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Research Article
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Retraction Notice
The article Assisted Selection of Biomarkers by Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe) in Microbiome Data (10.3791/61715) has been retracted by the journal upon the authors' request due to a conflict regarding the data and methodology. View Retraction Notice
Il presente protocollo descrive lo sviluppo di una cassetta degli attrezzi open source a 5 scelte per i modelli di animali roditori, utilizzando Arduino e l'hardware correlato e una versatile cassetta degli attrezzi Matlab, incluso uno script opzionale per l'addestramento comportamentale automatizzato. Gli script sono personalizzabili e facilitano l'implementazione di diversi progetti di prova e test.
Il compito del tempo di reazione seriale a 5 scelte (5-CSRTT) è un test comportamentale spesso utilizzato per studiare l'attenzione visuospaziale e l'impulsività nei roditori. Il compito richiede agli animali di allocare l'attenzione su una serie orizzontale di cinque piccole aperture dotate di sorgenti luminose e, entro una finestra temporale limitata, di colpire al naso un'apertura del bersaglio illuminata per ottenere una ricompensa alimentare presso la rivista di cibo situata nella parete opposta della camera. Il compito considera misure di controllo comportamentale come l'accuratezza della risposta e i tempi di reazione e consente di dedurre attenzione e impulsività selettive. La difficoltà del compito può essere controllata modificando la durata dello stimolo e la progettazione del compito in generale. Gli apparecchi disponibili in commercio di solito consistono in una camera sperimentale e in un particolare software per specificare i parametri del compito, ma a causa di hardware e software fissi, pongono molte limitazioni ai cambiamenti nella progettazione sperimentale generale e ai requisiti specifici delle attività e alla relativa produzione di dati. Questo articolo spiega un'alternativa completamente personalizzabile basata su un microcontroller a scheda singola facile da usare e componenti elettrotecnici standard, uno script Arduino ad accesso aperto e un Toolbox Matlab per il controllo hardware e le specifiche delle attività comportamentali, rispettivamente. La cassetta degli attrezzi include una procedura di scala opzionale, che consente la formazione comportamentale automatizzata. La configurazione hardware completa, che può essere installata in camere personalizzate, e il software liberamente adattabile incoraggiano la progettazione di attività e camere non standardizzate. Vengono descritti il design del sistema e il codice open source per il controllo hardware e l'installazione sperimentale.
Il 5-CSRTT è un test comportamentale, spesso utilizzato nei roditori per studiare i processi visivi attenzionali e l'impulsività 1,2,3,4,5,6, come determinare il ruolo del sistema colinergico nell'attenzione e l'influenza degli inibitori della ricaptazione della noradrenalina sui comportamenti impulsivi 7 . L'apparato standard consente di osservare varie misure di controllo come l'accuratezza della risposta, i tempi di reazione, il comportamento impulsivo e compulsivo, la capacità motoria e la motivazione 1,2,3,4,5. Consiste in una serie orizzontale di cinque aperture dotate di LED, una rivista alimentare sulle pareti della camera che si oppone alle aperture e luci di casa 2,5. In un compito tipico, la luce della casa è illuminata e l'inizio di una sessione è contrassegnato dall'illuminazione della rivista alimentare, dove viene consegnato un pellet gratuito. Il corso di prova inizia quando l'animale colpisce il caricatore per recuperare il pellet1. Successivamente, la luce della rivista alimentare viene spenta e inizia l'intervallo inter-trial (ITI), durante il quale l'animale dovrebbe dirigere la sua attenzione verso le aperture. Una volta trascorso l'ITI, viene presentata un'illuminazione di stimolo in una delle aperture 1,2,5. Lo stimolo viene dato per una lunghezza specifica nota come durata dello stimolo (StD). L'animale può rispondere allo stimolo mentre viene presentato o durante una finestra di tempo limitata dopo che l'StD è finito, noto come presa limitata (LH). Per rispondere, l'animale deve colpire il naso all'apertura del bersaglio e, se fatto correttamente, una ricompensa viene rilasciata nella rivista alimentare 1,2,5. In caso contrario, qualsiasi risposta errata, così come qualsiasi risposta prima della presentazione dello stimolo (anticipatoria o prematura) o qualsiasi mancata risposta (omissione) si traduce in un timeout (TO), durante il quale la luce della casa viene spenta per una certa durata 1,2,5 (Figura 1). In generale, l'accuratezza dello stimolo discriminativo misura il funzionamento attentivo, mentre le risposte premature e perseveranti (risposte ripetute alle aperture dopo la presentazione dello stimolo) sono considerate misure del comportamento impulsivo e della compulsività, rispettivamente 1,4,5,6.

