Il bioprocesso adsorbente migliora la resa di melanina da Pseudomonas stutzeri

Sommario

Qui presentiamo un protocollo sul bioprocesso adsorbente per produrre un prodotto biologico, in particolare un pigmento che inibisce la propria biosintesi e inibisce la crescita del microrganismo che lo produce.

Abstract

Le melanine sono pigmenti naturali e la presenza di anello indolico e numerosi gruppi funzionali rende la melanina la scelta ideale per molte applicazioni come agenti protettivi UV, cura della pelle, cosmetici ecc. Uno Pseudomonas stutzeri marino produce melanina senza l'aggiunta di tirosina. L'inibizione del feedback è stata osservata dalla melanina nella coltura di un batterio marino produttore di melanina, Pseudomonas stutzeri. La melanina ha anche dimostrato l'inibizione della crescita microbica. L'analisi basata su modelli di Han-Levenspiel ha identificato l'inibizione della melanina sulla crescita cellulare da parte di un prodotto di tipo non competitivo. L'enzima tirosinasi, che produce melanina, è stato inibito dalla melanina. Il doppio grafico reciproco della reazione enzimatica in presenza di diverse concentrazioni di melanina ha rivelato un'inibizione non competitiva del prodotto. È stato sviluppato un bioprocesso adsorbente basato su adsorbenti per ridurre l'inibizione del feedback da parte della melanina. Diversi adsorbenti sono stati sottoposti a screening per selezionare il miglior adsorbente per l'adsorbimento della melanina. La quantità e il tempo di dosaggio sono stati ottimizzati per sviluppare il bioprocesso adsorbente, che ha portato a un aumento di 8,8 volte della produzione di melanina da parte del batterio marino Pseudomonas stutzeri (da 153 mg/L a 1349 mg/L) senza l'integrazione di tirosina ed estratto di lievito.

Introduzione

Le melanine sono composti polifenolici la cui unità monomerica è l'anello indolico. Le melanine sono responsabili della maggior parte delle colorazioni nere, marroni e grigie di piante, animali e microrganismi¹. Le melanine più comuni sono le eumelanine, che sono pigmenti marrone scuro o neri ampiamente distribuiti nei vertebrati e negli invertebrati². Cefalopodi, piante e microbi sono le principali fonti di melanina³. La melanina ottenuta dai microrganismi ha diversi vantaggi rispetto alla melanina dei cefalopodi e delle piante. Sono a crescita rapida e non causano alcun problema di variazioni stagionali. Inoltre, si modificano in base al mezzo di crescita e alle condizioni operative fornite. Considerando tutti questi fatti, le fonti microbiche sono sfruttate come una delle principali fonti di melanina con potenziali applicazioni commerciali ^4,5,6. Guo et al. hanno utilizzato lo Streptomyces kathirae SC-1 ricombinante per produrre melanina fino a 28,8 g/L in un terreno ottimizzato⁷. Lagunas-Muñoz et al. Ottenuti circa 6 g/L di melanina in E. coli ricombinante ⁸. Wang et al. hanno ottenuto circa 4,2 g/L di melanina solubile dopo l'ottimizzazione del mezzo⁹. I ricercatori hanno anche studiato le colture marine per produrre melanina. Kiran et al. hanno prodotto melanina dalle specie marine di Pseudomonas ¹⁰. Kumar et al. hanno isolato Pseudomonas stutzeri HMGM-7 da alghe marine, che producevano melanina nel brodo di nutrienti. Tutti i produttori di melanina segnalati richiedono integratori di terreno, estratto di lievito e/o peptone per la produzione di melanina, che possono ostacolare l'aumento di scala del bioprocesso. Raman et al. hanno studiato la produzione di melanina da Aspergillus fumigatus AFGRD105, che non richiedeva costosi additivi¹¹.

