Isolamento delle cellule staminali mesenchimali del tessuto adiposo di ratto per la differenziazione in cellule produttrici di insulina

Le cellule staminali mesenchimali (MSC), note anche come cellule stromali mesenchimali, sono tra i tipi di cellule più utilizzati per la medicina rigenerativa ^1,2. Sono classificate come cellule staminali adulte e caratterizzate da potenziale di differenziazione multilineare e capacità di auto-rinnovamento³. Le MSC possono essere isolate e ottenute da varie fonti, tra cui tessuto adiposo, midollo osseo, sangue periferico, tessuto e sangue del cordone ombelicale, follicoli piliferi e denti ^4,5.

L'isolamento delle cellule staminali dal tessuto adiposo è visto come attraente e promettente grazie al loro facile accesso, alla rapida espansione in vitro e all'alta resa⁶. Le cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo (Ad-MSC) possono essere isolate da diverse specie come esseri umani, bovini, topi, ratti e, più recentemente, capre⁷. È stato dimostrato che gli Ad-MSC sono ora potenziali candidati per l'ingegneria tissutale e la terapia genica / cellulare che possono anche essere utilizzati per sviluppare un'alternativa autologa per la riparazione a lungo termine di lesioni o difetti dei tessuti molli ^7,8.

L'International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) ha definito tre criteri minimi che devono essere esibiti dalle MSC per la caratterizzazione completa⁹. In primo luogo, devono essere aderenti alla plastica. In secondo luogo, le MSC dovrebbero esprimere marcatori di superficie delle cellule staminali mesenchimali come CD73, CD90 e CD105 e mancare di espressione dei marcatori ematopoietici CD45, CD34, CD14 o CD11b, CD79α o CD19 e HLA-DR. Infine, le MSC dovrebbero mostrare la capacità di differenziarsi nei tre lignaggi mesenchimali: adipociti, osteociti e condrociti. È interessante notare che le MSC possono anche differenziarsi in altri lignaggi come cellule neuronali, cardiomiociti, epatociti e cellule epiteliali ^10,11.

Infatti, le MSC possiedono proprietà uniche che consentono loro di essere applicate come potenziali agenti terapeutici nella terapia rigenerativa per diverse malattie. Le MSC possono secernere fattori solubili per indurre un ambiente immunomodulatore che fornisce benefici terapeutici¹². Inoltre, le MSC possono migrare verso siti di lesioni e microambienti tumorali per fornire una terapia mirata; tuttavia, i meccanismi non sono completamente chiariti¹³. Inoltre, le MSC hanno la capacità di secernere esosomi, vescicole extracellulari su scala nanometrica che trasportano un carico di RNA non codificanti, proteine e fattori solubili, che ultimamente sono emersi come un nuovo meccanismo del potenziale terapeutico delle MSC in varie malattie¹⁴.

Ancora più importante, le MSC hanno generato una notevole attenzione per il loro potenziale di differenziazione in cellule produttrici di insulina (IPC), sia mediante modificazione genetica^15,16 o attraverso l'utilizzo di vari fattori estrinseci all'interno dei terreni di coltura in vitro¹⁷. Il periodo di induzione IPC varia notevolmente, in quanto dipende dal protocollo di induzione utilizzato e dai fattori estrinseci utilizzati. Il processo di differenziazione può durare da giorni a mesi e richiede una combinazione di fattori che inducono esogeni che devono essere aggiunti e / o ritirati in diverse fasi. Molti di questi fattori che sono stati utilizzati per il differenziamento pancreatico endocrino sono composti biologicamente attivi che hanno dimostrato di promuovere la proliferazione o differenziazione/neogenesi delle cellule β secernenti insulina e/o aumentare il contenuto di insulina delle IPC 18,19,20,21. È interessante notare qui che le MSC sono state anche segnalate per avere effetti terapeutici nel diabete e nelle sue complicanze attraverso diversi meccanismi, incluso il loro secretoma, così come una vasta gamma di azioni immuno-modulatorie 22,23,24.

In questo protocollo, presentiamo un protocollo graduale dettagliato per l'isolamento e la caratterizzazione di Ad-MSC da grasso epididimale di ratto, seguito da un protocollo semplice e relativamente breve per la generazione di IPC da Ad-MSC.

Tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo le linee guida approvate e tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Etico della Facoltà di Farmacia, The British University in Egypt (BUE), Cairo, Egitto. Il protocollo di isolamento Ad-MSC è stato adottato da Lopez e Spencer, con modifiche¹⁵.