Figura 1: Possibili sequenze di prova di un tipico 5-CSRTT. Dopo l'intervallo intertriale, la luce di stimolo viene accesa per una durata specifica e quindi spenta durante l'intervallo di attesa limitata. Il topo può rispondere correttamente e ricevere una ricompensa o rispondere in modo errato e ottenere un timeout durante questo periodo. Se il ratto non risponde in tempo, la sua omissione si traduce in un timeout. Allo stesso modo, se risponde prima della presentazione dello stimolo luminoso, la sua risposta prematura si traduce in un timeout. Un'altra prova inizia dopo la raccolta della ricompensa o la fine del periodo di timeout. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Il 5-CSRTT è ampiamente utilizzato per la sua flessibilità: modificando i parametri del progetto di prova, è possibile indagare diverse sottocategorie di attenzione. Ad esempio, mentre l'animale dovrebbe dividere la sua attenzione attraverso le cinque diverse aperture (attenzione visuospaziale), l'uso di stimoli irrilevanti (ad esempio, stimoli uditivi) consente il test dell'attenzione selettiva o sostenuta 1,2,5,6. A tale scopo, la configurazione sperimentale può essere estesa includendo altoparlanti, che possono essere utilizzati come stimoli di distrazione o addirittura rinforzanti 1,2,5,6. Inoltre, il carico attentivo può essere modulato direttamente alterando la presentazione dello stimolo o randomizzando la durata ITI10. Il 5-CSRTT non è utilizzato solo nei roditori 3,7, ma è stato recentemente adattato per testare i primati non umani 1,7,8 e i pesci 7,9, mostrando ulteriormente la sua fattibilità. Una cassetta degli attrezzi 5-CSRTT completamente personalizzabile consente un facile adattamento del paradigma standard dei roditori ad altri modelli animali. Inoltre, la flessibilità di personalizzazione del toolbox 5-CSRTT incoraggia anche la ricerca utilizzando progetti di attività non standard.
Il toolbox 5-CSRTT completamente personalizzabile qui presentato contiene uno script Arduino per il controllo hardware, programmato in un ambiente di sviluppo integrato. Consiste anche in un toolbox Matlab (versione R2019b o più giovane) per il controllo degli esperimenti. Il seguente protocollo spiega come configurare la casella degli strumenti 5-CSRTT con il paradigma standard ampiamente utilizzato e mostra le configurazioni opzionali per i paradigmi non standard.
La procedura sperimentale in questo protocollo è stata eseguita seguendo le raccomandazioni della direttiva UE 2010/63 per il benessere degli animali da esperimento e in conformità con la legge sul benessere degli animali emessa dal governo federale della Germania ed è stata approvata dalle autorità locali. Poiché la ricerca richiedeva solo un addestramento comportamentale, nessun animale è stato eutanasia e tutti sono stati tenuti nell'allevamento dopo che la ricerca è stata condotta. La ricerca è stata condotta utilizzando dieci ratti maschi con cappuccio Lister (4 mesi di età all'inizio dell'allenamento comportamentale).