Un batterio marino noto come Pseudomonas stutzeri, isolato dalle alghe, è stato selezionato per la produzione di melanina. Questo microrganismo non richiede un'integrazione aggiuntiva di tirosina ed estratto di lievito per la produzione di melanina solubile e cresce in terreni a base di acqua di mare, riducendo così l'impronta di acqua potabile e il costo medio. Thaira et al. hanno riportato un bioprocesso ottimizzato utilizzando la farina di torta di cocco per la produzione di nanopigmenti di melanina utilizzando questo batterio marino in una precedente pubblicazione¹². La melanina prodotta è stata utilizzata per la rimozione altamente efficiente dei metalli pesanti dalle acque sotterranee sintetiche. Tuttavia, durante l'ottimizzazione del mezzo, è stata identificata una plausibile inibizione della melanina per feedback sulla crescita e sulla formazione del prodotto. Pertanto, in questo protocollo, l'inibizione a feedback della melanina viene studiata e quantificata utilizzando il modello generalizzato di Han-Levenspiel. Viene sviluppato un protocollo di bioprocesso adsorbente semplice ed efficace per ridurre al massimo l'inibizione del feedback.

Protocollo

1. Crescita e mantenimento della coltura di Pseudomonas stützeri .

1. Procurarsi il batterio Pseudomonas stutzeri da MTCC Chandigarh (fornito come fiala liofilizzata).
   1. Disinfettare la superficie della fiala con alcool (70%). Segnare la fiala vicino al centro del manometro e rompere nell'area contrassegnata.
      NOTA: Prestare attenzione nell'aprire la fiala poiché il contenuto è sottovuoto. Prendere precauzioni durante la rottura della fiala, poiché un'apertura a scatto attirerà il tappo di cotone a un'estremità e un'apertura frettolosa rilascerà le particelle fini liofilizzate del microbo nell'aria.
   2. Rimuovere con cautela il tappo di cotone con una pinzetta sterilizzata e aggiungere 0,3 ml di brodo Luria Bertani (LB) alla fiala. Lasciate riposare per 30 min.
   3. Inoculare 100 μL della sospensione in 10 mL di brodo LB (in pallone conico da 100 mL) e metterlo nell'agitatore dell'incubatore a 180 giri/min mantenuto a 37 °C. Trasferire contemporaneamente 100 μl di sospensione nell'agar LB solido e diffondere per ottenere colonie isolate. Incubarlo a 37 °C per tutta la notte.
2. Una volta che la coltura è cresciuta, conservarla a 4 °C.
3. Fai la sottocoltura ogni 4 settimane strisciando una colonia su una piastra di agar LB fresca e incubando la piastra a 37 °C per una notte per la comparsa delle colonie.

2. Studi di inibizione della melanina sulla crescita e sull'attività enzimatica

1. Preparare il terreno di coltura aggiungendo 51,4 g/L di glucosio, 49,8 g/L di farina di cocco, 0,09 g/L, 0,03 g/L e 0,05 g/L di CuSO₄, FeSO₄ e MgSO₄, rispettivamente, in acqua di mare artificiale (Tabella dei materiali). Eseguire tutti gli esperimenti in un pallone da 250 mL con un volume di riempimento di 15 mL a 200 giri/min, 37 °C e un pH iniziale di 7.
2. All'inizio del bioprocesso, aggiungere diverse concentrazioni di melanina (100 mg/L, 200 mg/L, 500 mg/L e 1000 mg/L) in ciascun terreno di coltura.
3. Misurare il tasso di crescita specifico, l'attività enzimatica delle cellule e la melanina a diversi intervalli di tempo del bioprocesso per ogni concentrazione di melanina aggiunta (paragrafo 3.2).

3. Modellazione della cinetica di inibizione della melanina

1. Utilizzare la seguente equazione generalizzata di Han e Levenspiel¹³ per modellare la cinetica di inibizione della produzione di melanina,
   (1)
   Dove
   μ = tasso di crescita specifico apparente (1/h)
   μ_max = tasso di crescita specifico massimo (1/h)
   p = concentrazione del prodotto (g/L)
   p *= concentrazione critica del prodotto alla quale cessa la crescita (g/L)
   s = concentrazione del substrato (g/L)
   m,n = parametri
   L'equazione di cui sopra può essere riscritta come
   (2)
   Dove
   (3)
   e (4)
   L'equazione di cui sopra può essere riorganizzata in un doppio grafico reciproco di 1/μ contro 1/s, come indicato di seguito
   (5)
2. Tracciare una linea retta utilizzando i dati di diversi tassi di crescita specifici e concentrazioni di substrato utilizzando l'equazione di cui sopra. L'intercetta sull'asse Y e sull'asse X, rispettivamente, dà μ_max e K_s, che possono essere sostituite rispettivamente nelle condizioni 3 e 4 per ottenere μ_obs e K_obs.
   L'equazione (3) può essere scritta come
   (6)
3. Calcola il tasso di crescita specifico della coltura coltivata nel passaggio 2.2 e denominalo come μ_obs.
4. Utilizzare il valore del tasso di crescita specifico ottenuto al punto 3.3 dell'equazione (6). Adattare i dati a un'equazione lineare e calcolare la pendenza e l'intercetta.
5. Utilizzare l'equazione (3) per calcolare il tasso di crescita specifico massimo in assenza di melanina.