1. Isolamento di Ad-MSC da cuscinetti di grasso epididimale di ratto

1. Utilizzare ratti maschi Sprague-Dawley del peso di 250-300 g che non hanno più di 1 mese di età (due per isolamento). Anestetizzare gli animali, quindi eutanasalizzarli per lussazione cervicale. Spruzzare l'animale eutanasizzato con il 70% di etanolo. Asportare la pelle e il muscolo nella parte inferiore dell'addome, quindi estrarre i due testicoli per esporre i cuscinetti di grasso epididimale.
2. Tagliare delicatamente i cuscinetti di grasso epididimale e fare attenzione a non tagliare i vasi sanguigni.
3. Isolare il tessuto adiposo che circonda l'epididimo, quindi metterlo in una capsula di Petri contenente soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
4. Nell'armadio di biosicurezza, taglia questi cuscinetti di grasso in piccoli pezzi usando pinze e bisturi. Trasferire questi pezzi di tessuto adiposo tagliato in un tubo di centrifuga da 50 ml contenente 10 ml di PBS sterile.
5. Lavare i tessuti grassi tritati 5 volte con 10 ml di PBS ogni volta per rimuovere il sangue contaminante. Le seguenti procedure di lavaggio devono essere eseguite meticolosamente.
   1. Aggiungere 10 ml di PBS al tessuto e mescolare accuratamente per 45 s. Quindi, lasciare che il tessuto si depositi per gravità mantenendo il tubo in piedi per 5 minuti per separarsi in due strati.
   2. Aspirare il PBS dall'infranatante usando una siringa da 10 ml e sostituirlo con 10 ml di PBS freschi per un altro lavaggio.
   3. Ripetere questa fase di lavaggio 4-5 volte fino a quando il PBS è privo di sangue. Ciò indica che la maggior parte, se non tutto, del sangue viene rimosso.
6. Dopo il lavaggio, risospesciare il tessuto adiposo in 10 ml di soluzione di collagenasi (0,1% collagenasi di tipo 1 in PBS). Sigillare saldamente il tubo con parafilm, quindi incubarlo in un bagno d'acqua tremante (37 ° C, 80 giri / min, per 45 minuti) fino a quando il tessuto è quasi omogeneo.
   NOTA: Evitare la digestione completa del tessuto (quando la soluzione diventa completamente omogenea con completa scomparsa di tutti i residui/pezzi di tessuto), perché influisce negativamente sulla coltura delle cellule in seguito. Di solito, la digestione richiede 30-45 minuti.
7. Una volta terminata la digestione della collagenasi, ruotare il tubo per 15 s, quindi centrifugare per 5 minuti a 300 x g. Ruotare nuovamente il tubo per 10 s, seguito da un'altra centrifugazione di 5 minuti. Verranno quindi osservati tre strati. Scartare con attenzione lo strato di olio, seguito dallo strato acquoso, senza disturbare il pellet della frazione vascolare stromale (SVF).
   NOTA: Rimuovere il surnatante contenente adipociti e la soluzione di collagenasi. In primo luogo, rimuovere gli adipociti e lo strato di olio di accompagnamento con una pipetta da 10 ml per garantire la completa rimozione delle goccioline d'olio, quindi rimuovere lo strato acquoso sottostante.
8. Sospendere il pellet SVF sul fondo del tubo in 10 ml di soluzione sterile di BSA (1% di albumina, soluzione di frazione V sierica bovina in PBS), quindi centrifugare il tubo per 5 minuti a 300 x g.
9. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e sospendere il pellet SVF in 8,5 mL di supporto completo per Ad-MSC (composto da Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 [DMEM/F12] media integrato con 10% FBS, 100 U/mL penicillina, 100 μg/mL streptomicina, 0,25 μg/mL amfotericina B e 2 mM L-glutammina).
10. Coltivare le cellule in un matraccio di 25 cm² a 37 °C sotto il 5% di CO_2. Il giorno seguente, controllare le celle collegate, rimuovere le celle sospese e sostituire il supporto. In seguito, cambia i media a giorni alterni.
11. Passare le cellule ogni 5-7 giorni quando sono 80% -90% confluenti usando tripsina-EDTA. Utilizzare le cellule tra i passaggi 3-5 per gli esperimenti successivi descritti in questo protocollo. Una presentazione schematica di tutti i passaggi di isolamento è fornita nella Figura 1.
    NOTA: Di solito, la potenza di Trypisn-EDTA può variare tra i diversi fornitori, quindi cerca di ridurre al minimo il tempo di tripsinizzazione per evitare effetti tossici sulle cellule.

2. Caratterizzazione di Ad-MSC mediante immunofenotipizzazione mediante analisi citometriche a flusso

1. Al passaggio 3, dividere le cellule usando tripsina-EDTA. Lavare con PBS 2 volte e quindi contare le cellule con un emocitometro.
2. Incubare 100.000 cellule a 4 °C al buio per 20 minuti con un anticorpo monoclonale anti-ratto di topo CD90 o CD105 (marcatori mesenchimali) o CD34 (marcatore ematopoietico) etichettato con fluoresceina-isotiocianato (FITC).
3. Lavare le cellule e sospenderle in 500 μL di tampone FACS. Analizzare mediante citometria a flusso²⁵.