1. Stabulazione, allevamento e manipolazione degli animali
2. Preparazione dell'hardware e del software di controllo
3. Preparazione del software di controllo dell'esperimento
4. Configurazione dei parametri utilizzati nella casella degli strumenti 5-CSRTT
5. Esperimento comportamentale

Figura 2: L'apparato 5-CSRTT utilizzato per lo studio corrente. L'apparato funziona su un laptop dotato del toolbox 5-CSRTT, che fornisce uno script per il controllo del microcontrollore e di tutte le apparecchiature correlate e più script per il controllo dell'esperimento 5-CSRTT. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La cassetta degli attrezzi completamente personalizzabile è facile da usare e si basa su un microcontrollore a scheda singola e componenti elettrotecnici standard. La Figura 3 mostra un circuito semplificato e uno schema elettrico. L'intera apertura è composta da 5 LED come stimoli luminosi e cinque sensori a infrarossi per rilevare i colpi del naso. La luce della casa è composta da una striscia con otto LED e la rivista alimentare è composta da un'apertura con una porta a ribalta con un micro interruttore, un distributore di pellet motorizzato e una striscia con otto LED per l'illuminazione. Il circuito esemplifica anche le connessioni per componenti opzionali come l'altoparlante cicalino passivo per il feedback uditivo e un potenziometro digitale per la regolazione del volume. Per un elenco delle attrezzature utilizzate nello sviluppo di questa cassetta degli attrezzi, vedere Tabella dei materiali.

Figura 3: Circuito semplificato dell'hardware del microcontrollore. Per essere facilmente e rapidamente personalizzabile, l'apparecchiatura del microcontrollore è collegata tramite una breadboard. Dall'alto a sinistra verso il basso a sinistra, in senso orario: una scheda microcontrollore è collegata a uno schermo motore e un motore CC (che rappresenta il motore erogatore di pellet). A destra ci sono le strisce LED per le luci della casa e della rivista alimentare, e al centro ci sono tutti e cinque i LED bianchi per la luce di stimolo e le cinque coppie di sensori a infrarossi utilizzate nelle aperture. Sotto la scheda del microcontrollore c'è un semplice microinterruttore (che rappresenta l'interruttore utilizzato nella porta a ribalta del caricatore alimentare). Infine, un altoparlante cicalino passivo e un potenziometro digitale sono raffigurati al centro. Questa immagine è stata realizzata utilizzando il software open source Fritzing. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Collegamento e funzioni di tutti i componenti degli script di controllo dell'esperimento e diagramma semplificato della funzione "Codice". (A) Lo script "Utente" invia i suoi parametri alla funzione "Codice", che a sua volta si collega direttamente alla funzione "Scala", consentendogli di aggiornare qualsiasi parametro utilizzato nella funzione "Codice" mentre l'esperimento è in corso. La funzione "Code" invia quindi i suoi risultati alla funzione "DataProc" alla fine della sessione. (B) Prima di iniziare una sessione di esperimento, la funzione "Codice" controlla prima se si suppone che avvii il protocollo di assuefazione. In caso contrario, imposta i parametri in base alle definizioni scelte nello script "Utente". Prima dell'inizio di ogni prova, la funzione controlla quindi se è stato premuto il tasto ESC sulla tastiera. In caso contrario, continua con una nuova prova. In caso contrario, interrompe la sessione dell'esperimento e passa i dati raccolti alla funzione DataProc. Questo controllo critico prima di ogni inizio della prova consente al programma di fermarsi prima che venga raggiunto qualsiasi limite di tempo scelto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Le interazioni tra i diversi script di controllo dell'esperimento possono essere visualizzate nella Figura 4A. Lo script "User" include tutti i parametri che definiscono l'esperimento. Lì, le variabili che determinano i tempi dell'esperimento, il numero e la luminosità degli stimoli illuminati, la durata dell'ITI e simili possono essere scelte liberamente. La funzione Codice (Fascicolo Supplementare 5) include una descrizione dettagliata di un singolo studio e di tutti i possibili risultati, che viene ribadita durante l'esperimento, come mostrato nella Figura 4B. Inoltre, consiste in un protocollo per l'assuefazione dell'animale all'apparato. La funzione Codice controlla inoltre regolarmente le prestazioni dell'animale. Inoltre, la funzione Scala è opzionale. Le prestazioni del soggetto vengono confrontate con i criteri precedentemente impostati e i parametri desiderati vengono aggiornati automaticamente se le prestazioni dell'animale soddisfano questi criteri. La funzione Scala può anche considerare i risultati acquisiti dalla sessione del giorno precedente. Durante l'esecuzione dell'esperimento, un controllo delle prestazioni alla fine di una prova calcolerà l'accuratezza, le omissioni e il numero totale di risposte corrette delle prove completate e confronterà il risultato con i criteri desiderati per un aggiornamento del livello, come specificato nella funzione Scala. Infine, la funzione DataProc elabora tutti i dati raccolti e genera semplici grafici per un'analisi rapida. Al termine di una sessione, la casella degli strumenti salva automaticamente tutti i dati in un file *.mat e genera un file *.xlsx aggiuntivo con le informazioni essenziali dell'esperimento.

