Le cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo (Ad-MSC) possono essere una potenziale fonte di MSC che si differenziano in cellule produttrici di insulina (IPC). In questo protocollo, forniamo passaggi dettagliati per l'isolamento e la caratterizzazione di Ad-MSC epididimali di ratto, seguiti da un protocollo semplice e breve per la generazione di IPC dallo stesso Rat Ad-MSCs.
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Articolo metodologico
Isolamento delle cellule staminali mesenchimali del tessuto adiposo di ratto per la differenziazione in cellule produttrici di insulina
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule staminali mesenchimali (MSC), in particolare quelle isolate dal tessuto adiposo (Ad-MSC), hanno guadagnato particolare attenzione come fonte rinnovabile e abbondante di cellule staminali che non pone alcuna preoccupazione etica. Tuttavia, i metodi attuali per isolare gli Ad-MSC non sono standardizzati e impiegano protocolli complicati che richiedono attrezzature speciali. Abbiamo isolato gli Ad-MSC dal grasso epididimale dei ratti Sprague-Dawley usando un metodo semplice e riproducibile. Le Ad-MSC isolate di solito compaiono entro 3 giorni dall'isolamento, poiché le cellule aderenti mostrano morfologia fibroblastica. Queste cellule raggiungono l'80% di confluenza entro 1 settimana dall'isolamento. Successivamente, al passaggio 3-5 (P3-5), è stata effettuata una caratterizzazione completa per le Ad-MSC isolate mediante immunofenotipizzazione per marcatori di superficie caratteristici del cluster di differenziazione MSC (CD) come CD90, CD73 e CD105, oltre a indurre la differenziazione di queste cellule lungo i lignaggi osteogenici, adipogenici e condrogeni. Questo, a sua volta, implica la multipotenza delle cellule isolate. Inoltre, abbiamo indotto la differenziazione delle Ad-MSC isolate verso il lignaggio delle cellule produttrici di insulina (IPC) attraverso un protocollo semplice e relativamente breve incorporando il mezzo Eagle modificato di Dulbecco ad alto contenuto di glucosio (HG-DMEM), β-mercaptoetanolo, nicotinamide ed exendin-4. La differenziazione degli IPC è stata valutata geneticamente, in primo luogo, misurando i livelli di espressione di specifici marcatori a cellule β come MafA, NKX6.1, Pdx-1 e Ins1, nonché la colorazione del ditizone per gli IPC generati. In secondo luogo, la valutazione è stata effettuata anche funzionalmente mediante un test di secrezione di insulina stimolata dal glucosio (GSIS). In conclusione, gli Ad-MSC possono essere facilmente isolati, esibendo tutti i criteri di caratterizzazione MSC, e possono effettivamente fornire un'abbondante fonte rinnovabile di IPC in laboratorio per la ricerca sul diabete.
Introduzione
Le cellule staminali mesenchimali (MSC), note anche come cellule stromali mesenchimali, sono tra i tipi di cellule più utilizzati per la medicina rigenerativa 1,2. Sono classificate come cellule staminali adulte e caratterizzate da potenziale di differenziazione multilineare e capacità di auto-rinnovamento3. Le MSC possono essere isolate e ottenute da varie fonti, tra cui tessuto adiposo, midollo osseo, sangue periferico, tessuto e sangue del cordone ombelicale, follicoli piliferi e denti 4,5.
L'isola....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo le linee guida approvate e tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Etico della Facoltà di Farmacia, The British University in Egypt (BUE), Cairo, Egitto. Il protocollo di isolamento Ad-MSC è stato adottato da Lopez e Spencer, con modifiche15.
1. Isolamento di Ad-MSC da cuscinetti di grasso epididimale di ratto
- Utilizzare ratti maschi Sprague-Dawley del peso di 250-300 g che non hanno più di 1 mese di età (due per isolamento). Anestetizzare gli animali, quindi eutanasalizzarli per lussazione cervicale. Spruzzare l'animale eutanas....
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Risultati
Isolamento e caratterizzazione di Ad-MSC
Come mostrato nella Figura 2, le cellule isolate dal tessuto adiposo hanno mostrato una popolazione eterogenea di cellule arrotondate e simili ai fibroblasti a partire dal giorno successivo di isolamento (Figura 2A). 4 giorni dopo l'isolamento, le cellule dei fibroblasti hanno iniziato ad aumentare in numero e dimensioni e a crescere come popolazione omogenea entro il passaggio 1 (.......
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Discussione
In questo protocollo, siamo riusciti a presentare un protocollo dettagliato per l'isolamento di Ad-MSC dal grasso epididimale di ratto e la differenziazione di questi Ad-MSC in IPC. Infatti, il grasso epididico di ratto è una fonte facilmente raggiungibile di tessuto adiposo per ottenere Ad-MSC e non richiede alcuna attrezzatura speciale, né per la raccolta né per la lavorazione 15,26,27. Gli Ad-MSC isolati hanno mostrato un'ecc.......
