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Articolo metodologico

Un approccio di segmentazione senza etichette per l'imaging intravitale del microambiente del tumore mammario

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DOI:

10.3791/63413

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24 maggio 2022

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1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Pathology, University of Wisconsin-Madison, 3Carbone Cancer Center, University of Wisconsin-Madison

In questo articolo

Sommario

Il metodo di imaging intravitale qui descritto utilizza la seconda generazione armonica di collagene e la fluorescenza endogena dal cofattore metabolico NAD(P)H per segmentare in modo non invasivo un microambiente tumorale non etichettato in compartimenti tumorali, stromali e vascolari per l'analisi approfondita delle immagini intravitali 4D.

Abstract

La capacità di visualizzare interazioni fisiologiche complesse e dinamiche tra numerosi tipi di cellule e la matrice extracellulare (ECM) all'interno di un microambiente tumorale vivo è un passo importante verso la comprensione dei meccanismi che regolano la progressione del tumore. Mentre questo può essere realizzato attraverso le attuali tecniche di imaging intravitale, rimane impegnativo a causa della natura eterogenea dei tessuti e della necessità di un contesto spaziale all'interno dell'osservazione sperimentale. A tal fine, abbiamo sviluppato un flusso di lavoro di imaging intravitale che accoppia l'imaging di seconda generazione armonica del collagene, la fluorescenza endogena dal cofattore metabolico NAD(P)H e la microscopia di imaging a vita di fluorescenza (FLIM) come mezzo per compartimentare in modo non invasivo il microambiente tumorale in domini di base del nido tumorale, dello stroma circostante o ECM e della vascolarizzazione. Questo protocollo non invasivo descrive in dettaglio il processo passo-passo che va dall'acquisizione di immagini time-lapse di modelli di tumore mammario all'analisi post-elaborazione e alla segmentazione delle immagini. Il vantaggio principale di questo flusso di lavoro è che sfrutta le firme metaboliche per contestualizzare il microambiente tumorale vivo che cambia dinamicamente senza l'uso di etichette fluorescenti esogene, rendendolo vantaggioso per i modelli di xenotrapianti derivati dal paziente umano (PDX) e per il futuro uso clinico in cui i fluorofori estrinseci non sono facilmente applicabili.

Introduzione

La matrice extracellulare (ECM) nel microambiente tumorale è nota per essere depositata dinamicamente e rimodellata da più tipi di cellule per facilitare ulteriormente la progressione della malattia 1,2,3. Queste alterazioni della matrice forniscono segnali sia meccanici che biologici che alterano il comportamento cellulare e spesso si traducono in un ciclo continuo di rimodellamento della matrice4. L'indagine sull'interazione dinamica e reciproca tra le cellule tumorali e la matrice extracellulare viene spesso condotta utilizzando colture tridimensionali (3D) in vitro o sistemi microfluidici. Mentre questi approcci bottom-up hanno dimostrato meccanismi di rimodellamento dell'ECM 5,6,7, aumento della proliferazione8, transizione da epiteliale a mesenchimale 9,10,11,12 e migrazione e invasione delle cellule tumorali 7,13,14,15,16 , il loro focus si è concentrato principalmente su alcuni tipi di cellule (ad esempio, cellule tumorali o fibroblasti) all'interno di una matrice 3D omogenea rispetto alla diversità e all'eterogeneità delle interazioni presenti all'interno di un tessuto fisiologico. Oltre ai sistemi in vitro, l'istologia tumorale ex vivo può anche fornire alcune informazioni su queste interazioni cellula-cellula e cellula-ECM17. L'immunoistochimica ha il vantaggio di poter analizzare più tipi di cellule rispetto alla composizione e all'architettura spazialmente eterogenee dell'ECM, ma gli endpoint statici del tessuto fisso non catturano la natura dinamica delle interazioni tra le cellule e il microambiente. L'imaging intravitale ha aperto la porta per interrogare interazioni diverse e dinamiche all'interno del contesto fisiologico del microambiente tumorale nativo.

Le capacità dell'imaging tumorale intravitale stanno rapidamente avanzando. I miglioramenti nella progettazione delle finestre di imaging e le tecniche chirurgiche per impiantare le finestre hanno consentito l'imaging longitudinale del tumore a lungo termine in una varietà di posizioni anatomiche (ad esempio, tumore primario, linfonodi, siti metastatici 18,19,20). Inoltre, la capacità della strumentazione ottica di visualizzare e raccogliere dati in più dimensioni (ad esempio, spettrale, intensità di fluorescenza spaziale e durata) e ad alta risoluzione e velocità (velocità video) sta diventando ampiamente accessibile. La tecnologia migliorata offre l'opportunità di esplorare rapidi cambiamenti nella segnalazione cellulare e nelle dinamiche fenotipiche all'interno di un ambiente fisiologico. Infine, l'espansione degli strumenti optogenetici e l'ampia gamma di costrutti fluorescenti genetici consentono l'etichettatura di specifici tipi di cellule per catturare la migrazione cellulare nel microambiente tumorale o il tracciamento del lignaggio cellulare durante lo sviluppo o la progressione della malattia21,22. L'uso di questi strumenti in combinazione con la tecnologia CRISPR / Cas9 offre ai ricercatori l'opportunità di generare modelli animali unici in modo tempestivo.

