Studio del traffico proteico di membrana nelle cellule fotorecettrici di Drosophila utilizzando proteine con tag eGFP

Sommario

Qui, vengono descritti metodi non invasivi per la localizzazione delle proteine di membrana dei fotorecettori e la valutazione della degenerazione retinica nell'occhio composto Drosophila utilizzando la fluorescenza eGFP.

Abstract

Il traffico proteico di membrana regola l'incorporazione e la rimozione di recettori e canali ionici nella membrana plasmatica. Questo processo è di fondamentale importanza per la funzione cellulare e l'integrità cellulare dei neuroni. Le cellule fotorecettori di Drosophila sono diventate un modello per lo studio del traffico proteico di membrana. Oltre alla rodopsina, che dopo l'illuminazione viene internalizzata dalla membrana dei fotorecettori e viene degradata, il canale ionico potenziale del recettore transitorio (TRPL) in Drosophila mostra una traslocazione dipendente dalla luce tra la membrana del fotorecettore rabdomerale (dove si trova al buio) e il corpo cellulare del fotorecettore (a cui viene trasportato all'illuminazione). Questo trasporto intracellulare di TRPL può essere studiato in modo semplice e non invasivo esprimendo TRPL marcato con eGFP nelle cellule dei fotorecettori. La fluorescenza eGFP può quindi essere osservata sia nello pseudopupil profondo che mediante microscopia ad immersione in acqua. Questi metodi consentono il rilevamento della fluorescenza nell'occhio intatto e sono quindi utili per saggi ad alto rendimento e screening genetici per mutanti di Drosophila difettosi nella traslocazione TRPL. Qui, la preparazione delle mosche, le tecniche microscopiche e i metodi di quantificazione utilizzati per studiare questa traslocazione innescata dalla luce di TRPL sono spiegati in dettaglio. Questi metodi possono essere applicati anche per studi di traffico su altre proteine fotorecettrici di Drosophila , ad esempio la rodopsina. Inoltre, utilizzando proteine rabdomerali marcate con eGFP, questi metodi possono essere utilizzati per valutare la degenerazione delle cellule fotorecettrici.

Introduzione

Fornendo e rimuovendo proteine da e verso la membrana plasmatica, il traffico di proteine di membrana nei neuroni controlla l'apparecchiatura della membrana plasmatica con recettori e canali ionici e, di conseguenza, regola la funzione neuronale. La cattiva regolazione o i difetti nel traffico proteico hanno in genere effetti dannosi sulle cellule e provocano la degenerazione neuronale. Nell'uomo, questo può causare malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer e Parkinson o la retinite pigmentosa¹. I fotorecettori nell'occhio composto di Drosophila melanogaster sono diventati un sistema modello in vivo per lo....

Protocollo

1. Considerazioni generali

1. Utilizzare stock di Drosophila che esprimono una proteina di fluorescenza permanentemente localizzata in modo rachdomerico per l'analisi morfologica (ad esempio, TRP::eGFP, eGFP::NINAC) e la traslocazione delle proteine per le analisi relative al traffico proteico (ad esempio, TRPL::eGFP, Arr2::eGFP).
2. Predeterminare le condizioni di esposizione alla luce delle mosche selezionate per l'approccio sperimentale.
   1. Per l'adattamento al buio, tenere le mosche in scatole scure per il periodo desiderato a 25 °C. Per un'illuminazione fino a 16 ore negli esperimenti di traslocazione (ad esempio, trP....

Risultati

Sono state generate mosche transgeniche drosophila che esprimono una proteina di fusione TRPL::eGFP sotto il controllo del promotore della rodopsina 1. In queste mosche, TRPL::eGFP è espresso nelle cellule fotorecettrici R1-6 dell'occhio composto e mostra una localizzazione dipendente dall'illuminazione. Quando le mosche sono tenute al buio, TRPL::eGFP è incorporato nei rabdomeri esterni. Dopo l'illuminazione per diverse ore, TRPL trasloca nel corpo cellulare dove viene immagazzinato in un compartimento arricchi.......

Discussione

L'applicabilità delle proteine di fluorescenza e la semplicità dello screening mediante imaging DPP e microscopia ad immersione in acqua retinica hanno dimostrato di avere successo in molti gruppi¹². Strategie simili a quelle qui presentate sono state utilizzate in diversi screening genetici per rilevare difetti nei livelli di espressione della rodopsina, nell'omeostasi, nell'organizzazione retinica o nell'integrità cellulare con l'aiuto di Rh1::eGFP 17,18,19,20,21.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provetta da centrifuga da 15 mL	Greiner Bio-One	188271
CO2 cuscinetto per anestesia	Flystuff	59-172
Lampada a luce fredda (KL 1500 LCD)	Zeiss
Fiji/ImageJ	NIH
Microscopio a fluorescenza con lampada UV, fotocamera, set di filtri e software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue Tubo	fluorescente Zeiss
(Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13) [1750 Lux, Ee470nm = 298 µ W cm-2, Ee590nm = 215 µ W cm-2] e [760 Lux, Ee470nm = 173 µ W cm-2, Ee590nm = 147 µ W cm-2]	Osram	4050300518039
Pipetta da laboratorio (20-200 µ L)	Eppendorf
Vetrino per oggetti	Roth	0656.1
Piastra di Petri (94 mm)	Greiner Bio-One	633102
Puntali per pipette (200 &; L)Labsolute		7695844
Plastilina (Blu-Tack)	Stereomicroscopio Bostik	30811745
(SMZ445)	Stereomicroscopio Nikon
con lampada UV, fotocamera, set di filtri e software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)	Leica