Figura 5: Esempio di diverse configurazioni di stimolo del toolbox 5-CSRTT. Il diagramma esemplifica le possibili combinazioni di stimoli target in dipendenza dalla configurazione scelta. Entrambe le configurazioni "tutte" e "singole" sono utilizzate nel paradigma standard (per l'assuefazione e l'esperimento comportamentale). Le configurazioni "vicina" e "spostata" mostrano configurazioni di stimolo non standard, consentendo l'uso di altri numeri di stimoli accesi, che possono anche avere un contrasto diverso rispetto allo stimolo target. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Il passaggio del protocollo 4.2.7.7 menziona una caratteristica opzionale: la modifica del raggruppamento delle aperture di destinazione. Il paradigma standard 5-CSRTT fa uso di un singolo stimolo target. Qui, esemplifichiamo come la cassetta degli attrezzi presentata consente modifiche del paradigma standard. La Figura 5 mostra alcune possibili combinazioni di gruppi su un totale di cinque aperture relative alla configurazione scelta. La configurazione "tutte" illumina tutte le aperture disponibili in modo che ogni apertura sia ora un'apertura target, che può essere utile nelle fasi di allenamento iniziale. La configurazione vicina assicura che il numero (scelto liberamente) di aperture target sia adiacente l'una all'altra. Le impostazioni possono essere specificate in modo tale che i vicini non siano identici all'apertura di destinazione, ma siano illuminati a un contrasto inferiore (o anche superiore). L'uso di aperture con diversi contrasti di illuminazione consente di testare nuovi paradigmi, come l'utilizzo di ricompense di diversa classificazione per i colpi di naso nelle aperture ad alto o basso contrasto. La Figura 5 mostra un esempio con tre aperture target con illuminazione identica. La singola configurazione viene in genere utilizzata nello standard 5-CSRTT, in cui viene illuminato solo un singolo target. Infine, la configurazione spostata estende la configurazione vicina. Sposta lo stimolo vicino verso l'ultima o la prima apertura nel caso in cui l'apertura target si trovi rispettivamente nella prima o nell'ultima posizione. Come nella configurazione vicina, la forza di illuminazione dei vicini può essere scelta liberamente, essendo la stessa o diversa dall'apertura del bersaglio. Inoltre, il numero di stimoli luminosi complessivi può essere scelto liberamente. La cassetta degli attrezzi calcola quindi automaticamente tutti gli stimoli possibili. Tuttavia, il parametro "Config.LED.NumHighLED" deve essere impostato su "1" per questa configurazione.
Seguendo il protocollo, l'addestramento dei ratti (N = 10) per il 5-CSRTT è stato eseguito secondo le fasi di addestramento presentate nella Tabella 1.