Mentre tutti questi progressi rendono l'imaging intravitale un metodo sempre più potente per esplorare le interazioni cellulari dinamiche e fisiologiche, c'è ancora un'importante necessità di sviluppare strategie che forniscano un contesto spaziale, temporale e strutturale a livello tissutale a queste interazioni biologiche. Attualmente, molti studi di imaging intravitale compensano la mancanza di punti di riferimento visivi come i vasi sanguigni iniettando coloranti fluorescenti nella vascolarizzazione o impiegando modelli murini che esprimono esogenamente proteine fluorescenti per delineare le caratteristiche fisiche. Coloranti iniettabili e substrati come dextrans fluorescenti sono ampiamente utilizzati per etichettare con successo la vascolarizzazione nelle collezioni intravitali19, 23, 24. Tuttavia, questo approccio non è privo di limitazioni. Per uno, richiede ulteriori manipolazioni del mouse e la sua utilità è limitata agli esperimenti a breve termine. Per gli studi longitudinali, il destrano fluorescente può essere problematico in quanto osserviamo l'accumulo di destrano nelle cellule fagocitiche o la diffusione nel tessuto circostante nel tempo25. L'incorporazione di proteine fluorescenti esogene nel modello murino è stata presentata come alternativa al dextrans fluorescente, ma presenta dei limiti propri. La disponibilità e la diversità dei fluorofori esogeni all'interno dei modelli murini sono ancora limitate e costose da creare. Inoltre, in modelli specifici, come i modelli PDX, le manipolazioni genetiche non sono desiderabili o possibili. È stato anche dimostrato che la presenza di proteine fluorescenti o bioluminescenti all'interno delle cellule sono riconosciute come estranee all'interno del topo, e all'interno di modelli murini immunocompetenti, questo riduce la quantità di metastasi dovute alla risposta del sistema immunitario dell'ospite26,27. Infine, le proteine fluorescenti esogene o i coloranti fluorescenti utilizzati per il contesto spaziale o per segmentare i dati successivi spesso occupano intervalli primi dello spettro luminoso che potrebbero altrimenti essere utilizzati per indagare le interazioni fisiologiche di interesse.

L'uso del segnale intrinseco dall'ECM o della fluorescenza endogena dalle cellule all'interno del tessuto rappresenta un potenziale mezzo universale privo di etichette per segmentare i dati intravitali per un'analisi cellulare e spaziale più approfondita. La seconda generazione armonica (SHG) è stata a lungo utilizzata per visualizzare l'ECM28. Con il successivo sviluppo di importanti strumenti per aiutare nella caratterizzazione dell'organizzazione delle fibre 29,30,31, è possibile caratterizzare il comportamento cellulare relativo alla struttura ECM locale. Inoltre, l'autofluorescenza del metabolita endogeno, NAD(P)H, fornisce un altro strumento privo di etichette per compartimentare il microambiente tumorale in vivo. Nad(P)H fluoresce brillantemente nelle cellule tumorali e può essere utilizzato per discriminare i confini del nido tumorale in crescita dal suo stroma circostante21,32. Infine, la vascolarizzazione è un'importante struttura fisiologica nel microambiente tumorale e il sito di interazioni chiave specifiche per tipo cellulare 33,34,35. L'eccitazione dei globuli rossi (RBC) o del plasma sanguigno è stata utilizzata per visualizzare la vascolarizzazione tumorale e utilizzando l'eccitazione a due o tre fotoni (2P; 3P) la misurazione delle velocità del flusso sanguigno ha dimostrato di essere possibile36. Tuttavia, mentre i vasi sanguigni più grandi sono facilmente identificabili dalle loro firme di fluorescenza endogena, l'identificazione di piccoli vasi sanguigni sottili, variabili e meno fluorescenti richiede più esperienza. Queste difficoltà intrinseche ostacolano la segmentazione ottimale dell'immagine. Fortunatamente, queste fonti di fluorescenza endogena (cioè globuli rossi e plasma sanguigno) possono anche essere misurate mediante imaging a fluorescenzaa vita 37, che capitalizza sulle proprietà fotofisiche uniche della vascolarizzazione e rappresenta un'utile aggiunta alla crescente cassetta degli attrezzi intravitale.

