 5). Si noti che la visibilità tra il giorno 3 e il giorno 5 è migliorata significativamente dopo il riposizionamento dei tessuti (Figura 5).

Figura 5: Imaging di più giorni della ghiandola mammaria adulta. Immagini renderizzate 3D di una struttura duttale mammaria di una femmina adulta Cdh1-mCFP (ciano, che segna l'espressione delle cellule luminali Ecadherin-positive) del mouse per più giorni consecutivi. Il modello di collagene I (seconda generazione armonica, magenta) è stato utilizzato per ripercorrere lo stesso ROI e il segnale Cdh1-mCFP è stato utilizzato per contrassegnare le cellule duttali (luminali). Si noti che la visibilità dopo il giorno 3 è stata migliorata dall'apertura del coperchio R.MIW e dal riposizionamento del tessuto. Le barre di scala rappresentano 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per valutare l'eterogeneità proliferativa delle cellule epiteliali mammarie durante il ciclo ormonale a livello di singola cellula, è stato utilizzato il foto-convertibile Kikume Green-Red (KikGR) reporter modello murino^25,26, che ha un'espressione ubiquitaria della proteina KikGR. KikGR è un fluoroforo brillante che subisce una conversione da verde a rosso dopo l'esposizione alla luce viola e il rapporto rosso/verde può essere utilizzato come proxy per l'attività proliferativa di una cellula² (Figura 6A,B). Utilizzando l'approccio R.MIW, abbiamo seguito le stesse cellule all'interno dell'albero duttale della ghiandola mammaria adulta per diversi giorni e abbiamo trovato un'eterogeneità proliferativa precedentemente imprevista in tutto l'albero duttale (Figura 6C). Le cellule proliferative alte e basse sono state equamente distribuite sulle diverse aree convertite (Figura 6C,D). Sorprendentemente, a livello locale, le cellule vicine hanno mostrato grandi differenze nel loro rapporto rosso/verde (Figura 6C,D). La quantificazione del rapporto rosso/verde di diverse cellule (come proxy per la loro attività proliferativa) 10 giorni dopo la foto-conversione, ha rivelato tassi di diluizione altamente variabili di alcune cellule all'interno dello stesso microambiente duttale (Figura 6E). Insieme, questi dati rivelano una notevole eterogeneità proliferativa locale all'interno della ghiandola mammaria adulta e, allo stesso tempo, un tasso di turnover uniforme globale.

Figura 6: IVM longitudinale dell'eterogeneità proliferativa nella ghiandola mammaria adulta utilizzando il modello murino KikGR. (A) I topi KikGR sono stati ripresi al giorno 0 prima e dopo l'esposizione alla luce viola. Le sessioni di imaging sono state ripetute nei giorni 2, 6 e 10 dopo la conversione. (B) Rappresentazione schematica degli ipotetici risultati sulla foto-conversione delle cellule epiteliali mammarie KikGR a seguito di proliferazione (pannello di sinistra) e nessuna proliferazione (pannello di destra) in funzione del tempo. (C) La stessa area della ghiandola mammaria è stata fotografata attraverso un R.MIW per un periodo di 10 giorni. Le regioni più piccole sono state foto-convertite il giorno 0 e mostrano un tasso di diluizione simile del segnale rosso Kikume nel tempo, indicando un tasso di turnover uguale in tutto l'epitelio. (D) Le immagini zoom (singoli piani Z) delle regioni indicate nel pannello C mostrano eterogeneità proliferativa a livello cellulare 6 e 10 giorni dopo la foto-conversione. Le barre di scala rappresentano 100 μm (pannello C) e 10 μm (pannello D). (E) Quantificazione del rapporto rosso/verde di cellule selezionate casualmente (n = 48 celle) in tre aree foto-convertite. Un elevato rapporto rosso/verde è indicativo di un basso tasso di diluizione e di una bassa attività proliferativa, mentre un basso rapporto rosso/verde è indicativo di un alto tasso di diluizione e proliferazione. I pannelli di figura C-E sono stati modificati da Messal et al. ². Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il R.MIW consente l'imaging longitudinale della ghiandola mammaria sana e malata nel suo ambiente nativo e minimamente disturbato e consente la visualizzazione ripetuta della ghiandola mammaria in diverse fasi dello sviluppo. Il design R.MIW consente di aprire la finestra in qualsiasi momento durante l'esperimento. L'accesso visivo a lungo termine al tessuto di interesse può essere ostacolato, ad esempio, dall'accumulo di detriti cellulari sul coperchio. In questi casi, il R.MIW può essere aperto prima o immediatamente dopo una sessione di imaging per consentire la pulizia dell'intera area visibile del tessuto e del coperchio. Il coperchio rimovibile consente anche manipolazioni del tessuto e l'applicazione locale di sostanze, come inibitori e terapie specifici, coloranti di etichettatura o specifici tipi di cellule di interesse.