3. Valutazione del potenziale di differenziazione delle Ad-MSC isolate in vari lignaggi mesenchimali

1. Differenziamento adipogenico
   1. Risospese le cellule in mezzi completi (come descritto nel passaggio 1.9.), quindi coltivare le cellule ad una densità di 3,7 x 10⁴ cellule / pozzetto in una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. Incubare a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO₂. Successivamente, cambia il supporto ogni 3 giorni fino a quando le cellule raggiungono quasi il 100% di confluenza, che di solito richiede 3 giorni.
   2. Quando le cellule raggiungono la confluenza desiderata, sostituire i mezzi di proliferazione con il mezzo di differenziazione adipogenico (costituito da mezzi LG-DMEM integrati con 10% FBS, 100 U/mL penicillina, 100 μg/mL streptomicina, 0,25 μg/mL amfotericina B e 2 mM L-glutammina con 1x integratore adipogenico, fornito con il Kit di identificazione funzionale delle cellule staminali mesenchimali) per indurre l'adipogenesi. Quindi, cambiare il supporto ogni 3 giorni (0,5 ml / bene). Fare attenzione a eseguire delicatamente la sostituzione del fluido in modo da non interrompere i vacuoli lipidici.
   3. Dopo 21 giorni, valutare la differenziazione adipogenica mediante esame microscopico dell'aspetto dei vacuoli lipidici e colorazione Oil Red.
   4. Preparare una soluzione madre di Oil Red sciogliendo 30 mg di macchia Oil Red in 10 ml di isopropanolo, quindi conservarla per almeno 20 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, preparare una soluzione di lavoro mescolando 3 parti di soluzione madre con 2 parti di acqua a doppio distillato (ddH₂O), mescolarle bene e conservarle per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi filtrare successivamente con carta da filtro.
   5. Per documentare la differenziazione adipogenica, lavare le cellule 2 volte con PBS, quindi fissarle utilizzando formalina tamponata neutra al 10% (0,75 ml / pozzetto) per 15 minuti. Successivamente, lavare le cellule 2 volte con PBS usando 1 ml / pozzetto e incubare le cellule per 5 minuti ogni volta. È importante aspirare completamente il PBS prima di aggiungere la soluzione di lavoro Oil Red.
   6. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere la soluzione di lavoro Oil Red alle cellule e incubarle per 60 minuti a 37 °C. Successivamente, rimuovere la soluzione di macchia e lavare delicatamente le cellule 2 volte con PBS. Osservare le goccioline lipidiche colorate al microscopio.
2. Differenziamento osteogenico
   1. Seminare 7,4 x 10³ cellule/pozzetto (0,5 ml di mezzo/pozzetto) in una piastra a 24 pozzetti e incubarle a 37 °C in un'atmosfera umidificata del 5% di CO₂ in mezzi completi (come descritto nella fase 1.9.) per 3 giorni per raggiungere quasi il 70% di confluenza.
   2. Indurre le cellule con l'integratore osteogenico (fornito con il kit) in supporti LG-DMEM integrati con 10% FBS, 100 U / mL penicillina, 100 μg / mL streptomicina, 0,25 μg / mL amfotericina B e 2 mM L-glutammina.
   3. Continuare l'induzione osteogenica per 21 giorni, cambiando i mezzi di differenziazione ogni 3 giorni.
   4. Preparare una soluzione di lavoro della colorazione Alizarin Red S sciogliendo 200 mg di colorazione Alizarin Red S in 9 mL di ddH₂O, quindi regolare il pH a 4,1-4,3 usando idrossido di ammonio e HCl. Quindi, portare il volume a 10 mL da ddH₂O. Successivamente, rimuovere eventuali precipitati mediante filtrazione utilizzando carta da filtro.
   5. Lavare le cellule 2 volte con PBS, quindi fissarle utilizzando formalina tamponata al 10% (0,75 ml / pozzetto) per 15 minuti. Successivamente, lavare le cellule 2 volte usando PBS (1 ml / pozzetto). Ogni volta, incubare le cellule per 5 minuti.
   6. Incubare le cellule fisse con la soluzione S al 2% alizarina-rosso preparata per 30 minuti in un incubatore a 37 °C.
   7. Successivamente, rimuovere la soluzione di colorazione, lavare le cellule 2 volte con ddH₂O e una volta con PBS, quindi osservare la matrice extracellulare ricca di calcio colorata per valutare la differenziazione osteogenica al microscopio.
3. Differenziazione condrogenica
   1. Seminare 7,4 x 10³ cellule/pozzetto (0,5 ml di mezzo/pozzetto) in una piastra a 24 pozzetti e incubarle a 37 °C in un'atmosfera umidificata del 5% di CO₂ in mezzi completi (come descritto nella fase 1.9.) per 3 giorni per raggiungere quasi il 70% di confluenza.
   2. Quando viene raggiunta la confluenza desiderata, indurre la differenziazione condrogenica delle cellule con DMEM/F12 privo di siero contenente insulina-transferrina selenio (ITS), integratore condrogenico (fornito con il kit), 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina, 0,25 μg/mL di amfotericina B e 2 mM di L-glutammina²¹.
   3. Incubare le cellule con il mezzo condrogenico per 21 giorni, mentre si cambia il mezzo di differenziazione condrogenica ogni 3 giorni.
   4. Preparare una soluzione di lavoro della colorazione Alcian Blue 8GX come segue: In primo luogo, preparare una soluzione di acido acetico glaciale al 3% in ddH₂O aggiungendo 3 mL di acido acetico glaciale a 97 mL di ddH₂O. Quindi, preparare una soluzione di lavoro della macchia Alcian Blue 8GX mescolando 0,1 g in 100 ml di soluzione di acido glaciale al 3% e rimuovere eventuali precipitati mediante filtrazione con carta da filtro.
   5. Lavare le cellule 2 volte con PBS, quindi fissarle utilizzando formalina tamponata al 10% (0,75 ml / pozzetto) per 15 minuti. Successivamente, lavare le cellule 2 volte usando PBS (1 ml / pozzetto). Ogni volta, incubare le cellule per 5 minuti.
   6. Il passo successivo è quello di incubare le cellule nella colorazione 0.1% Alcian Blue 8GX preparata in acido acetico glaciale al 3% per 60 minuti a 37 °C. Lavare le cellule colorate 2 volte con ddH₂O e una volta con PBS, quindi osservare i proteoglicani solfati colorati al microscopio.