In questo protocollo, viene descritto un flusso di lavoro per la segmentazione dell'imaging intravitale quadridimensionale (4D) utilizzando esplicitamente segnali intrinseci come la fluorescenza endogena e l'SHG dall'acquisizione all'analisi. Questo protocollo è particolarmente pertinente per gli studi longitudinali attraverso una finestra di imaging mammario in cui la fluorescenza esogena potrebbe non essere pratica o possibile, come nel caso dei modelli PDX. I principi di segmentazione qui delineati, tuttavia, sono ampiamente applicabili agli utenti intravitali che studiano la biologia del tumore, lo sviluppo dei tessuti o anche la normale fisiologia dei tessuti. La suite di approcci di analisi riportata consentirà agli utenti di differenziare il comportamento cellulare tra regioni di configurazioni di fibre di collagene allineate o casuali, confrontare numeri o comportamenti di cellule residenti in regioni specifiche del microambiente tumorale e mappare la vascolarizzazione al microambiente tumorale utilizzando solo il segnale privo di etichette o intrinseco. Insieme, questi metodi creano un quadro operativo per massimizzare la profondità delle informazioni acquisite dall'imaging intravitale 4D della ghiandola mammaria, riducendo al minimo la necessità di ulteriori etichette esogene.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Wisconsin-Madison. Il benessere e la gestione del dolore in tutti gli esperimenti sugli animali sono fondamentali. Pertanto, viene fatto ogni sforzo per assicurarsi che l'animale sia a suo agio e ben curato in ogni fase della procedura.

1. Generazione della finestra di imaging mammario (MIW)

  1. Per costruire la finestra di imaging mammario, fabbricare un anello da 14 mm in acciaio inossidabile di grado chirurgico.
  2. Pulire il telaio della finestra lavorato utilizzando una soluzione calda di detergente detergente al 5%, risciacquare per 10 minuti sotto acqua deionizzata corrente (DI), immergere in etanolo al 100% per 10 minuti e quindi asciugare sotto una lampada di calore. Autoclave del telaio MIW essiccato e conservarlo per un uso successivo.
  3. Preparare il vetro di copertura MIW come segue: Immergere il vetro di copertura rotondo # 1,5 da 12 mm in etanolo al 100% per 10 minuti, asciugare sotto una lampada termica e quindi fissare al telaio MIW metallico utilizzando adesivo cianoacrilato. Curare l'adesivo durante la notte.
  4. Pulire il MIW assemblato dall'adesivo in eccesso utilizzando un tampone imbevuto di acetone e pulirlo immergendolo in etanolo al 70% per 10 minuti. Lasciare asciugare la finestra pulita. Preparare il MIW in anticipo e conservarlo in una capsula di Petri sterile prima dell'impianto chirurgico.

2. Impianto chirurgico del MIW

  1. Strumenti chirurgici in autoclave e sanificare le superfici con etanolo al 70% prima di iniziare l'intervento chirurgico per l'impianto della finestra.
  2. Eseguire un intervento chirurgico su un tavolo igienizzato utilizzando una coperta riscaldante coperta da un campo sterile. Impostare la coperta riscaldante in modo tale che la temperatura misurata sulla parte superiore del campo sterile sia di 40 °C.
  3. Utilizzare l'illuminazione fredda ausiliaria per aiutare a prevenire l'essiccazione dei tessuti. Utilizzare lenti d'ingrandimento per facilitare la procedura chirurgica. Indossare DPI costituiti da un cappotto da laboratorio sterile monouso, maniche chirurgiche, guanti, protezione per gli occhi e maschera facciale come raccomandato dalle migliori pratiche chirurgiche.
  4. Anestetizzare il mouse utilizzando una vaporizzatore per anestesia con un'impostazione isoflurano del 2,0% e una portata di ossigeno di 2,0 L/min. Somministrare analgesico (10 mg/kg di meloxicam) mediante iniezione sottocutanea.
    NOTA: Fornire dosi aggiuntive entro le prime 24 ore, preferibilmente ogni 8-12 ore per i primi 2 giorni dopo l'intervento chirurgico.
  5. Una volta anestetizzato (confermato da nessuna risposta al pizzicamento delle dita), applicare un gel idratante per gli occhi per prevenire l'asciugatura degli occhi. Utilizzare una crema depilatoria per rimuovere la pelliccia nel sito chirurgico (4° ghiandola mammaria inguinale) seguita da risciacquo con garza sterile imbevuta d'acqua.
  6. Preparare il sito chirurgico depilato per l'intervento chirurgico igienizzando la superficie della pelle con 3 scrub alternati di betadina ed etanolo.
  7. Per iniziare l'intervento chirurgico, sollevare delicatamente la pelle sopra la 4a ghiandola mammaria numero 4 usando una pinza. Una volta che la pelle viene allontanata dalla parete del corpo, rimuovere una sezione di ~ 1 mm dello strato dermico sulla punta della pinza con microforbici chirurgiche. Se si verifica sanguinamento, applicare una leggera pressione con una garza sterile fino a quando l'emorragia si ferma.
    NOTA: In generale, i tumori più grandi hanno un maggiore potenziale di sanguinamento rispetto ai tumori più piccoli o ai tessuti normali.
  8. Staccare la ghiandola mammaria dallo strato dermico con movimenti delicati della pinza all'apertura chirurgica per evitare di tagliare la ghiandola sottostante.
  9. Creare un'incisione di 10 mm e rilasciare la ghiandola mammaria dallo strato dermico alla periferia in modo che le suture possano essere posizionate senza penetrare nella ghiandola mammaria. Aggiungere PBS per coprire la ghiandola / tumore esposto e per prevenire l'essiccazione.
  10. Crea una sutura a corda di borsa lungo la periferia dell'apertura usando la sutura intrecciata di seta 5-0. Inserire un bordo del MIW in modo che lo strato dermico si innesti nella tacca ricevente del MIW.
  11. Allungare delicatamente l'epitelio sul lato opposto del MIW e spingere il MIW metallico in posizione in modo tale che lo strato dermico innesti completamente la tacca ricevente attorno all'intera circonferenza MIW. Stringere il cordone della borsa per attirare lo strato dermico nella tacca e legarlo per fissare completamente il MIW.
  12. Aggiungere un antibiotico topico allo strato dermico al MIW e monitorare continuamente il topo fino a quando non ha riacquistato una coscienza sufficiente per mantenere la reclinazione sternale. Ospitare il topo impiantato MIW separatamente su una lettiera morbida con un igloo posto nella gabbia e consentire al topo di recuperare per 48 ore prima dell'imaging.