Questo metodo supera la limitazione delle procedure di skinflap mammario precedentemente descritte ^4,7,8,13, che sono limitate a una sessione di imaging, e può visualizzare processi come la morfogenesi ramificata (Figura 5), il turnover omeostatico del tessuto (Figura 6) o la crescita tumorale a livello cellulare (Figura 3B). ). Tuttavia, allo stesso tempo, il R.MIW consente la manipolazione locale del tessuto tra le sessioni di imaging, che comprende una grande risorsa del R.MIW rispetto al MIW ^3,18 precedentemente pubblicato e a tutte le altre finestre^{di imaging 20,22}. Quando si apre il R.MIW, è importante mantenere le condizioni asettiche in ogni momento per prevenire qualsiasi fonte di infezione. La possibilità di aprire il R.MIW in un ambiente asettico consente di ottimizzare le condizioni di imaging prima di ogni sessione di imaging, migliorando notevolmente l'accesso visivo a lungo termine al tessuto di interesse. In particolare, nella ghiandola mammaria, che è incorporata in uno stroma ricco di adipociti, questo è di grande valore. Inoltre, il coperchio sostituibile potrebbe consentire in modo univoco la somministrazione locale di terapie, diversi tipi di cellule, coloranti di etichettatura, microdissezione guidata da immagini o qualsiasi altra manipolazione locale del tessuto senza la necessità di terminare l'esperimento IVM. Ad esempio, per studiare l'inizio del tumore, specifiche popolazioni di cellule tumorali potrebbero essere iniettate direttamente nell'albero duttale o nello stroma in un determinato punto temporale IVM e in una precisa posizione della ghiandola mammaria, purché questo ROI sia accessibile attraverso l'anello R.MIW. Per studiare la progressione tumorale, specifiche popolazioni di cellule tumorali (in una posizione specifica, in un microambiente specifico o con un comportamento specifico) potrebbero essere fotomarcate durante la sessione IVM e successivamente microdissezionate utilizzando un microscopio a dissezione fluorescente dopo l'apertura del R.MIW. Le cellule isolate potrebbero essere ulteriormente elaborate per analisi a valle, come il sequenziamento dell'mRNA (a singola cellula). Usando questo approccio, si potrebbe accoppiare il comportamento cellulare in vivo ai profili di espressione molecolare. Il vantaggio della somministrazione locale del farmaco abilitato dal R.MIW consente di visualizzare il tessuto prima e direttamente dopo il trattamento. L'intervallo necessario per rimuovere il mouse dalla scatola di imaging e per eseguire successivamente la somministrazione locale del farmaco dopo l'apertura del coperchio R.MIW può essere eseguito in pochi minuti, il che consente l'acquisizione immediata di fase dei farmaci ad azione rapida.

Mostriamo che l'IVM della ghiandola mammaria attraverso il R.MIW è compatibile con molti diversi modelli murini reporter fluorescenti. L'ambiente ricco di adiposità è difficile da immaginare, e quindi si raccomanda l'uso di fluorofori luminosi. Tuttavia, come mostrato qui, anche fluorofori meno luminosi come mCFP possono essere visualizzati attraverso il R.MIW in condizioni di imaging ottimali. Inevitabilmente, il cuscinetto di grasso precluderà l'imaging delle strutture duttali più profonde e limiterà l'imaging ai dotti più superficiali. Un'immagine panoramica a bassa risoluzione all'inizio di ogni esperimento IVM aiuterà a identificare le strutture duttali di interesse che sono sufficientemente superficiali per l'imaging ad alta risoluzione. La manipolazione del tessuto locale, la rimozione del tessuto connettivo o il riposizionamento del tessuto adiposo dopo l'apertura del R.MIW possono ottimizzare l'IVM per specifici ROI che sono sovrapposti dal tessuto adiposo. Questo è un vantaggio importante rispetto a tutti i precedenti progetti di finestre, che non consentono di eseguire queste manipolazioni e richiederebbero la completa rimozione della finestra stessa. In particolare, per la visualizzazione del linfonodo inguinale, si consiglia di rimuovere delicatamente il tessuto adiposo sovrastante, che riduce la diffusione della luce e consente l'imaging ad alta risoluzione. Quando si manipola il tessuto, mantenere sempre condizioni asettiche e prevenire sanguinamenti o gravi danni al tessuto, in quanto possono influenzare i processi studiati durante l'esperimento IVM.