4. Differenziazione degli Ad-MSC in IPC

1. Al passaggio 3, dividere gli Ad-MSC usando Trypsin-EDTA. In primo luogo, rimuovere il supporto, quindi lavare le cellule mentre sono ancora attaccate nel pallone di coltura con 5 ml di PBS. Quindi, aggiungere 5 ml di tripsina-EDTA al matraccio da 75 cm² e incubare a 37 °C per 3-10 minuti.
   NOTA: Cercare di indurre le cellule nei passaggi precoci, di solito tra P3-P5, poiché i passaggi tardivi influenzano negativamente le proprietà e le capacità di differenziazione delle cellule^17,24.
2. Successivamente, ispezionare le cellule per il distacco e per essere una sospensione unicellulare. Aggiungere 5 mL di supporto DMEM/F12 completo al pallone per inibire l'azione della tripsina. Raccogliere la sospensione cellulare e trasferirla in un tubo da 15 mL, quindi aggiungere altri 5 mL di supporto DMEM/F12 completo al tubo.
3. Centrifugare le celle a 300 x g per 2 minuti per pellettare le celle.
4. Lavare le celle una volta con PBS, centrifugare di nuovo a 300 x g per 2 minuti, quindi risospese il pellet di cella in 3-5 ml di supporto DMEM / F12 completo.
5. Contare le cellule usando il colorante di esclusione blu tripano e un emocitometro.
6. Quindi, seminare le cellule in piastre a 6 pozzetti (1 x 10⁶ cellule / piastra) e una piastra a 12 pozzetti (per il test GSIS; 1 x 10⁶ cellule / piastra) e incubare in un incubatore a 37 ° C, 5% CO₂ in mezzi completi (come descritto nel passaggio 1.9.) per 3 giorni per raggiungere quasi il 90% di confluenza.
7. Il giorno dell'induzione, rimuovere il mezzo, lavare le cellule con PBS e quindi pre-indurre le cellule per 2 giorni con mezzi di pre-induzione (DMEM / F12 integrato con 10% FBS, 100 U / mL penicillina, 100 μg / mL streptomicina, 0,25 μg / mL amfotericina B, 2 mM L-glutammina, 10 mM nicotinamide [NA] e 1mM β-mercaptoetanolo [β-ME]).
8. Indurre le cellule per un altro 1 giorno utilizzando DMEM ad alto contenuto di glucosio (HG-DMEM, 4,5 g / L di glucosio) integrato con 2,5% FBS, 100 U / mL penicillina, 100 μg / mL di streptomicina, 0,25 μg / mL di amfotericina B, 2 mM L-glutammina, 10 mM NA e 1 mM β-mercaptoetanolo. Raccogliere i pellet di cellule alla fine di questa fase (cellule D3 designate in questo protocollo).
9. Incubare le cellule per altri 7 giorni nel mezzo di induzione della differenziazione finale composto da HG-DMEM integrato con 2,5% FBS, 100 U /mL penicillina, 100 μg/mL streptomicina, 0,25 μg/mL amfotericina B, 2 mM L-glutammina, 10 mM NA, 1mM β-mercaptoetanolo e 10 nM exendin-4.
10. Alla fine del periodo specificato, raccogliere i pellet cellulari (denominati Final in questo protocollo) e valutare la differenziazione riuscita delle cellule mediante colorazione DTZ e test GSIS, come segue in questo protocollo.
11. Valutare gli IPC generati seguendo i passaggi 5 e 6 riportati di seguito.