3. Posizionamento e mantenimento del mouse sullo stadio del microscopio per l'imaging

  1. Impostare la camera di riscaldamento sul palco del microscopio. Utilizzare un sistema ad aria forzata impostato su 30 °C o qualsiasi altro sistema simile. Utilizzare un riscaldatore obiettivo per evitare la deriva nella messa a fuoco z. Consentire al sistema di raggiungere l'equilibrio per almeno 1 ora prima dell'imaging.
    NOTA: I topi anestetizzati non sono in grado di mantenere correttamente la loro temperatura corporea e, pertanto, è necessario disporre di un ambiente riscaldato per eventuali acquisizioni time-lapse . Il riscaldatore obiettivo aiuta a combattere gli effetti dell'espansione termica, un fenomeno che causa la deriva nella messa a fuoco z mentre la lente dell'obiettivo e il tessuto ripreso raggiungono l'equilibrio termico.
  2. Una volta che la camera di riscaldamento del microscopio si è stabilizzata a 30 °C, anestetizzare il mouse ricevente con impostazioni della macchina per anestesia del 2% di isoflurano e portata di ossigeno di 2 L/min.
  3. Dopo che il mouse è stato sedato (confermato dalla mancata risposta al pizzico della punta), pulire l'esterno del vetro MIW con un applicatore di cotone e un detergente per vetri, aggiungere unguento per gli occhi per evitare l'essiccazione e inserire un catetere per la vena della coda, se necessario.
  4. Per mantenere una corretta idratazione, somministrare un'iniezione iniziale di 0,5 ml di PBS per via sottocutanea o 100 μL attraverso il catetere della vena della coda. Ripetere ogni 2 ore per tutta la durata della sessione di imaging.
  5. Una volta che il mouse è stato preparato correttamente, impostare il microscopio per l'imaging. Per ridurre l'evaporazione durante le misurazioni time-lapse, utilizzare un gel a base d'acqua anziché acqua per il mezzo di immersione. Questo dovrebbe essere fatto prima di posizionare il mouse sul palco. Si prega di consultare la Tabella dei materiali per i dettagli dei componenti ottici.
  6. Posare il mouse sul palco del microscopio, montare il tubo isoflurano e premere il collare del MIW in un foro di ricezione di 14 mm nell'inserto del palco per stabilizzare le immagini. Mettere a fuoco il campo di imaging utilizzando gli oculari del microscopio e utilizzare l'illuminazione a campo luminoso per osservare la vascolarizzazione con il flusso sanguigno.
  7. Controllare la stabilità del campo visivo. Se sono presenti artefatti di movimento respiratorio, applicare una leggera compressione sul retro della ghiandola con un piccolo blocco di schiuma e un pezzo di nastro adesivo simile a una cintura. Dopo l'applicazione della compressione, verificare che il flusso sanguigno sia mantenuto in tutto il campo visivo.
  8. Regolare periodicamente i livelli di isoflurano con incrementi dello 0,25% durante la sessione di imaging per mantenere un livello adeguato di sedazione contando manualmente la respirazione animale.
  9. Mantenere una velocità di 36-40 respirazioni al minuto (rpm) per migliorare la longevità degli animali e l'imaging ottico. Tassi di respirazione più bassi possono far sì che il topo non sopravviva all'esperimento, mentre i tassi di respirazione superiori a 60 giri / min possono causare una scarsa sedazione, che può aumentare la respirazione e gli artefatti di movimento nei dati dell'immagine.

