Articolo metodologico

Quantificazione di specie reattive dell'ossigeno utilizzando la sonda di diacetato di 2′,7′-diclorofluoresceina e la citometria a flusso nelle cellule gliali di Müller

DOI:

10.3791/63337

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13 maggio 2022

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1Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba, 2Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (CIBICI), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra (INIMEC), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)

In questo articolo

Sommario

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Qui, proponiamo un protocollo sistematizzato, accessibile e riproducibile per rilevare le specie reattive dell'ossigeno cellulare (ROS) utilizzando la sonda di diacetato 2′,7′-diclorofluoresceina (DCFH-DA) nelle cellule gliali di Müller (MMC). Questo metodo quantifica i livelli totali di ROS cellulare con un citometro a flusso. Questo protocollo è molto facile da usare, adatto e riproducibile.

Abstract

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L'equilibrio redox ha un ruolo importante nel mantenimento dell'omeostasi cellulare. L'aumento della generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) promuove la modificazione di proteine, lipidi e DNA, che alla fine può portare ad alterazione della funzione cellulare e alla morte cellulare. Pertanto, è utile per le cellule aumentare la loro difesa antiossidante in risposta a insulti dannosi, attivando un percorso antiossidante come Keap1 / Nrf2 o migliorando gli spazzini redox (vitamine A, C ed E, β-carotene e polifenoli, tra gli altri). L'infiammazione e lo stress ossidativo sono coinvolti nella patogenesi e nella progressione delle retinopatie, come la retinopatia diabetica (DR) e la retinopatia della prematurità (ROP). Poiché le cellule gliali di Müller (MMC) svolgono un ruolo chiave nell'omeostasi del tessuto retinico neurale, sono considerate un modello ideale per studiare questi meccanismi di protezione cellulare. In questo senso, quantificare i livelli di ROS con un metodo riproducibile e semplice è essenziale per valutare il contributo di percorsi o molecole che partecipano al meccanismo di difesa cellulare antiossidante. In questo articolo, forniamo una descrizione completa delle procedure necessarie per la misurazione di ROS con sonda DCFH-DA e citometria a flusso in MMC. I passaggi chiave per l'elaborazione dei dati di citometria a flusso con il software sono forniti qui, in modo che i lettori saranno in grado di misurare i livelli di ROS (mezzi geometrici di FITC) e analizzare gli istogrammi di fluorescenza. Questi strumenti sono molto utili per valutare non solo l'aumento dei ROS dopo un insulto cellulare, ma anche per studiare l'effetto antiossidante di alcune molecole che possono fornire un effetto protettivo sulle cellule.

Introduzione

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La retina neurale è un tessuto molto organizzato che presenta strati neuronali ben definiti. In questi, i neuroni (cellule gangliari, amacrine, bipolari, orizzontali e fotorecettori) sono interconnessi tra loro e anche con cellule gliali di Müller (MMC) e astrociti, portando a un'adeguata fototrasduzione ed elaborazione delle informazioni visive 1,2. Le MGC sono note per avere un ruolo importante nel mantenimento dell'omeostasi retinica perché attraversano l'intera sezione retinica e, quindi, possono interagire con tutti i tipi di cellule che modulano molteplici processi protettivi. È stato riportato che le MG....

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Protocollo

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NOTA: per le composizioni tampone vedere tabella 1.

1. Preparazione della coltura cellulare

NOTA: Qui è descritta la preparazione della coltura delle cellule MIO-M1, una linea cellulare gliale umana Müller spontaneamente immortalata (Moorfield's/Institute of Ophthalmology- Müller 1). Utilizzare sempre una tecnica asettica adeguata e lavorare in una cappa a flusso laminare.

  1. Prepara il mezzo completo dell'Eagle (DMEM) modificato di Dulbecco. Per DMEM contenente 4,5 g/L di D-glucosio e 110 mg/L di piruvato di sodio, aggiungere il 10% di FBS inattivato dal calore, 10 mM di ....

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Risultati

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Come descritto nella sezione protocollo, abbiamo mostrato dati rappresentativi e quantitativi che dimostrano la rilevazione della citometria a flusso della produzione di ROS con la sonda di fluorescenza DCFH-DA da cellule MIO-M1 stimolate con induttore ROS, A o B. Come previsto, abbiamo osservato cambiamenti nella fluorescenza FITC in cellule non stimolate al di sopra dei livelli di autofluorescenza (Figura 1A, confronta "controllo basale" vs "controllo autofluorescenza", grafico a punti). C.......

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Discussione

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Diverse condizioni patologiche, come il cancro, le malattie infiammatorie, l'ischemia / riperfusione, la cardiopatia ischemica, il diabete e le retinopatie, e anche situazioni fisiologiche come l'invecchiamento, portano alla sovrapproduzione di ROS 6,7,8,9,10,11. Pertanto, il rilevamento, la misurazione e la comprensione del .......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano María Pilar Crespo e Paula Alejandra Abadie del CIBICI (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) per l'assistenza nella citometria a flusso e Gabriela Furlan e Noelia Maldonado per l'assistenza alle colture cellulari. Ringraziamo anche Victor Diaz (Pro-Segretario della Comunicazione Istituzionale di FCQ) per la produzione e il montaggio video.

Questo articolo è stato finanziato da sovvenzioni di Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) e Proye....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2′,7′-DCFH-DASigma35845-1G
4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico acido (HEPES)Gibco by life technologies15630-080
BD FACSCantometro a flusso IIBD BiosciencesFACSCanto
BD FACSDiva softwareBD Biosciences
Piastre per colture cellulari 100x20 mmCell Star- Greiner Bio-One664 160
CentrifugaThermoSorvall legend micro 17 R
Provette da centrifuga (15 ml)BIOFILCFT011150
Provette da centrifuga (50 ml)BIOFILCFT011500
CRYO crioviale. S - Greiner Bio-One126263
Dimetil SolfossidoSigma-AldrichW387520-1KG
Disodio-idrogeno-fosfato eptaidratoMerck106575
DMEM senza rosso fenoloGibco di life technologies31053-028
Dulbecco' s Eagle modificato' s medium (DMEM)Gibco by life technologies11995065
Acido etilendiammina tetraacetico (EDTA), sale disodico, diidratoMerck324503
siero fetale bovinoInternegocios
FlowJo v10 SoftwareBD Biosciences
GlucosioMerck108337
emocitometro, camera NeubauerBOECO, Germania
Cappa a flusso laminareESCOAC2-6E8
L-glutammina (GlutaMAX)Gibco by life technologiesA12860-01
MitoSOX RedInvitrogen  M36008
Penicillina/StreptomicinaGibco di life technologies15140-122
Cloruro di potassioMerck104936
Potassio-diidrogeno fosfatoMerck4878
Provette rotonde in polistirene 5 ml (provette per citometria a flusso)Falcon - CorningBD-352008
Sodio azideMerck822335
Cloruro di sodioMerck106404
Idrossido di sodioMerck106462
SPINWIN Micro Centrifuga Tubo 1,5 mlTarson500010-N
Piastra per coltura tissutale a 6 pozzettiBIOFILTCP011006
Trypan BlueMerck111732
Tripsina-EDTA 0,5% 10XGibco di life technologies15400-054
Miscelatore a vorticeLabnet International, Inc.

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
  2. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single....

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Stress ossidativoDifesa antiossidanteEquilibrio redoxIstogramma di fluorescenzaOmeostasi cellulareQuantificazione delle ROS

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