5. Colorazione del ditizone

1. Preparare la soluzione madre colorante di ditizone (DTZ) come segue: Sciogliere completamente 25 mg di DTZ in 2,5 ml di dimetilsolfossido (DMSO), dividere in aliquote e conservare a -20 °C al buio fino all'uso.
2. Per la colorazione, preparare una soluzione di lavoro 1:100 (volume/volume) diluendo la soluzione madre in un terreno di coltura completo (HG-DMEM integrato con 5% FBS, 100 U/mL penicillina, 100 μg/mL di streptomicina, 0,25 μg/mL di amfotericina B e 2 mM di L-glutammina). Quindi, filtrare la soluzione di lavoro attraverso un filtro a siringa da 0,2 μm.
3. Successivamente, per le cellule di coltura di colorazione DTZ specificate in una piastra a 6 pozzetti e, dopo aver aspirato il terreno di coltura, lavare le cellule una volta con PBS, quindi aggiungere 2 ml di soluzione di lavoro DTZ in ciascun pozzetto. Incubare per almeno 2 ore a 37 °C nell'incubatore a CO₂ .
4. Lavare accuratamente le cellule 2 volte con PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 2 ml di PBS in ciascun pozzetto. Quindi, osserva gli IPC macchiati di rosso cremisi al microscopio invertito. Utilizzare Ad-MSC non indotti inizialmente coltivati in un mezzo di crescita completo (10% FBS - DMEM/F12) come controllo.

6. Espressione genica di marcatori a cellule β mediante RT-qPCR

1. Estrazione dell'RNA
   1. Dopo la differenziazione, raccogliere i pellet cellulari e conservarli a -80 °C fino all'uso. Sospendere ogni pellet cellulare (derivato dai sei pozzetti di una piastra a 6 pozzetti raggruppata) in 1 mL di reagente di estrazione dell'RNA tiocianato di guanidio in un tubo privo di nucleasi da 1,5 mL, insieme al pipettaggio su e giù più volte. Incubare i campioni lisati a temperatura ambiente per 5 minuti per consentire la completa dissociazione dei complessi nucleoproteici.
   2. Aggiungere 200 μL di cloroformio per 1 mL di reagente di estrazione dell'RNA e tappare saldamente i tubi per essere vigorosamente agitati a mano per 15 s. Quindi, incubare per 3 minuti a temperatura ambiente.
   3. Centrifugare i campioni a 13.800 x g per 15 min a 4 °C. Ciò porterà alla separazione della miscela in una fase cloroformio inferiore, un'interfase e una fase acquosa superiore incolore, con l'RNA che rimane nella fase acquosa.
   4. Posizionare la fase acquosa superiore in un nuovo tubo, evitando accuratamente di toccare l'interfase.
   5. Aggiungere 600 μL di isopropanolo al 100% alla fase acquosa (volume 1:1), quindi mescolare accuratamente i campioni per inversione 25 volte e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
   6. Centrifugare i campioni a 18.800 x g per 30 minuti a 4 °C. L'RNA precipitato forma un piccolo pellet gelatinoso sul lato del tubo.
   7. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet con 1 mL di etanolo ghiacciato all'80%. Dopo aver aggiunto l'etanolo, condurre lentamente il pipettaggio multiplo del pellet di RNA per 10 s.
   8. Centrifugare i campioni per 5 minuti a 9.600 x g a 4 °C. Scartare il surnatante e lasciare asciugare i pellet di RNA all'aria per 5-10 minuti.
   9. Dopo l'essiccazione, sciogliere i pellet di RNA in 25-100 μL di acqua priva di RNasi (secondo la dimensione iniziale del pellet) tubando su e giù più volte fino alla completa solubilizzazione in tubi privi di nucleasi da 1,5 mL. Evitare un'eccessiva essiccazione del pellet di RNA.
      NOTA: Di solito, il pellet diventa trasparente quando si asciuga. Tuttavia, una volta che è chiaro, risospenderlo prontamente per evitare un'eccessiva secchezza del pellet.
   10. Quantificare l'RNA determinando le densità ottiche (OD) a 260 nm e 280 nm, utilizzando acqua priva di nucleasi come bianco.
   11. Assicurarsi che i campioni abbiano OD260/OD280 = 1.8-2.0.
2. Sintesi del cDNA
   1. Sintetizzare il cDNA dall'RNA totale isolato utilizzando un kit di sintesi del cDNA.
   2. Eseguire la reazione di sintesi del cDNA secondo le istruzioni del produttore. In un tubo PCR da 200 μL, aggiungere un volume di soluzione di RNA contenente 0,5 μg di RNA totale alla miscela master di reazione mostrata nella Tabella 1.
   3. Dopo aver aggiunto l'RNA alla miscela master, immettere la miscela attraverso un programma ciclico di 50 °C per 30 minuti per un ciclo, seguito da un ciclo di inattivazione di 95 °C per 2 minuti, utilizzando un ciclo termico.
   4. Diluire il cDNA utilizzando acqua priva di nucleasi ad una concentrazione finale di 2 ng/μL. Conservare a -20 °C per la successiva RT-qPCR.
3. RT-qPCR con SYBR Green Master Mix
   1. Effettuare la reazione RT-qPCR per ciascun gene bersaglio utilizzando il modello di cDNA secondo la miscela di reazione mostrata nella Tabella 2. Fai tutte le misure in triplice copia.
   2. I set di primer utilizzati sono mostrati nella Tabella 3. Eseguire tutte le procedure RT-qPCR su ghiaccio.
   3. Eseguire la reazione RT-qPCR utilizzando una macchina PCR in tempo reale sulle impostazioni predefinite del programma. Le condizioni di ciclo termico includevano la denaturazione iniziale di 95 °C per 10 min, seguita da 45 cicli di denaturazione (95 °C, 15 s) e ricottura/estensione combinata (60 °C, 1 min).
   4. Determinare i valori di C_t e rilevare i livelli di espressione in conformità con ^2-ΔΔCt, con β-actina come controllo interno.