4. Configurazione per l'imaging intravitale 4D, basato sull'intensità, senza etichette del comportamento dinamico delle cellule

  1. Una volta che il mouse è sedato e posizionato saldamente sullo stadio del microscopio invertito, iniziare a localizzare le regioni di interesse.
  2. Utilizzando una sorgente luminosa diretta al MIW, utilizzare gli oculari del microscopio per identificare potenziali aree di indagine. Aggiungi e salva le posizioni x, y nel software per tornare a queste posizioni.
    NOTA: I dettagli fini del tumore non saranno facilmente visibili con questo tipo di illuminazione. L'obiettivo è semplicemente quello di identificare le regioni per ulteriori indagini. L'attenzione si concentra sulla visione della vascolarizzazione e del flusso sanguigno.
  3. Dopo aver salvato diverse posizioni nel software, visualizzare in anteprima i campi visivi scelti utilizzando l'eccitazione a 890 nm e il cubo del filtro FAD/SHG. Utilizzare un tempo di permanenza massimo di 4 μs con potenza inferiore e impostazione PMT elevata. L'obiettivo è quello di visualizzare in anteprima i campi visivi senza sovraesporre il tessuto a luce laser eccessiva.
  4. Una volta impostati i livelli di potenza appropriati, impostare gli z-stack. Osservare la comparsa di abbondanti fibre di collagene (SHG) a 20-50 μm sotto la superficie di vetro del MIW. Il collagene diventerà meno prevalente man mano che il microscopio si inserisce più in profondità nel tumore (Figura 1B). I vuoti nel SHG rivelano la posizione delle masse tumorali.
  5. Impostare la z-slice superiore, sotto lo strato di cellule solitarie dove le prime fibre di collagene appaiono a ~ 50-100 μm. Impostare la z-slice inferiore a ~ 250 μm, dove le fibre svaniscono e domina il segnale scarso. Ripeti questa operazione per tutte le posizioni x-y salvate.
  6. Una volta impostato l'intervallo z-stack, aumentare il tempo di permanenza (fino a 8 μs) e ottimizzare le impostazioni di potenza e del rilevatore. Ottimizza i livelli di potenza secondo necessità per eccitare il tessuto per ogni esperimento. L'utilizzo di potenze fino a 90 mW a 750 nm o 70 mW a 890 nm all'apertura posteriore dell'obiettivo rientra in un intervallo accettabile.
    NOTA: la profondità di imaging, la quantità di dispersione all'interno del tessuto, le caratteristiche oggettive e la sensibilità del rilevatore avranno un impatto significativo sulla quantità di energia necessaria per ottenere un'immagine.
  7. Regola gli intervalli di tempo in base agli obiettivi sperimentali. Inizia con intervalli di 10 minuti tra i punti di raccolta per la maggior parte dei filmati di migrazione intravitale.
  8. Anche se l'eccitazione 2P è delicata su cellule e tessuti, sii consapevole dei segni di fototossicità, come il blebbing cellulare o l'autofluorescenza in rapido aumento e l'eccessivo fotosbiancamento. Ridurre la potenza del laser o aumentare gli intervalli di timelapse come indicano le condizioni.

5. Imaging a fluorescenza (FLIM) di NAD(P)H

  1. Pur preservando le posizioni x-y dalle acquisizioni timelapse, impostare il microscopio per raccogliere uno stack FLIM. Inserire un filtro 440/80 in un portafiltro davanti al rilevatore GaAsP e impostare la tensione del rilevatore GaAsP su 800 nel software. Spegnere le luci della stanza quando i rilevatori sono accesi.
  2. Nel software, passare dall'imaging dell'intensità basato su galvanometro a una modalità di imaging FLIM.
  3. Allo scopo di identificare e mascherare la vascolarizzazione, impostare la risoluzione su 512 x 512 pixel. Per raccogliere informazioni metaboliche complementari, impostare la risoluzione su 256 x 256 pixel per aumentare la risoluzione temporale della firma a vita. Impostare il tempo di permanenza a 4 μs e sintonizzare il laser su 750 nm.
  4. Avviare la scansione di anteprima e iniziare a regolare la potenza del laser. Regolare la potenza del laser fino a quando la lettura per il discriminatore di frazione costante (CFD) è compresa tra 1 x 105 e 1 x 106. Non superare 1 x 106 in quanto ciò comporterà l'accumulo di fotoni e scarsi risultati complessivi.
  5. Una volta impostato il livello di potenza, impostare il tempo di integrazione tra 90 s e 120 s e avviare la raccolta FLIM. Acquisirà fotoni dal campo visivo per il tempo assegnato.
  6. Facoltativo: dopo che tutte le raccolte necessarie sono state effettuate e il mouse è stato rimosso dallo stadio, raccogliere una funzione di risposta dello strumento (IRF). Misurare l'IRF visualizzando la superficie dei cristalli di urea disponibili in commercio in una parabola con fondo di vetro con gli stessi parametri e la configurazione utilizzata per l'imaging del tessuto.
    NOTA: l'IRF tiene conto di eventuali ritardi o riflessioni dovuti alla configurazione elettronica o ottica. L'IRF è coinvolto in tutte le acquisizioni FLIM e il deconvolgimento dai dati può migliorare l'accuratezza delle curve di decadimento della fluorescenza calcolate. Detto questo, gli IRF calcolati possono spesso replicare ragionevolmente la qualità delle curve di decadimento della fluorescenza dall'IRF misurato. È buona norma misurare l'IRF fino a quando non sarà stato determinato che l'IRF calcolato produrrà adattamenti equivalenti delle curve di decadimento e approssima adeguatamente i risultati dell'IRF misurato.

