Il presente protocollo descrive le linee guida passo-passo per le tecniche operative RNAi in P. americana.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Applicazioni dell'interferenza dell'RNA nello scarafaggio americano
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli scarafaggi, un parassita sanitario, sono specie essenziali negli studi sullo sviluppo degli insetti e metamorfici grazie alla loro facile alimentazione e alle caratteristiche emimetaboliche. Complessivamente con sequenze di genoma ben annotate, questi vantaggi hanno reso lo scarafaggio americano, Periplaneta americana, un importante modello di insetto emimetabolico. Limitato dalla carenza di strategia di knockout, l'efficace knockdown genico basato sull'interferenza dell'RNA (RNAi) diventa una tecnica indispensabile nella ricerca genica funzionale di P. americana. Il presente protocollo descrive le tecniche di funzionamento RNAi in P. americana. Il protocollo include (1) la selezione della P. americana nelle fasi di sviluppo appropriate, (2) la preparazione per l'impostazione dell'iniezione, (3) l'iniezione di dsRNA e (4) il rilevamento dell'efficienza del knockdown genico. RNAi è un potente strumento genetico inverso in P. americana. La maggior parte dei tessuti di P. americana sono sensibili al dsRNA extracellulare. La sua semplicità consente ai ricercatori di ottenere rapidamente fenotipi disfunzionali sotto una o più iniezioni di dsRNA, consentendo ai ricercatori di utilizzare meglio il P. americana per studi di sviluppo e metamorfici.
Introduzione
L'interferenza dell'RNA (RNAi), un meccanismo conservato evolutivamente, diventa gradualmente uno strumento genetico inverso essenziale per inibire l'espressione genica in molti organismi1, da quando Andrew Fire e Craig Mello2 hanno sviluppato la strategia di silenzio genico mediato dall'RNA a doppio filamento (dsRNA). Il dsRNA viene scisso in frammenti di 21-23 nucleotidi, piccoli RNA interferenti (siRNA), dall'enzima Dicer nelle cellule per attivare la via dell'RNAi. Quindi i siRNA vengono incorporati nel complesso di silenziamento indotto dall'RNA (RISC), che si accoppia all'mRNA bersaglio, provoca la scissione dell'm....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
La linea di P. americana è stata inizialmente fornita dal Dr. Huiling Hao. Questa specie è stata mantenuta consanguineità per 30 anni9.
1. Schiusa e alimentazione di P. americana
- Raccogliere oothecae fresche (immediatamente dopo la deposizione delle uova) di P. americana e incubare nell'incubatrice scura a 25 ° C e 60% di umidità per ~ 25 giorni. Quindi aumentare la temperatura e l'umidità a 30 ° C e 75% 3 giorni prima della schiusa.
- Utilizzare un setaccio con apertura di 4 mm per separare le ninfe tratteggiate dalle oothecae.
- Tenere le ninfe i....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La Figura 1 mostra un'iniezione riuscita. La siringa per microiniezione con un ago di microdiametro deve essere posizionata orizzontalmente sul booster (Figura 1A). L'ago viene inserito attraverso lo spazio tra due somiti addominali orizzontalmente contro l'epidermide (Figura 1B). Assicurarsi che il liquido entri nell'addome di P. americana . L'angolo troppo ripido dell'ago danneggerà gli organi interni (
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Questo rapporto descriveva una strategia metodologica passo-passo RNAi in P. americana; da notare, può anche essere applicato ad altri scarafaggi (Blattella germanica, per esempio) e molti altri insetti con piccoli cambiamenti. Tuttavia, l'efficienza di silenziamento genico dell'RNAi non è sempre abbastanza elevata, con un evidente svantaggio rispetto alla strategia di knockout genico13. Il seguente effetto residuo del livello genico può interferire con i fenotipi reali. Per gara.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 32070500, 31620103917, 31330072 e 31572325 a C.R., Sh.L.), dalla Natural Science Foundation della provincia del Guangdong (Grant No. 2021B1515020044 e 2020A1515011267 a C.R.), dal Dipartimento di Scienza e Tecnologia nella Provincia del Guangdong (Grant Nos. 2019B090905003 e 2019A0102006), dal Dipartimento di Scienza e Tecnologia di Guangzhou (Grant No. 202102020110), dal Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272 a Sh.L.).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 701 N 10 µ L Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Incubatore per iniezione |
| Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | Per la schiusa e l'alimentazione di scarafaggi | |
| Pompa per micro-iniezione | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Kit |
| di clonazione pTOPO-Blunt | Aidlab Biotechnology | CV16 | Per la clonazione genetica |
| quantitativa Sistemi di PCR in tempo reale | Bio-Rad | CFX Connect | Per l'analisi qRT-PCR |
| Sistema RNAi T7 RiboMAX Express | Promega | P1700 | Per la sintesi di dsRNA, che contiene una soluzione di Rnasi A (4 μ g/μ L), acetato di sodio, 3,0 M (pH 5,2), miscela enzimatica, T7 Express, acqua priva di nucleasi, tampone Express T7 2x, termociclatori DNasi privi di RNasi RQ1 |
| Bio-Rad | S1000 | per l'amplificazione del DNA |
Riferimenti
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi. PloS One. 7 (10), 47431(2012).
- Fire, A., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
