Visualizzazione simultanea della dinamica di microtubuli reticolati e singoli in vitro mediante microscopia TIRF

Summary

Qui, viene presentato un test di ricostituzione in vitro basato sulla microscopia TIRF per quantificare e confrontare contemporaneamente la dinamica di due popolazioni di microtubuli. Viene descritto un metodo per visualizzare simultaneamente l'attività collettiva di più proteine associate a microtubuli su fasci di microtubuli reticolati e singoli microtubuli.

Abstract

I microtubuli sono polimeri di eterodimeri αβ-tubulina che si organizzano in strutture distinte nelle cellule. Le architetture e le reti basate su microtubuli spesso contengono sottoinsiemi di array di microtubuli che differiscono nelle loro proprietà dinamiche. Ad esempio, nelle cellule in divisione, fasci stabili di microtubuli reticolati coesistono in prossimità di microtubuli dinamici non reticolati. Gli studi di ricostituzione in vitro basati sulla microscopia TIRF consentono la visualizzazione simultanea della dinamica di questi diversi array di microtubuli. In questo test, una camera di imaging è assemblata con microtubuli immobilizzati in superficie, che sono presenti come singoli filamenti o organizzati in fasci reticolati. L'introduzione di tubulina, nucleotidi e regolatori proteici consente la visualizzazione diretta delle proteine associate e delle proprietà dinamiche di microtubuli singoli e reticolati. Inoltre, i cambiamenti che si verificano quando i singoli microtubuli dinamici si organizzano in fasci possono essere monitorati in tempo reale. Il metodo qui descritto consente una valutazione sistematica dell'attività e della localizzazione delle singole proteine, nonché degli effetti sinergici dei regolatori proteici su due diversi sottoinsiemi di microtubuli in condizioni sperimentali identiche, fornendo così intuizioni meccanicistiche inaccessibili con altri metodi.

Introduction

I microtubuli sono biopolimeri che formano scaffold strutturali essenziali per molteplici processi cellulari, che vanno dal trasporto intracellulare e dal posizionamento degli organelli alla divisione cellulare e all'allungamento. Per eseguire queste diverse funzioni, i singoli microtubuli sono organizzati in array di dimensioni micron, come fusi mitotici, assonemi ciliari, fasci neuronali, array interfase e array corticali vegetali. Un motivo architettonico onnipresente trovato in queste strutture è un fascio di microtubuli reticolati lungo le loro ^lunghezze1. Una caratteristica intrigante di diverse strutture a base di microtubuli è la coesis....

Protocol

1. Preparare i reagenti

1. Preparare tamponi e reagenti come indicato nelle Tabelle 1 e Tabella 2. Durante l'esperimento, mantenere tutte le soluzioni sul ghiaccio, se non diversamente specificato.

Soluzione	Componenti		Durata di archiviazione consigliata	Note
5X BRB80	400 mM K-PIPES, 5 mM MgCl2, 5 mM EGTA, pH 6,8 c....

Results

L'esperimento sopra descritto è stato eseguito utilizzando microtubuli biotinilati marcati con fluoroforo da 647 nm, microtubuli non biotinilati marcati con fluoroforo da 560 nm e mix di tubulina solubile marcata con fluoroforo da 560 nm. I microtubuli sono stati reticolati dalla proteina reticolante PRC1 (marcata GFP). Dopo aver generato fasci immobilizzati in superficie e singoli microtubuli (fase 5.11), la camera di imaging è stata montata su un obiettivo di olio TIRF 100X 1,49 NA e visualizzata nei canali di fluoresc.......