4. Sviluppo del bioprocesso adsorbente

1. Eseguire tutti gli esperimenti in un pallone da 250 mL con un volume di riempimento di 15 mL a 200 giri/min, 37 °C e un pH iniziale di 7.
2. Condurre il bioprocesso ottimizzato finale in un bioreattore con serbatoio agitato da 5 L e un volume di limatura di 3 L. Mantenere il pH della coltura tra 7-7,5 e l'ossigeno disciolto tra il 50% e il 60% della saturazione negli studi del bioreattore.

5. Selezione del miglior adsorbente tra i diversi adsorbenti disponibili

1. Aggiungere diversi adsorbenti come allumina, zeolite, celite, terra di fuller e carbone attivo in diversi flaconi contenenti il brodo di coltura.
2. Aggiungere ciascun adsorbente separatamente a una concentrazione di 1 g/L al brodo di coltura e tenerlo in uno shaker rotante a 150 giri/min per 12.
3. Separare gli adsorbenti mediante centrifugazione a 5000 x g per 10 minuti e misurare l'assorbanza del surnatante a 400 nm utilizzando uno spettrofotometro.
4. Selezionare l'adsorbente che assorbe la quantità massima di melanina dal brodo di coltura.

6. Effetto del tempo di somministrazione dell'adsorbente

1. Avviare il bioprocesso e aggiungere l'adsorbente ottenendo il più alto adsorbimento di melanina dalla coltura (selezionato dopo la sezione 5). La concentrazione selezionata nella fase iniziale è di 1 g/L.
2. Misurare la produzione massima di melanina secondo il protocollo¹² precedentemente pubblicato.
3. Ripetere il passaggio 6.1 aggiungendo l'adsorbente dopo 12 ore dall'inizio del bioprocesso e misurare la produzione di melanina in diversi momenti del bioprocesso.
4. Ripetere il passaggio 6.3 aggiungendo l'adsorbente dopo 24 ore, 36 ore e 48 ore dall'inizio del bioprocesso.
5. Confronta la melanina prodotta in ogni ciclo di bioprocesso e identifica il miglior tempo di dosaggio per la massima produzione e recupero di melanina.

7. Effetto della quantità di dosaggio dell'adsorbente

1. Aggiungere diverse concentrazioni del miglior adsorbente (0,5, 1, 2, 4, 6, 8 e 10 g/L) alle colture al momento identificate nella sezione 6.
2. Raccogliere il bioprocesso mediante centrifugazione a 5000 x g per 10 min.
3. Raccogliere il surnatante e calcolare la quantità di melanina misurando l'assorbanza a 400 nm.
4. Lavare il pellet contenente adsorbente due volte ciascuna con acqua distillata ed etanolo per rimuovere le cellule e altri composti attaccati all'adsorbente. Eseguire la fase di lavaggio per centrifugazione a 5000 x g per 10 min.
5. Aggiungere una soluzione di NaOH 0,1 M all'adsorbente lavato per desorbire la melanina.
6. Centrifugare la miscela a 5000 x g per 10 minuti e misurare la quantità di melanina nel surnatante a 400 nm con uno spettrofotometro.
7. Ripetere il processo di desorbimento tre volte o fino a quando l'adsorbente non torna al suo colore normale.
8. Ridurre il pH di questa soluzione concentrata di melanina desorbita a 3 o meno aggiungendo 1 N di HCl utilizzando un agitatore con perle magnetiche per far precipitare la melanina. Conservare la soluzione acida in frigorifero per 1 ora per aumentare la precipitazione, se necessario.
9. Lavare la melanina precipitata così ottenuta tre volte con acqua distillata per centrifugazione a 5000 x g per 10 min, asciugare e conservare a 4 °C.