Tabella 1: volumi master mix di sintesi cDNA.

Tabella 2: Miscela di reazione RT-qPCR.

Tabella 3: Sequenze di primer avanti e indietro.

7. Secrezione di insulina stimolata dal glucosio

1. Preparazione del tampone in bicarbonato Ringer (KRB) di Kreb
   1. Preparare la soluzione tampone di bicarbonato Ringer (KRB) di Kreb con concentrazioni di glucosio (basso glucosio) e 20 mM di glucosio (glucosio alto) per il test della secrezione di insulina stimolata dal glucosio (GSIS). I componenti utilizzati per la preparazione del tampone KRB sono riportati nella Tabella 4.
   2. Regolare il pH del tampone utilizzando 1 N HCl a circa 7,25-7,35 (cioè 0,1-0,2 unità al di sotto del pH desiderato 7,4, perché potrebbe aumentare durante la filtrazione).
   3. Aggiungere l'albumina sierica bovina (BSA) appena in una concentrazione dello 0,1 % (peso/volume).
   4. Aggiungere glucosio in seguito (18 mg per 50 mL di KRB per preparare il tampone KRB a basso contenuto di glucosio da 2 mM e 180 mg per 50 ml di KRB per preparare il tampone KRB ad alto contenuto di glucosio da 20 mM).
   5. Sterilizzare i tamponi LG e HG KRB preparati mediante filtrazione attraverso un filtro a siringa da 0,2 μm per essere pronti per il test GSIS.
2. Saggio GSIS
   1. Inizialmente seminare 1 x 10⁵ cellule / pozzetto in una piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti e indurre queste cellule utilizzando lo stesso identico protocollo di induzione della differenziazione.
   2. Alla fine del protocollo di induzione, lavare delicatamente gli IPC generati (in piastra) 2 volte con PBS e una volta con LG-KRB.
   3. Successivamente, incubare gli IPC con 300 μL di LG-KRB/pozzetto per 1 ora, quindi scartare questo buffer.
   4. Quindi, incubare gli IPC con 300 μL di tampone KRB da 2 mM (LG) o 20 mM (HG) per ulteriori 1 ora. Alla fine del periodo di incubazione, raccogliere il surnatante e conservare a -80 °C per il successivo test insulinico secreto utilizzando un kit ELISA commerciale e seguendo le istruzioni del produttore.
      NOTA: Cercare di essere il più delicati possibile durante l'aspirazione o l'aggiunta del buffer PBS e KRB durante l'esecuzione del test GSIS.

Tabella 4: I componenti utilizzati per la preparazione del buffer KRB.