Tabella 1: Programma di formazione 5-CSRTT e criteri per passare al livello successivo. (A) L'intervallo tra le prove è stato mantenuto costante a 5 s in ogni livello di allenamento. (B) Durata dello stimolo per ogni livello di allenamento. (C) Finestra temporale Limited Hold (LH), il tempo massimo tollerato tra lo stimolo spento e qualsiasi risposta al naso. (D) Il numero totale di risposte corrette necessarie per superare il rispettivo livello di formazione. (E) La percentuale di accuratezza è calcolata come
. (F) La percentuale di errori di omissione è definita come
. Questo criterio non include risposte premature. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Le prestazioni dei ratti sono state confrontate con il numero di giorni di allenamento (sessioni) necessari per completare ciascun livello di allenamento indicato nella Tabella 1. Tutti gli animali hanno iniziato al livello di addestramento 1 con un StD e LH di 60 s ciascuno. Tuttavia, alcuni ratti (N = 5) hanno ricevuto un addestramento di assuefazione potenziato per testare alcune delle opzioni di stimolo aggiuntive riportate in precedenza, il che spiega la differenza nel numero di sessioni in cui i singoli animali sono rimasti nel livello di allenamento 1. Il completamento del livello è stato contrassegnato dal raggiungimento di un totale di 30 o più risposte corrette. StD e LH sono diminuiti durante i livelli successivi, mentre i criteri per avanzare al livello di allenamento successivo sono diventati più severi, aumentando la domanda di attenzione del compito 1,6.
La Tabella 2 mostra il foglio di calcolo *.xlsx generato automaticamente di un ratto di esempio durante una sessione. Il ratto ha iniziato con la configurazione specificata nel livello di allenamento 5. Dopo quattro prove, il ratto è avanzato al livello 6, considerando le prove eseguite nella sessione corrente più l'accuratezza raggiunta nella sessione precedente. Quante prove devono essere eseguite almeno nella sessione corrente per passare al livello di allenamento successivo è specificato nella variabile "Config.Experiment.MinNumTrials". Nella stessa sessione, il ratto è avanzato al livello di allenamento 7 dopo aver completato 66 prove nel livello 6 e aver raggiunto il requisito di > l'80% di precisione e < 20% di omissione. In totale, i ratti sono stati addestrati per 26 giorni utilizzando la configurazione dei livelli di allenamento come indicato nella Tabella 1. Il numero di sessioni trascorse per livello di allenamento è fornito nella Figura 6A. La linea nera mostra la media su tutti i soggetti e ogni linea colorata visualizza i dati di un ratto. Tutti i ratti hanno raggiunto l'ottavo livello entro 14-22 sessioni (Figura 6B). La figura 6C mostra le prestazioni medie dei soggetti per livello di allenamento e in tutti i giorni di formazione nell'apparato 5-CSRTT. La linea nera tratteggiata rappresenta la percentuale di precisione e la linea nera diritta rappresenta la percentuale di omissione. L'accuratezza è stata calcolata come il rapporto tra il numero di risposte corrette e il numero totale di risposte. Le omissioni sono state calcolate come il rapporto tra il numero di omissioni e il numero totale di processi (cioè la somma delle risposte corrette, delle risposte errate e delle omissioni). La linea grigia indica il numero totale medio di risposte corrette in tutte le prove in ogni livello. La Figura 6D mostra la precisione finale raggiunta da ciascun soggetto all'ottavo e ultimo livello di allenamento.
In media, i ratti hanno trascorso 5,9 sessioni (±1,03 SEM) per completare il livello 1, tra 1,5 (±0,17) e 3,5 (±0,5) sessioni per completare il livello da 2 a 6 e 1,7 (±0,16) sessioni per completare il livello 7 prima di raggiungere il livello finale 8. Come è evidente dalla Figura 6A, la varianza tra i soggetti era più significativa nei livelli iniziali (SD = 3,25 nel livello 1, 1,58 nel livello 2) e diminuiva nei livelli successivi (0,47 e 0,48 nei livelli 6 e 7, rispettivamente). Nel livello 4, quando la durata dello stimolo è stata ulteriormente ridotta, il numero medio di sessioni trascorse (2,6 ± 0,52) e la varianza tra i ratti (1,64) sono aumentati, con due ratti che hanno impiegato 5 e 6 giorni per concludere il livello.

