Flusso di lavoro sperimentale e di analisi dei dati per la nanoindentazione della materia soffice

Summary

Il protocollo presenta un flusso di lavoro completo per esperimenti di nanoindentazione di materiali morbidi, inclusi idrogel e cellule. In primo luogo, i passaggi sperimentali per acquisire i dati della spettroscopia di forza sono dettagliati; quindi, l'analisi di tali dati è dettagliata attraverso un software Python open source di nuova concezione, che può essere scaricato gratuitamente da GitHub.

Abstract

La nanoindentazione si riferisce a una classe di tecniche sperimentali in cui una sonda di forza micrometrica viene utilizzata per quantificare le proprietà meccaniche locali di biomateriali morbidi e cellule. Questo approccio ha acquisito un ruolo centrale nei campi della meccanobiologia, della progettazione di biomateriali e dell'ingegneria tissutale, per ottenere una corretta caratterizzazione meccanica di materiali morbidi con una risoluzione paragonabile alla dimensione delle singole cellule (μm). La strategia più popolare per acquisire tali dati sperimentali è quella di impiegare un microscopio a forza atomica (AFM); mentre questo strumento offre una risoluzione senza precedenti in forza (fino a pN) e spazio (sub-nm), la sua usabilità è spesso limitata dalla sua complessità che impedisce misure di routine di indicatori integrali di proprietà meccaniche, come il modulo di Young (E). Una nuova generazione di nanoindentatori, come quelli basati sulla tecnologia di rilevamento delle fibre ottiche, ha recentemente guadagnato popolarità per la sua facilità di integrazione mentre consente di applicare forze sub-nN con risoluzione spaziale μm, quindi è adatto a sondare le proprietà meccaniche locali di idrogel e celle.

In questo protocollo, viene presentata una guida passo-passo che descrive in dettaglio la procedura sperimentale per acquisire dati di nanoindentazione su idrogel e cellule utilizzando un nanopenetratore di rilevamento in fibra ottica disponibile in commercio. Mentre alcuni passaggi sono specifici per lo strumento utilizzato nel presente documento, il protocollo proposto può essere preso come guida per altri dispositivi di nanoindentazione, a condizione che alcuni passaggi siano adattati secondo le linee guida del produttore. Inoltre, viene presentato un nuovo software Python open-source dotato di un'interfaccia utente grafica user-friendly per l'analisi dei dati di nanoindentazione, che consente lo screening di curve acquisite in modo errato, il filtraggio dei dati, il calcolo del punto di contatto attraverso diverse procedure numeriche, il calcolo convenzionale di E, nonché un'analisi più avanzata particolarmente adatta per i dati di nanoindentazione a singola cellula.

Introduction

Il ruolo fondamentale della meccanica in biologia è oggi stabilito ^1,2. Dai tessuti interi alle singole cellule, le proprietà meccaniche possono informare sullo stato fisiopatologico del biomateriale in esame ^3,4. Ad esempio, il tessuto mammario affetto da cancro è più rigido del tessuto sano, un concetto che è alla base del popolare test di palpazione⁵. In particolare, è stato recentemente dimostrato che la malattia da coronavirus 2019 (COVID-19) causata dalla sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) è sotto....

Protocol

1. Preparazione di substrati/celle per misure di nanoindentazione

1. Seguire i passaggi indicati nel protocollo supplementare per la preparazione di idrogel/cellule PAAm per esperimenti di nanoindentazione. La procedura è riepilogata nella Figura 2.
   NOTA: Gli idrogel PAAm sono stati scelti in quanto sono gli idrogel più comuni utilizzati nel campo della meccanobiologia. Tuttavia, il protocollo è ugualmente applicabile a qualsiasi tipo di idrogel²⁵ (vedi Discussione, modifiche del metodo).

2. Avvio del dispositivo, s....

Results

Seguendo il protocollo, si ottiene una serie di curve F-z . Il set di dati conterrà molto probabilmente curve valide e curve da scartare prima di continuare con l'analisi. In generale, le curve devono essere scartate se la loro forma è diversa da quella mostrata nella Figura 4A. La Figura 5AI mostra un set di dati di ~100 curve ottenute su un idrogel PAAm morbido di E 0,8 KPa³⁵ previsto caricato nella GUI di NanoPrepared.......

Discussion

Questo protocollo mostra come acquisire in modo robusto i dati di nanoindentazione della spettroscopia di forza utilizzando un nanopenetratore a ghiera disponibile in commercio sia su idrogel che su singole cellule. Inoltre, vengono fornite istruzioni per l'uso di un software open-source programmato in Python comprendente un preciso flusso di lavoro per l'analisi dei dati di nanoindentazione.

Passaggi critici nel protocollo
I seguenti passaggi sono stati identificati per es.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vetrini coprioggetti da 12 mm	VWR	631-1577P
Piastre di coltura trattate con cellule da 35 mm	Greiner CELLSTAR	627160
Acrilammide	Sigma-Aldrich	A4058
Acrilsilano	Alfa Aesar	L16400
Persolfato di ammonio	Merk	7727-54-0
Bisacrilammide	Merk	110-26-9
Chiaro nanoindenter	Optics 11 Life		nessun numero di catalogo
Etanolo			generale
Siero fetale bovino	Gibco	16140071
DMEM ad alto glucosio	Gibco	11995065
Isopropanolo			generale
Kimwipe	Kimberly Clark	21905-026
Vetrini per microscopio	VWR	631-1550P
Sistema MilliQ	Merk Millipore	ZR0Q008WW
OP1550 Interferometro	Ottica11 Vita		senza numero di catalogo
Ottica 11 Sonda di vita (k = 0,02-0,005 N/m, R = 3-3,5 um)	Ottica 11 Vita		senza numero di catalogo
Ottica 11 Sonda di vita (k = 0,46-0,5 N/m, R = 50-55 um)	Ottica 11 Vita		senza numero di catalogo
Penicillina/Streptomicina	Gibco	15140122
RainX repellente alla pioggia	RainX	26012
Piastre di Petri standard (90 mm)	Thermo Scientific	101RTIRR
Tetrametiletilendiammina	Sigma-Aldrich	110-18-9
Essiccatore sottovuoto	Thermo Scientific	531-0250
Software
Software di acquisizione dati (v 3.4.1)	Optics 11 Life
GitHub Desktop (opzionale)	Microsoft
Python 3	Python Foundation
Studio Code (opzionale)	Microsoft