Il protocollo descrive una modifica del metodo rapido Golgi, che può essere adattato a qualsiasi parte del sistema nervoso, per la colorazione dei neuroni nell'ippocampo e nella corteccia prefrontale mediale del ratto.
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Articolo metodologico
Macchia rapida di Golgi per la visualizzazione della colonna vertebrale dendritica nell'ippocampo e nella corteccia prefrontale
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'impregnazione di Golgi, utilizzando il kit di colorazione Golgi con piccoli adattamenti, viene utilizzata per impregnare le spine dendritiche nell'ippocampo del ratto e nella corteccia prefrontale mediale. Questa tecnica è un netto miglioramento rispetto ai precedenti metodi di impregnazione di Golgi perché le sostanze chimiche premiscelate sono più sicure da usare, i neuroni sono costantemente ben impregnati, ci sono molti meno detriti di fondo e, per una data regione, ci sono deviazioni estremamente piccole nella densità della colonna vertebrale tra gli esperimenti. Inoltre, i cervelli possono essere accumulati dopo un certo punto e mantenuti congelati fino a un'ulteriore elaborazione. Usando questo metodo qualsiasi regione del cervello di interesse può essere studiata. Una volta macchiata e la copertura scivolata, la densità della colonna vertebrale dendritica viene determinata contando il numero di spine per una lunghezza di dendrite ed espressa come densità della colonna vertebrale per dendrite da 10 μm.
Introduzione
Il metodo di utilizzo del dicromato di potassio e del nitrato d'argento per etichettare i neuroni è stato descritto per la prima volta da Camillo Golgi 1,2 e successivamente utilizzato da Santiago Ramon y Cajal per produrre un immenso corpo di lavoro che differenzia i sottotipi neuronali e gliali. Un libro pubblicato di recente con le sue illustrazioni è ora disponibile3. Seguendo gli studi di Ramon y Cajal, pubblicati più di 100 anni fa, è stata utilizzata pochissima impregnazione di Golgi. L'impregnazione di Golgi è un processo laborioso che consente la visualizzazione tridimensionale....
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Protocollo
Tutte le procedure sperimentali sono approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Sacro Cuore e sono conformi alla Guida NIH per la cura e l'uso degli animali.
1. Isolamento e infiltrazione del tessuto cerebrale
- Soluzioni premiscelate A e B del kit di colorazione Golgi 24 ore prima dell'uso e conservare in flaconi scuri e/o al buio. Effettuare circa 80 mL di soluzione A e B miscela che è sufficiente per cambiare la soluzione dopo 24 ore. Conservare in bottiglie ermetiche.
NOTA: La perfusione con soluzione salina o paraformaldeide non è necessaria. - Sacrific....
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Risultati
Utilizzando il metodo rapido di Golgi, le cellule sono costantemente ben impregnate in modo che ci siano molte cellule da analizzare. Questo è un netto miglioramento rispetto ai metodi precedenti in cui gli esperimenti dovevano essere raggruppati per avere dati sufficienti per l'analisi. Pertanto, più campioni possono essere elaborati contemporaneamente e i cervelli possono essere conservati congelati fino all'elaborazione. Esempi di cellule impregnate di Golgi nella regione CA1 dell'ippocampo sono mostrati a bassa e alt.......
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Discussione
Il presente protocollo descrive un metodo di impregnazione del Golgi che consente una rapida elaborazione simultanea di molte sezioni. È un miglioramento rispetto ai5 metodi più laboriosi descritti in precedenza e produce costantemente neuroni impregnati per l'analisi. Inoltre, c'è meno esposizione alle sostanze chimiche tossiche utilizzate nell'impregnazione di Golgi. La parte più impegnativa del processo è ottenere che le sezioni siano piatte sulle diapositive, il che richiede una notevole prati.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da Sacred Heart University Undergraduate Research InitiativeGrants.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vassoi per vetrini in cartone | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Vetrini coprioggetti 24 x 60mm | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| FD Rapid GolgiStain kit | FD Neurotechnologies | PK 401 | Stabile a RT al buio per mesi; Kit di colorazione Golgi |
| Spray congelante | Fisher Scientific | 23-022524 | |
| HISTO-CLEAR | Fisher Scientific | 50-899-90147 | agente di pulizia |
| NCSS Software | Kaysville, UT, USA | ||
| Permount | Fisher Scientific | SP-15-100 | mezzo di montaggio |
| Superfrost Plus Vetrini per microscopio | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tessuto Tek CTYO OCT Composto | Fisher Scientific | 14-373-65 | Utilizzato per montare cervelli su mandrino criostato |
Riferimenti
- Pannese, E. The Golgi Stain: invention, diffusion and impact on neurosciences. Journal of the History of the Neurosciences. 8 (2), 132-140 (1999).
- Bentivoglio, M., et al. The Original Histological Slides ....
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Ristampe e permessi