Il R.MIW è realizzato in titanio, un materiale comunemente usato nella pratica clinica per sostituire tessuti duri come articolazioni o placche ossee. Il titanio ha diversi vantaggi rispetto alle finestre in acciaio, tra cui il suo carattere leggero e inerte²¹. Recentemente, diversi altri materiali sono stati utilizzati per generare nuovi tipi di finestre di imaging, tra cui la finestra flessibile in silicio²⁰. A differenza del R.MIW, la finestra flessibile non richiede alcuna sutura per l'impianto ed è adatta per quasi tutte le posizioni anatomiche, in particolare nel caso di tessuti molli e fragili. Le finestre in silicio hanno un impatto minimo sulla motilità animale a causa della loro natura leggera e deformabile e forse più adatte negli esperimenti che studiano la rapida espansione e crescita dei tessuti²⁰. Un altro vantaggio rispetto alla versione in titanio è che le finestre in silicio sono compatibili con altre modalità di imaging, tra cui la risonanza magnetica^20,27. Tuttavia, sarà importante tenere presente che gli obiettivi sono ottimizzati per coperture in vetro da 0,17 mm. Inoltre, il tessuto mammario è suscettibile ai movimenti respiratori, che sono difficili da limitare utilizzando la finestra flessibile, specialmente quando si utilizza un microscopio invertito. Gli artefatti respiratori sono ridotti al minimo dal design R.MIW e dalla fissazione del R.MIW nell'intarsio della scatola di imaging. Di conseguenza, le immagini acquisite utilizzando la configurazione R.MIW proposta non vengono distorte a causa di artefatti respiratori. Tuttavia, possono verificarsi lievi derive nella localizzazione dei tessuti, che di solito sono graduali e possono essere corrette utilizzando il software di correzione del movimento post-acquisizione²⁸. Con la crescente cassetta degli attrezzi delle tecnologie IVM ^2,20, i requisiti specifici per ogni esperimento determineranno alla fine il modo migliore di visualizzazione in vivo del tessuto di interesse. Diversi design di finestre hanno diversi vantaggi e svantaggi e, a seconda della domanda di ricerca, della configurazione della microscopia disponibile, della risoluzione spaziale e temporale richiesta e dell'intervallo di tempo totale del processo studiato, è necessario determinare l'approccio ottimale.

In sintesi, il R.MIW facilita la caratterizzazione ad alta risoluzione delle dinamiche cellulari durante lo sviluppo della ghiandola mammaria, l'omeostasi e la malattia per più giorni o settimane.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,9% NaCl	BD	306573	Altre marche disponibili
Coverglass rotondo da 10 mm	Fisher scientific	10696365	Altre marche disponibili
5-0 suture di seta intrecciate	Ethicon	W580
80% Etanolo	fatto in casa	NA
Scatola di induzione per anestesia	Kentscientific	VetFlo-MSEKIT
Buprenorfina (Vetergesic®)	Ecuphar	NA
Punte in cotone (sterili)	Fisher scientific	13113743	Altre marche disponibili
Cianoacrilato adesivo	Loctite	NA	Altre marche disponibili
Unguento per occhi	Duratears	NA
Ago a farfalla flessibile	Greiner Bio-One	450120	Altre marche disponibili
Pinza Graefe (smussata)	Fine Science Tools	11051-10
Termoforo	Kentscientific	RightTemp Jr.	Altre marche disponibili
Scatola di imaging	NA		su misura
	Braun	Nutriflex special 70/240
Siringhe da insulina	BD	324911	Altre marche disponibili
Microscopio multifotone invertito con tavolino automatizzato	Leica Microsystems	NA
Vaporizzatore di isoflurano	Kentscientific	VetFlo-1231K
Porta aghi	Fine Science Tools	12510-14
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793	semitrasparente
Nastro di carta tesa	Tesa	NA
Vaselina		NA
Lamette da barba	Fisher scientific	11904325	Altre marche disponibili
	Elastomeri	NA	Qualsiasi casalinghi
Forbici a molla (piccole)	Fine Science Tools	15018-10
Siringa sterile PBS	ThermoFisher Scientific	10010023
(10 ml)	BD	305482	Altre marche disponibili
Pinze sottili	Fine Science Tools	11413-11
Coperchio in titanio per finestra	di imaging mammarioFinestra
		NA
Bastoncini di legno stuzzicadenti	Fisher scientific	NC1678836	Altre marche disponibili