8. Modellizzazione matematica del bioprocesso

1. Cinetica di crescita della biomassa
   1. Quantificare il tasso di crescita della biomassa utilizzando il seguente modello Verhulset modificato sviluppato per l'inibizione del prodotto, come descritto dall'equazione data di seguito 14,15,16,17,
      (7)
      Dove
      x = concentrazione di biomassa (g/L)
      x_m = concentrazione massima di biomassa (g/L)
      μ_obs = tasso di crescita specifico massimo (1/h) come dato dall'equazione (2)
      Vazques et al. (2008) hanno ulteriormente derivato la seguente equazione per la concentrazione di biomassa dall'equazione (7)
      (8)
      Dove
      v_x = tasso di crescita della biomassa (g/L/h) = μ_obs·x
      μ_obs = tasso di crescita specifico osservato (1/h)
      τ_x = tempo di ritardo (h)
      t = tempo (h)
   2. Utilizzare l'equazione (8) per calcolare la concentrazione di biomassa in diversi momenti del bioprocesso e simulare il profilo di crescita di Pseudomonas stutzeri.
2. Cinetica di consumo del substrato
   NOTA: Il substrato viene utilizzato per la crescita della biomassa, la formazione del prodotto e il mantenimento in un bioprocesso.
   1. Utilizzare la seguente equazione per bilanciare l'utilizzo del substrato nel bioprocesso,
      (9)
      La maggior parte del glucosio viene utilizzata per la generazione di biomassa; Pertanto, per semplificare, trascurare il consumo di substrato per la formazione del prodotto ridurrebbe l'equazione (9) a,
      (10)
      Dove
      S = concentrazione del substrato (g/L)
      Y_{P/S = coefficiente} di resa del prodotto, cioè coefficiente di resa della melanina (g/g)
      P = concentrazione del prodotto (g/L), cioè concentrazione di melanina (g/L)
      Y_{X/S = coefficiente} di resa della biomassa (g/g)
      m_s = coefficiente di mantenimento (g/g/h)
      Integrando l'equazione di cui sopra dal tempo t = 0 al tempo t = t, e sostituendo il valore di x dall'equazione (8) si ottiene la seguente equazione per il profilo di concentrazione del substrato¹⁷,
      (11)
      Dove, s₀ = concentrazione iniziale del substrato (g/L) e x₀ = concentrazione iniziale della biomassa (g/L)
   2. Utilizzare l'equazione (11) per calcolare la concentrazione del substrato a diversi intervalli di tempo del bioprocesso o se la concentrazione del substrato è nota, quindi utilizzare la stessa equazione per stimare i parametri forniti nell'equazione.
3. Cinetica di produzione della melanina
   1. Usa l'equazione Ludeking-Pirate per simulare la produzione di melanina. Tuttavia, la melanina è associata alla crescita e quindi il termine di formazione del prodotto non associato alla crescita viene trascurato e l'equazione semplificata può essere scritta come,
      (12)
      Dove
      α = Costante Ludeking-Pirate legata alla formazione del prodotto associata alla crescita (g/g)
      Integrando l'equazione (12) dal tempo t = 0 a t = t risulta nella seguente equazione per il profilo di concentrazione del prodotto
      (13)
   2. Usa l'equazione (13) per calcolare α.
4. Stima dei parametri cinetici
   1. Stimare tutti i parametri sopra menzionati con il metodo dei minimi quadrati non lineare di stima dei parametri utilizzando qualsiasi strumento software adatto (ad esempio, lo strumento risolutore di Microsoft Excel).
   2. Utilizza i dati dell'esperimento batch per la stima dei parametri e riduci al minimo la somma dell'errore al quadrato (SSE) utilizzando lo strumento Risolutore, come indicato dalla seguente equazione,
      Minimizzare
      (14)
      Dove
      x_sim = valore simulato e x_exp = valore sperimentale