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Dichiarazioni
Tutti i co-autori dichiarano nessun conflitto di interessi associato a questo lavoro.
Ringraziamenti
Riconosciamo il Dr. Rawda Samir Mohamed, MSc, Specialista Veterinario, Facoltà di Farmacia, Università Britannica d'Egitto (BUE) per aver aiutato con la dissezione dei ratti.
Vorremmo anche riconoscere e apprezzare gli sforzi della Facoltà di Comunicazione di Massa, The British University in Egypt (BUE) per la produzione e l'editing del video di questo manoscritto.
Vorremmo ringraziare Miss Fatma Masoud, MSc, Assistant Lecturer of English, The British University in Egypt (BUE) per la revisione e la correzione di bozze in lingua inglese del manoscritto.
Questo lavoro è stato parzialment....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Albumina, siero bovino Frazione V | MP Biomedicals | ||
| Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, USA | A3157 | |
| Alizarina Red S | Sigma-Aldrich, USA | A5533 | |
| Idrossido di ammonio | Fisher Scientific, Germania | ||
| Anticorpo per ratto CD90, FITC | Stem Cell Technologies | 60024FI | |
| Albumina sierica bovina | Sigma Aldrich | A3912 | |
| Cloruro di calcio | Fisher Scientific, Germania | ||
| Anticorpo monoclonale CD105, FITC | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | MA1-19594 | |
| Anticorpo policlonale CD34 | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | PA5-85917 | |
| Cloroformio | Fisher Scientific, USA | ||
| Collagenasi tipo I, polvere | Gibco, Thermo Fisher, USA | 17018029 | |
| D-glucosio anidro, extra puro | Fisher Scientific, Germania | G/0450/53 | |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Fisher Scientific, Germania | BP231-100 | |
| Colorazione con ditizone | Sigma-Aldrich, USA | D5130 | |
| DMEM - Alto glucosio 4,5 g/L | Lonza, Svizzera | 12-604F | |
| DMEM - Basso contenuto di glucosio 1 g/L | Lonza, Svizzera | 12-707F | |
| DMEM/F12 medio | Lonza, Svizzera | BE12-719F | |
| Acqua libera da DNAsi/RNAsi | Gibco Thermo Fisher, USA | 10977-035 | |
| Etanolo assoluto, grado di biologia molecolare | Sigma-Aldrich, Germania | 24103 | |
| Exendin-4 | Sigma-Aldrich, Germania | E7144 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gibco Thermo Fisher, Brasile | 10270-106 | |
| Formaldeide 37% | Fisher Scientific Acido | ||
| cloridrico (HCl) | Fisher Scientific, Germania | ||
| Isopropanolo, grado di biologia molecolare | Fisher Scientific, USA | BP2618500 | |
| L-Glutammina | Gibco Thermo Fisher, USA | 25030-024 | |
| Cloruro di magnesio (anidro) | Fisher Scientific, Germania | ||
| Kit di identificazione funzionale delle cellule staminali mesenchimali | R& D systems Inc., MN, USA | SC006 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Germania | N0636 | |
| Olio Macchia Rossa | Sigma-Aldrich, USA | O0625 | |
| Penicillina-Streptomicina-Amfotericina | Gibco Thermo Fisher, USA | 15240062 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato, 1X, senza Ca/Mg | Lonza, Svizzera | BE17-516F | |
| Potassio Cloruro | Fisher Scientific, Germania | ||
| Kit ELISA per insulina per ratto | Cloud-Clone Corp., USA | CEA682Ra | |
| Bicarbonato di sodio | Fisher Scientific, Germania | ||
| Cloruro di sodio | Fisher Scientific, Germania | ||
| Fosfato di sodio bibasico (anidro) | Fisher Scientific, Germania | ||
| Sodio Fosfato monobasico (anidro) | Fisher Scientific, Germania | ||
| SYBR Verde Maxima | Thermo Scientific, USA | K0221 | |
| Filtro per siringa, 0,2 micron | Corning, USA | 431224 | |
| TRIzol | Thermo Scientific, USA | 15596026 | |
| Trypan blu | Gibco Thermo Fisher, USA | 15250061 | |
| Tripsina-Versene-EDTA, 1X | Lonza, Svizzera | CC-5012 | |
| Kit di sintesi del cDNA verso | Thermo Scientific, USA | AB-1453/A | |
| β-mercaptoetanolo | Sigma-Aldrich, Germania | M3148 |
Riferimenti
- Hmadcha, A., Martin-Montalvo, A., Gauthier, B. R., Soria, B., Capilla-Gonzalez, V. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cancer therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 43(2020).
- Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H. Sources and therapeutic strategies of mesenchymal stem cells in regenerative medicine.
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Ristampe e permessi