Figura 6: Risultati dell'esperimento comportamentale con la cassetta degli attrezzi 5-CSRTT. (A) Il numero di sessioni eseguite a ciascun livello di allenamento. La linea nera raffigura il numero medio di sessioni di tutti i soggetti per ogni livello (media ± SEM) e le linee colorate rappresentano i dati dei singoli soggetti. (B) Il numero assoluto di sessioni necessarie per raggiungere il livello finale, per materia. (C) Misure medie delle prestazioni durante l'allenamento (media ± SEM). La linea nera tratteggiata raffigura l'accuratezza di tutti i soggetti in tutte le risposte date in tutte le sessioni per livello di allenamento e la linea nera mostra la percentuale di omissione corrispondente. La linea grigia rappresenta il numero medio assoluto di risposte corrette di tutti i soggetti a ciascun livello di allenamento. (D) Accuratezza per materia durante l'ottavo e ultimo livello di formazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 2: Dati raccolti da un ratto di esempio durante una sessione di allenamento. La colonna A visualizza il conteggio delle prove durante la sessione per quanto riguarda il livello di allenamento corrente, come mostrato nella colonna B. La colonna C visualizza la durata dell'ITI e la colonna D visualizza l'ora di inizio della prova. Le colonne da E a I mostrano il livello di luminosità per lo stimolo LED nelle aperture da 1 a 5, rispettivamente. Un livello di luminosità pari a 0 significa che lo stimolo era spento e un livello di luminosità di 0,2 significa che lo stimolo è stato attivato con il 20% della sua intensità massima. Le colonne J e K mostrano l'ora esatta in cui lo stimolo è stato acceso e spento, rispettivamente. La colonna L mostra l'esito dello studio: 0 significa "omissione", 1 significa "risposta corretta", 3 significa "risposta errata" (colpo del naso nell'apertura non target) e 4 significa "prematuro". La colonna M mostra quale apertura è stata colpita dal naso durante il processo, mentre la colonna N raffigura l'ora esatta del colpo al naso. Le colonne O, P e Q mostrano rispettivamente l'ora in cui il motore del distributore di pellet è stato acceso, il numero del motore corrispondente e il momento in cui il ratto ha aperto il distributore di pellet per ottenere la sua ricompensa. La colonna R visualizza l'ora di fine della versione di prova. Le colonne S, T, U, V e W mostrano rispettivamente il numero totale di risposte premature, timeout, push del pannello durante un ITI, il numero totale di risposte perseveranti e il runtime totale della sessione in minuti. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
File 1 supplementare: Script per il controllo hardware del software IDE (codice Arduino). Ciò include tutti i comandi per controllare l'hardware e i componenti elettrotecnici della cassetta degli attrezzi. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 2: Script per la funzione "Utente" nel software di controllo dell'esperimento. Questo include tutti i parametri che definiscono l'esperimento. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 3: Script per la funzione "Staircase" nel software di controllo dell'esperimento. Questo monitora le prestazioni del soggetto e lo confronta con i criteri precedentemente impostati. I parametri desiderati vengono aggiornati automaticamente se le prestazioni dell'animale soddisfano questi criteri. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 4: Script per la funzione "DataProc" nel software di controllo dell'esperimento. Questo elabora tutti i dati raccolti e genera semplici grafici per un'analisi rapida. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 5: Script per la funzione "Codice". Ciò include una descrizione dettagliata di un singolo studio e tutti i possibili risultati, che viene ribadita durante l'esperimento. Fare clic qui per scaricare questo file.
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Il presente protocollo descrive lo sviluppo di una cassetta degli attrezzi open source a 5 scelte per i modelli di animali roditori, utilizzando Arduino e l'hardware correlato e una versatile cassetta degli attrezzi Matlab, incluso uno script opzionale per l'addestramento comportamentale automatizzato. Gli script sono personalizzabili e facilitano l'implementazione di diversi progetti di prova e test.
Questo lavoro è supportato da DFG WE 5469/3-1.
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