9. Tecniche analitiche

1. Estrazione della melanina
   1. Centrifugare la coltura di crescita a 5000 x g per 10 minuti per rimuovere la biomassa.
   2. Aggiungere un volume uguale di 1 M di NaOH al surnatante.
   3. Acidificare il surnatante alcalino a pH 2 aggiungendo 1 N HCl per far precipitare la melanina.
   4. Centrifugare il surnatante acidificato a 12000 x g per 20 minuti per raccogliere la melanina.
   5. Lavare tre volte la melanina raccolta con 5 ml di acqua distillata, asciugare per una notte a temperatura ambiente (RT) e conservare a 4 °C¹⁸.
2. Quantificazione della melanina
   1. Preparare diverse concentrazioni di soluzioni di melanina (0-500 mg/L) sciogliendo la quantità appropriata di melanina in acqua di mare artificiale (pH 8).
   2. Misurare l'assorbanza a 400 nm utilizzando lo spettrofotometro¹⁸.
   3. Preparare la curva di calibrazione utilizzando i dati di cui sopra.
   4. Centrifugare la coltura di crescita a 5000 x g per 10 minuti per rimuovere la biomassa e misurare l'assorbanza del surnatante a 400 nm. Calcolare la concentrazione di melanina nella coltura di accrescimento utilizzando la curva di calibrazione preparata al punto 9.2.3
3. Dosaggio della tirosinasi
   1. Seguire il protocollo indicato di seguito per il saggio dell'enzima tirosinasi sviluppato da Ren et al. (2013)¹⁹ per determinare l'attività enzimatica della tirosinasi estratta dal brodo di coltura di Pseudomonas stutzeri .
   2. Centrifugare la coltura batterica a 5.000 x g per raccogliere le cellule.
   3. Sonicare le cellule in un tampone fosfato freddo da 100 mM di pH 6,5 e centrifugare l'omogenato a 9000 x g per 15 minuti e raccogliere il surnatante, una fonte di enzima tirosinasi.
   4. Aggiungere 0,2 mL della soluzione enzimatica ottenuta nel passaggio precedente a 2,8 mL di tampone fosfato di sodio 0,1 M (pH 6,5) contenente 1 mM di L-tirosina (substrato).
   5. Osservare la formazione del dopacromo misurando l'assorbanza a 475 nm.
   6. Calcolare l'attività della tirosinasi come segue. Un'unità internazionale (UI) di attività della tirosinasi è definita come la quantità di enzima necessaria per ossidare 1 μmol di L-tirosina a dopacroma al minuto. Calcola questo utilizzando il coefficiente di estinzione molare del dopacromo (3600 L·^M-1·^cm-1) con la seguente equazione,
      (15)
4. Stima della biomassa
   1. Raccogliere 5 mL di campioni a intervalli di 4 ore nella cabina di Biosicurezza, mantenendo la sterilità. Fiammeggiare il tappo di cotone del pallone prima e dopo aver prelevato i campioni per ridurre le possibilità di contaminazione. Misurare la densità ottica (OD) dei campioni a 660 nm per tutti questi campioni.
      NOTA: Il terreno non inoculato funge da bianco. Queste letture saranno utilizzate per studiare la crescita dei microrganismi.
   2. Centrifugare il brodo di coltura a 5000 x g per 10 min e 4 °C, raccogliere il pellet cellulare ed essiccare il pellet per 8 h a 60 °C in un forno ad aria calda per ottenere la massa cellulare secca.
   3. Preparare la curva di calibrazione utilizzando l'OD misurato al punto 9.4.1 e la corrispondente biomassa ottenuta al punto 9.4.2
   4. Utilizzare la curva di calibrazione (OD = 0,82٠Biomassa (g/L)) per misurare la quantità incognita di biomassa misurando la densità ottica del brodo di coltura in un dato momento.
5. Stima del DNA
   1. Stimare la quantità di DNA nel campione misurando la densità ottica a 260 nm.
   2. Calcolare il DNA utilizzando la seguente formula,
      (16)
      Dove
      A₂₆₀= Assorbanza a 260 nm
      0,1 = Volume del campione
      1 = Assorbanza della soluzione standard di DNA con concentrazione di 50 μg/mL, a 260 nm
6. Stima delle proteine
   1. Stimare la quantità di proteine nei campioni utilizzando un kit di stima delle proteine Bradford (Tabella dei materiali).
   2. Aggiungere 5 mL di reagente Bradford a 0,1 mL di surnatante e tenerlo per 5 minuti. Le proteine presenti nel surnatante reagiscono con il reagente di Bradford per formare un complesso colorato.
   3. Misurare l'assorbanza a 595 nm²⁰ utilizzando lo spettrofotometro.
7. Stima dello zucchero riducente totale (TRS)
   1. Misurare il TRS con il metodo dinitrosalicilico (DNS)²¹.
   2. Preparare la soluzione DNS sciogliendo 1 g di DNS in 50 ml di acqua distillata. Aggiungere 30 g di tartarato di sodio e potassio a questa soluzione in piccole quantità fino a quando il colore della soluzione diventa giallo latteo, seguito da giallo-arancio trasparente con l'aggiunta di 20 mL di 2 N NaOH. Portare il volume fino a 100 ml utilizzando acqua distillata e conservarlo al buio.
   3. Preparare la soluzione di lavoro del glucosio (0,01 M) sciogliendo 180 mg di glucosio in 100 ml di acqua distillata in un normale pallone.
   4. Pipettare la soluzione di glucosio standard (0,2, 0,4, 0,6, 0,8 e 1 mL) in 5 provette separate. Utilizzare una provetta contenente acqua distillata (1 ml) come soluzione in bianco.
   5. Portare il volume fino a 2 ml in ciascuna provetta utilizzando acqua distillata.
   6. Aggiungere 1 mL di reagente DNS a ciascuna provetta e coprire con un foglio di alluminio.
   7. Scaldare le provette a bagnomaria bollente per 5 minuti e raffreddarle a RT.
   8. Aggiungere 9 ml di acqua distillata in ogni provetta e mescolare bene. Misurare il diametro esterno del contenuto a 575 nm utilizzando uno spettrofotometro.
   9. Misurare la concentrazione utilizzando una tabella di calibrazione preparata con la quantità di glucosio sull'asse X rispetto all'assorbanza a 575 nm (A₅₇₅) sull'asse Y.
8. Analisi granulometrica
   1. Disperdere la melanina biosintetizzata in acqua distillata (1 mL) utilizzando un sonicatore.
   2. Aggiungere la soluzione campione dispersa (1 mL) nell'analizzatore di nanoparticelle e misurare la dimensione delle particelle secondo il protocollo del produttore.
9. Analisi al microscopio elettronico a trasmissione (TEM)
   1. Essiccare la polvere di melanina ottenuta dopo l'estrazione mantenendola a 60 °C per 8 ore.
   2. Caricare la polvere di melanina nella matrice del campione TEM e misurare le dimensioni utilizzando il microscopio elettronico a trasmissione seguendo il protocollo dell'operatore.