6. Analisi delle immagini NADH Lifetime

  1. Aprire il software FLIM e importare l'immagine a vita NAD(P)H dal set di dati. Per ulteriori dettagli su come utilizzare correttamente il software, consultare i manuali sulla durata della fluorescenza (vedere la tabella dei materiali).
  2. Per iniziare, definire i parametri del modello nel software. Nella barra dei menu, fate clic su Opzioni (Options > Model). Selezionare le caselle seguenti: Impostazioni > Decadimento multievolutivo, Metodo di adattamento > MLE, Binning spaziale > quadrato, Soglia > picco e selezionare Correggi spostamento prima di calcolare l'immagine.
  3. Nella barra dei menu, fai clic su Colore > A1% dal menu a discesa. Sul lato destro della finestra, definirlo come un adattamento a tre componenti. Impostare la dimensione del cestino > 3.
  4. Regolare la soglia > ~10. Rivalutare l'accuratezza della soglia dopo che la matrice di decadimento è stata calcolata per la prima volta.
  5. Fissare il τ1 a 200 ps. Questo rappresenta la breve durata dei globuli rossi. Cerca di trovare il valore che meglio corrisponde a più punti nel vaso sanguigno più grande, che può essere visto nell'immagine di intensità. Fissare il τ2 a 1200 ps. Questo rappresenta la lunga durata dei globuli rossi.
    NOTA: i valori impostati sono solo il punto di partenza. I valori dovranno essere ottimizzati per far risaltare maggiormente la vascolarizzazione. Nella maggior parte dei casi, ma non sempre, questi valori diminuiranno.
  6. In Calcola nella barra dei menu selezionare Matrice decadimento. Ciò genererà un'iniziale A1% di immagini con la vascolarizzazione con valori elevati. Usa il cursore (mirino) per passare il mouse sopra la vascolarizzazione. Sistematicamente e uno alla volta, sposta (deseleziona la casella Correggi ) τ1 e τ2. Registrare questi valori in quanto aiuteranno a ottimizzare i parametri fissi.
    NOTA: L'obiettivo non è necessariamente quello di ottenere i valori più accurati nell'immagine, ma piuttosto di massimizzare la disparità tra la vascolarizzazione e il tessuto senza diminuire drasticamente l'area identificata come vascolare.
  7. Una volta identificati i parametri appropriati per τ1 e τ2, nella barra dei menu selezionare Calcola > elaborazione batch. Assicurarsi che la maggior parte delle impostazioni siano simili tra le z-slice.
  8. Assicurati di verificare che non ci sia un'impostazione grossolanamente diversa dalle altre. In tal caso, regolare prima il turno e riprovare. Se il problema persiste, eseguire il refit utilizzando nuovi parametri. Uno spostamento errato può essere una grande causa di rumore negli attacchi e può aumentare i valoridell'1% nelle regioni tumorali adiacenti.
  9. Nella scheda menu, salvare i file e quindi esportare I file A1%. Carica questi file in ImageJ per il mascheramento e la segmentazione.