8. Analisi statistica

1. Esprimere tutti i dati come media ± errore standard della media (SEM). Tutti i confronti sono stati effettuati utilizzando l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) e il test post hoc di Tukey utilizzando un software statistico. I risultati con valori p **p ≤ 0,01 e *p ≤ 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.

Isolamento e caratterizzazione di Ad-MSC
Come mostrato nella Figura 2, le cellule isolate dal tessuto adiposo hanno mostrato una popolazione eterogenea di cellule arrotondate e simili ai fibroblasti a partire dal giorno successivo di isolamento (Figura 2A). 4 giorni dopo l'isolamento, le cellule dei fibroblasti hanno iniziato ad aumentare in numero e dimensioni e a crescere come popolazione omogenea entro il passaggio 1 (Figura 2B,C). Queste cellule hanno continuato a crescere come cellule fibroblastiche aderenti alla plastica, come mostrato fino al passaggio 3, soddisfacendo il primo criterio delle caratteristiche MSC (Figura 2D). Questi Ad-MSC hanno mostrato ottime caratteristiche di coltura e questo protocollo è risultato essere un protocollo pertinente, facile e relativamente veloce per isolare gli Ad-MSC dai cuscinetti di grasso epididimale.

Il passo successivo è stato quello di caratterizzare gli Ad-MSC isolati. Secondo l'ISCT, le MSC dovrebbero seguire i tre criteri di aderenza plastica, espressione di CD mesenchimali con una mancanza di marcatori ematopoietici e la capacità di differenziarsi in adipociti, osteociti e condrociti. Come mostrato nella Figura 3A, l'analisi della citometria a flusso ha mostrato che la maggior parte di queste cellule esprimeva CD90 e CD105 (rispettivamente 76,4% e 73,6%). Nel frattempo, erano quasi negativi per CD34 (0,1%).

Inoltre, dopo l'induzione della differenziazione di queste cellule, hanno mostrato la capacità di differenziarsi in adipociti, osteociti e condrociti. Come mostrato nella Figura 3B (pannello superiore), gli adipociti hanno mostrato colorazione Oil Red dei vacuoli lipidici rispetto alle cellule non indotte di controllo. Gli osteociti hanno mostrato una caratteristica colorazione alizarina rossa (Figura 3B, pannello centrale) rispetto alle cellule di controllo. Infine, le cellule indotte dai condrociti hanno mostrato una colorazione blu della matrice extracellulare rispetto alle cellule non indotte di controllo (Figura 3B, pannello inferiore).

Questi dati indicano chiaramente che le cellule isolate dal tessuto adiposo non solo presentano buone caratteristiche di coltura, ma presentano anche tutti i criteri proposti per le MSC.

Differenziazione delle Ad-MSC in cellule produttrici di insulina (IPC)
Come mostrato nella Figura 4A, abbiamo utilizzato un protocollo relativamente semplice e breve per differenziare gli Ad-MSC in IPC. Dopo l'induzione della differenziazione, gli IPC indotti sono stati valutati in diversi modi. Le cellule indotte hanno mostrato marcati cambiamenti morfologici. Come mostrato nella Figura 4B (pannello superiore), le cellule indotte hanno mostrato una morfologia arrotondata, simile a un cluster, rispetto alla normale morfologia fibroblastica delle Ad-MSC. È interessante notare che, dopo la colorazione con ditizone, questi cluster hanno mostrato una macchia cremisi, che è una caratteristica dei granuli di zinco della macchia a cellule β (Figura 4B, pannello inferiore).

Successivamente, gli IPC generati sono stati valutati geneticamente per l'espressione degli specifici marcatori a cellule β rispetto alle cellule di controllo non indotte. Come mostrato nella Figura 5A-E, le cellule indotte sono state in grado di esprimere vari marcatori specifici a cellule β, indicando la loro capacità di generare IPC. Per quanto riguarda FOXA2-un marcatore endoderma definitivo (come mostrato in Figura 5A)-, è stato altamente espresso alla differenziazione D3 rispetto al controllo, raggiungendo quasi 30 volte e poi diminuendo a solo 10 volte del controllo nelle cellule differenziate finali (D3: 28,37 ± 0,88; Finale: 12.10 ± 1.27; p < 0,05). Per quanto riguarda Pdx-1 (che è considerato un marcatore precoce di cellule β), è stato elevato sia nelle cellule differenziate D3 che finali, raggiungendo quasi 20 volte rispetto alle cellule non indotte di controllo (D3: 22,39 ± 5,14; Finale: 17.13 ± 0.342; p < 0,05; Figura 5B). Per quanto riguarda gli altri marcatori a cellule β, vale a dire NKX6.1, MafA e insulina-1 (Ins1), tutti hanno mostrato un'elevazione a partire da D3 fino alla differenziazione finale, raggiungendo quasi 8 volte, 12 volte e 300 volte, rispettivamente, rispetto alle cellule non indotte di controllo (NKX6.1: D3: 1,94 ± 0,86, Finale: 7,97 ± 1,34, p<0,05; MafA: D3: 6.59 ± 0.4, Finale: 11.54 ± 2.40, p < 0.05; e Ins1: D3: 27.29 ± 20.27, Finale: 318.20 ± 76.09, p < 0.05) (Figura 5C-E). Ciò indica che questi Ad-MSC possono differenziarsi in IPC che esprimono marcatori a cellule β.