Risultati

La Figura 1A, B mostra la crescita e la produzione di melanina sotto l'influenza di diverse concentrazioni iniziali di melanina. La crescita cellulare e la produzione di melanina sono diminuite sostanzialmente con l'aumentare della concentrazione iniziale di melanina. A una concentrazione iniziale di melanina di 500 mg/L nel terreno, la biomassa e la melanina si sono ridotte a quasi il 50% del valore massimo ottenuto nel controllo. A 1000 mg/L di concentrazione iniziale di m...

Discussione

L'inibizione del prodotto è un grave collo di bottiglia nel bioprocesso che porta a una riduzione della produttività. Esistono diversi metodi per ridurre l'inibizione del prodotto, come il bioprocesso continuo e le tecniche di rimozione del prodotto in situ. Tuttavia, queste opzioni richiedono una revisione completa dell'impianto di biotrattamento esistente 23,24,25,26,27,28....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Allumina + A15A26A3: A13A3: A16A3: A17	HiMedia	GRM1909
Carbone attivo	HiMedia	PCT1001
Acqua di mare artificiale Medium	HiMedia	M1942
Bradford	HiMedia	ML106
Celite	HiMedia	GRM226
Centrifuga	REMI	CM-8
Provette da centrifuga	HiMedia	PW1207
Acido dinitrosalicilico	Fiaschetta di Erlenmeyer HiMedia	GRM1582
	Borosil	4980021
terra di Fuller	HiMedia	GRM232
Glucosio	HiMedia	MB037
HCl	HiMedia	AS004
L-tirosina	HiMedia	RM069
Microsoft Excel
Analizzatore di nanoparticelle	Microsoft HORIBA Scientific	Nanopartica SZ-100
Nutriente Agar medio	HiMedia	M001
Piastra di Petri	HiMedia	PW054
Tampone fosfato	HiMedia	M1452
Idrossido di sodio	Spettrofotometro HiMedia	MB095
	Thermofisher	Genesys 10
Bioreattore a serbatoio agitato	Scigenics	Bioferm LS
TE Buffer	HiMedia	ML060
Microscopio elettronico a trasmissione	JEOL	JEM-2100
Zeolite	HiMedia	GRM3834