7. Segmentazione dell'immagine della vascolarizzazione

  1. Aprire ImageJ e importare l'immagine A1% come immagine di testo. Ripeti questa operazione per tutte le immagini all'interno dello stack.
  2. Con tutte le immagini A1% aperte, selezionare Image > Stack > Z-Project. Utilizzate la proiezione di intensità massima e salvate le immagini. Vedere Dati supplementari 1 per un'immagine rappresentativa.
  3. Vai a Plugin > segmentazione. Selezionare il plug-in di segmentazione WEKA38 addestrabile.
  4. Una volta aperta la finestra WEKA, utilizzare le impostazioni predefinite e iniziare ad addestrare il software creando due classi e tracciando linee sopra la vascolarizzazione (regioni alte A1%) e non vascolarizzate (regioni A1% basse).
  5. Continuare ad aggiungere nuove tracce alle due classi fino a quando il software non identifica in modo coerente le regioni A1% elevate della vascolarizzazione, eliminando al contempo eventuali regioni più elevate di rumore di fondo. Vedere Modello supplementare per il modello di classificatore rappresentativo.
  6. Una volta prodotta l'immagine classificata, fare clic su Immagine > Tipo > 8 Bit. Soglie l'immagine e creare una maschera. Se l'immagine con soglia deve ancora essere ripulita ulteriormente, utilizzare la funzione Analizza particelle .
  7. Regolare le dimensioni e la circolarità fino a escludere le regioni più piccole e circolari dell'immagine con soglia. Si ottiene una maschera pulita con solo la vascolarizzazione e pochissimo sfondo.
  8. Fare clic su Modifica selezione > > Crea selezione. Trasferisci la selezione al ROI manager facendo clic su Analizza > Strumenti > ROI manager.
  9. Duplicare l'immagine classificata. Passare a Elabora > binario. Per espandere la maschera e definire la distanza dalla vascolarizzazione che verrà inclusa nella segmentazione dell'immagine, selezionare Dilate. Ripetere l'operazione fino a quando la maschera non si è espansa fino all'intervallo desiderato. Registrare questa regione di interesse (ROI) nel ROI manager.
    NOTA: L'obiettivo di questo passaggio è quantificare la quantità o il comportamento entro una certa vicinanza del vaso sanguigno (ad esempio, il numero di cellule presenti entro X μm dei vasi sanguigni). La quantità di dilatazione richiesta è interamente determinata dalla questione scientifica.
  10. Per quantificare il numero di celle all'interno delle regioni restrittive, selezionare la finestra (immagine/canale) di interesse. Questa può essere qualsiasi finestra che condivide lo stesso campo visivo della maschera vascolare. Applica entrambi i ROI utilizzando la funzione XOR dal menu a discesa.
    NOTA: Questa operazione misurerà gli elementi entro la distanza desiderata dalla vascolarizzazione, escludendo la vascolarizzazione stessa. Questo approccio ROI combinato può quindi essere utilizzato per misurare una moltitudine di parametri, come l'intensità, il numero di celle o la migrazione.

8. Segmentazione dell'immagine del nido tumorale

  1. Aprire l'immagine NADH da una scansione ad alta intensità di risoluzione o da una raccolta FLIM in ImageJ.
    NOTA: questa operazione può essere eseguita su singole z-slice, stack completi o applicata a z-projection di alcune slice.
  2. Vai a Plugin > segmentazione. Seleziona il plug-in di segmentazione WEKA addestrabile.
  3. Una volta aperta la finestra WEKA, utilizzare le impostazioni predefinite e iniziare a addestrare il software in due classi di regioni alte NADH e regioni basse NADH. Le regioni ad alto NADH avranno un modello molto distinguibile di cellule con nuclei e il software lo identificherà facilmente.
  4. Continua a passare avanti e indietro con la sovrapposizione per perfezionare l'algoritmo con un addestramento aggiuntivo fino a quando non riconosce tutte le regioni del tumore come determinato dall'occhio e dalla precedente conoscenza della morfologia del tumore. Questo è un processo iterativo.
  5. Una volta che l'algoritmo riconosce tutte le regioni del tumore, selezionare il pulsante Crea risultato . Questo produrrà una nuova immagine. Duplica questa immagine.
  6. Selezionare la prima immagine duplicata e convertirla in un'immagine a 8 bit selezionando Immagine > Tipo > 8 bit. Soglia di questa immagine per creare una maschera binaria. Quindi crea una selezione e trasferiscila al ROI manager. Questi ROI definiranno lo stroma.
  7. Selezionare la seconda immagine duplicata e convertirla in un'immagine a 8 bit. Invertire l'immagine selezionando Immagine > Modifica > Inverti e quindi soglie per creare una maschera binaria. Ancora una volta crea una selezione e trasferiscila al ROI manager. Questo ROI definirà il nido tumorale.