Infine, queste cellule sono state valutate per la secrezione di insulina quando sfidate con concentrazioni crescenti di glucosio. Come mostrato nella Figura 5F, l'insulina secreta nel surnatante delle IPC indotte quando sfidata con 20 mM di glucosio era significativamente superiore a quella secreta quando le cellule venivano sfidate con 2 mM di glucosio (HG: 390 pg/mL ± 33 pg/mL; LG: 234 pg/mL ± 32 pg/mL, p < 0,05; Figura 5F)

Questi dati hanno confermato che il protocollo utilizzato è riuscito a differenziare gli Ad-MSC in IPC, il che è stato confermato geneticamente e funzionalmente.

Figura 1: Presentazione schematica dei passaggi del protocollo utilizzato per l'isolamento e la caratterizzazione di Ad-MSC. Generato da Biorender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Fotomicrografie che mostrano gli Ad-MSC isolati. (A) Le cellule isolate che presentano morfologia simile a quella dei fibroblasti aderenti alla plastica iniziano ad apparire il giorno successivo all'isolamento. (B) Nel corso del tempo, questi Ad-MSC aderenti (con morfologia simile ai fibroblasti) proliferano e aumentano di numero, raggiungendo una popolazione più omogenea simile ai fibroblasti in (C) P1 e (D) P3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Caratterizzazione di Ad-MSC. (A) L'analisi citometrica a flusso di Ad-MSC mostra che queste cellule sono quasi negative per CD34 (pannello superiore), mentre la maggior parte delle cellule esprime CD90 e CD105 (pannello inferiore). Le Ad-MSC possono differenziarsi nei tre lignaggi mesenchimali, vale a dire (B) adipociti (dove le goccioline di olio sono macchiate dal rosso olio), (C) osteociti, colorati dal rosso alizarina e (D) condrociti, colorati dal blu alciano (rispetto alle cellule non indotte di controllo). Controllo: cellule non indotte, Diff: cellule differenziate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Differenziazione degli Ad-MSC in IPC. (A) Presentazione schematica del protocollo di differenziazione utilizzato per generare IPC da Ad-MSC, insieme a fotomicrografie per le cellule in ogni fase durante l'induzione della differenziazione verso IPC. Dopo la differenziazione, le cellule perdono la loro morfologia fibroblastica e tendono ad aggregarsi formando grappoli, che tendono a staccarsi e crescere in mezzi di sospensione. (B) Le fotomicrografie mostrano ad-MSC e IPC di controllo generati dal protocollo di cui sopra che mostrano cambiamenti morfologici a cluster rotondi (pannello di destra) rispetto alla morfologia simile ai fibroblasti delle Ad-MSC non indotte (pannello di sinistra), non macchiate (pannello superiore) o colorate DTZ (pannello inferiore).
Controllo: cellule non indotte; IPC: cellule produttrici di insulina; NA: nicotinamide; β-ME: beta mercaptoetanolo; D3: Cellule indotte al Giorno 3 durante l'induzione della differenziazione verso IPC; D10: IPC differenziati finali al termine del protocollo di induzione; Ex-4: exendin-4. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Livelli di espressione relativa dei marcatori a cellule β e GSIS per gli IPC. Livelli di espressione relativa per qRT-PCR per (A) FOXA2, (B) Pdx-1, (C) NKX6.1, (D) MafA e (E) Ins-1. (F) Livelli di insulina secreta nel surnatante dopo aver sfidato gli IPC generati con 2mM glucosio (LG) o 20mM glucosio (HG). Controllo: Ad-MSC non indotte, Giorno-3: cellule differenziate raccolte a D3; Finale: IPC differenziati finali; LG: basso contenuto di glucosio; HG: glicemia alta. a: la media è diversa dal controllo a p < 0,05; b: la media è diversa dal Day-3 a p < 0,05; *: la media di LG è diversa da HG a p < 0,05; il confronto è stato fatto utilizzando un t-test di campioni indipendenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tutti i co-autori dichiarano nessun conflitto di interessi associato a questo lavoro.