Discussion

L'esperimento qui descritto espande significativamente la portata e la complessità dei saggi convenzionali di ricostituzione dei microtubuli, che vengono tradizionalmente eseguiti su singoli microtubuli o su un tipo di array. L'attuale test fornisce un metodo per quantificare e confrontare simultaneamente l'attività map regolatoria su due popolazioni, vale a dire singoli microtubuli e fasci reticolati. Inoltre, questo test consente l'esame di due tipi di fasci: quelli che sono preformati da semi stabili prima dell'inizio.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(±)-Acido 6-idrossi-2,5,7,8-tetrametilcromatono-2-carbossilico (Trolox)	Acido Sigma Aldrich	238813
1,4-piperazinadietanosolfonico (PIPES)	Sigma Aldrich	P6757
18x18 mm #1.5 vetrini	Microscopia elettronica Scienze	63787
2-mercaptoetanolo (BME)	Sigma Aldrich	M-6250
24x60 mm #1.5 vetrini coprioggetti Microscopia	elettronica Scienze	63793
405/488/560/647 nm Laser Quad Band	Chroma	TRF89901-NK
Acetone	Sigma Aldrich	320110
Adenosina 5'-trifosfato sale disodico idrato (ATP)	Sigma Aldrich	A7699-5G
Avidin, NeutrAvidin® Proteina legante la biotina (sonde molecolari®)	Thermo Fischer Scientific	A2666
Sonicatore da bagno: Branson 2800 Cleaner	Branson	CPX2800H
Beckman Coulter Tubi in policarbonato a parete spessa, 11 x 34 mm	Beckman-Coulter
Beckman Coulter Tubi in policarbonato a parete spessa, 8 x 34 mm	Beckman-Coulter
Biotina-PEG-SVA, MW 5.000	Laysan Bio	#Biotin-PEG-SVA-5000
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma Aldrich	2905
Catalasi	Sigma Aldrich	C40
Corning LSE Mini microcentrifuga, AC100-240V	Corning	6670
Salviette per attività delicate	Kimtech	34120
Ditiotreitolo (DTT)	GoldBio	DTT10
	Chroma	ET610/75m
Etanolo (a prova di 200)	Decon Labs	2705
Acido tetraacetico glicole etilenico (EGTA)	Sigma Aldrich	3777
Glucosio ossidasi	Sigma Aldrich	G2133
GMPCPP	Jena Bioscience	NU-405
Guanosina 5'-trifosfato sale sodico idrato (GTP)	Detergente Sigma Aldrich	G8877
Hellmanex III	Sigma Aldrich	Z805939
Olio da immersione, Tipo A	Fisher Scientific	77010
Kappa-caseina	Sigma Aldrich	C0406
Lanolina	Fisher Scientific	S25376
Panno per la pulizia delle lenti	ThorLabs	MC-5
Cloruro di magnesio (MgCl2)	Sigma Aldrich	M9272
Metilcellulosa	Sigma Aldrich	M0512
Microfuge 16 Centrifuga da banco	Beckman-Coulter	A46474
Vetrini per microscopio, vetro bianco diamantato, 25 x 75 mm, 90 gradi Bordi rettificati, globo smerigliato BIANCO	Scientific	1380-50W
mPEG-succinimidil valerato, MW 5.000	Laysan Bio	#NH2-PEG-VA-5K
Optima™ Ultracentrifuga da tavolo Max-XP	Beckman-Coulter
Paraffina	Fisher Scientific	P31-500
PELCO Reverse (autochiusura), Pinzetta fine	Ted Pella	5377-NM
Petrolato, White	Fisher Scientific	18-605-050
Detergente al plasma, 115V	Harrick Plasma	PDC-001
Idrossido di potassio (KOH)	Sigma Aldrich	221473
Bicarbonato di sodio	Sigma Aldrich	S6014
Saccarosio	Sigma Aldrich	S7903
Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath	USA Scientific	2510-1101
Blocco Thermal-Lok per provette da 1,5 e 2,0 mL	USA Scientific	2520-0000
Thermo Scientific™ Pierce&commercio; Bond-Breaker e commercio; Soluzione TCEP, pH neutro; 500mM	Thermo Fischer Scientific	PI-77720
TIRF 100X NA 1.49 Olio Obiettivo	Nikon	CFI Apocromatico TIRF 100XC Olio
TIRF microscopio	Nikon	Eclipse Ti
TLA 120.1 rotore	Beckman-Coulter
rotore TLA 120.2	Beckman-Coulter
Proteina della tubulina (pura al >99%): cervello suino	Citoscheletro	T240
Proteina della tubulina (biotina): Citoscheletro del cervello suino		T333P
Proteina della tubulina (fluorescente HiLyte 647): cervello suino	Citoscheletro	TL670M Proteina
della tubulina (X-rodamina): cervello bovino	Citoscheletro	TL620M
VECTABOND® Reagente, vettore di adesione della sezione tissutale	Biolabs	SP-1800-7
VWR® Incubatrice di dimensioni personali, 120V, 50/60Hz, 0.6A	VWR	97025-630