9. Segmentazione delle immagini per organizzazione o allineamento della fibra

  1. Per iniziare, apri le immagini SHG, prepara qualsiasi proiezione z e valuta la necessità di qualsiasi pre-elaborazione. Per ottenere buoni risultati, sono necessarie immagini di alta qualità con fibre distinguibili e basso rumore.
  2. Facoltativo: per la pre-elaborazione in ImageJ per aumentare il segnale-rumore (SNR) del canale SHG, sottrarre lo sfondo utilizzando una sottrazione a sfera rotante. Per la maggior parte delle applicazioni, utilizzare una sottrazione a sfera mobile compresa tra 20 pixel e 50 pixel. Quindi smussare l'immagine e salvarla.
  3. Aprire il plugin OrientationJ e impostare i parametri di elaborazione. Nella finestra OrientationJ, definite le dimensioni della finestra tensoriale locale. Per un'immagine 20x di questa densità di fibra, impostare 10 pixel su 15 pixel come punto di partenza.
  4. Selezionate Spline cubica (Cubic Spline) come modello sfumato e selezionate la casella Rilevamento colore (Color Survey). Definite il rilevamento del colore. Imposta sia la tonalità che la saturazione come coerenza, quindi definisci la luminosità come immagine originale, premi Esegui.
  5. Il file di output del plugin è RGB colormap. Regolare il valore della finestra del tensore locale fino a quando le regioni allineate, determinate dall'occhio, vengono evidenziate correttamente con tonalità blu e magenta.
  6. Una volta che l'immagine di output è soddisfacente, separare questa immagine RGB in 3 canali. Selezionare Immagine > Colore > Canale diviso.
  7. Per migliorare l'aspetto delle regioni allineate ai fini del mascheramento, utilizzare il calcolatore di immagini selezionando Elabora > Calcolatore immagini. Utilizzando questo operatore, sottrarre l'immagine verde dall'immagine blu. Per una maschera più restrittiva, sottrarre l'immagine verde dall'immagine rossa. Per le regioni casuali, sottrarre il canale blu dal canale verde.
  8. Soglie l'immagine risultante utilizzando l'algoritmo Moments . Nella maggior parte dei casi, questo non dovrebbe richiedere ulteriori aggiustamenti. Tuttavia, regolare se necessario. Questo produrrà un'immagine binaria.
  9. Una volta creata l'immagine binaria, riempite i fori selezionando Elabora > Binario > Riempi fori tra le fibre e arrotondate i contorni della maschera utilizzando un filtro mediano. Un filtro mediano di 10 è un buon punto di partenza, regolalo per adattarlo ai dati. Ispezionare manualmente la maschera per ottenere un accordo e rimuovere eventuali ROI errati.
  10. Una volta che la maschera è soddisfacente, create una selezione selezionando Modifica > Selezione > Crea selezione. Trasferisci questa selezione al ROI manager.

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Risultati

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Discussione

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano riconoscere le sovvenzioni NCI R01 CA216248, CA206458 e CA179556 per il finanziamento di questo lavoro. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Kevin Eliceiri e il suo gruppo di imaging per la loro esperienza tecnica nello sviluppo precoce del nostro programma intravitale. Ringraziamo anche il Dr. Ben Cox e altri membri dell'Eliceiri Fabrication Group presso il Morgridge Institute for Research per la loro progettazione tecnica essenziale durante le prime fasi del MIW. La dott.ssa Ellen Dobson ha assistito con conversazioni utili sullo strumento di segmentazione WEKA addestrabile ImageJ. Inoltre, vorremmo ringraziare la dott.ssa Melissa Skala e la dott.ssa Alexa Barres-Heaton per l'uso tempestivo del loro microscopio. Infine, vorremmo ringraziare la dott.ssa Brigitte Raabe, D.V.M, per tutte le discussioni premurose e i consigli sulla gestione e la cura del nostro mouse.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
#1.5 Vetro di copertura rotondo da 12 mmWarner Instruments# 64-0712Siringa da
1,0 ml per iniezione SQSiringa309659 BD
20x obiettivoZeiss421452-988
Ago 27G ad immersione in acqua per iniezione SQCovidien1188827012Ago
40x obiettivoNikonMRD77410
Sutura intrecciata in seta 5-0Sutura EthiconK870per impianto MIW
Gel per lacrime artificialiAkornNDC 59399-162-35Gel per gli occhi
Soluzione di betadine, 5%Fisher ScientificNC1558063Applicatore antisettico
punta in cotoneScientific23-400-101
Adesivo cianoacrilatoLoctite1365882destrano fluorescente con costruzione MIW
SigmaT1287-50mgmarcatura endovenosa delle pinze vascolari
Mckesson.comMiltex #18-782curvo in acciaio inossidabile, da 4 pollici,
Hamamatsu 
coperta riscaldanteCARA 72 termoforo  038056000729Camera
di riscaldamentoin temperatura costruita in casa
Manuale di vitafluorescente Becker e Hicklhttps://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
base per microscopio invertitoNikon
IsofluraneAkornNDC 59399-106-01Anestesia
Liqui-NoxFisher Scientific16-000-125Pulizia MIW
MeloxicamNorbrookNDC 55529-040-10Microtubo analgesico
Scientific Commodities INC.  Testa di scansione multifotone BB31695-PE/1
Testina di scansione multifotone e piattaforma di imagingBruker Ultima II
Filtro NADH FLIMChroma284994ET 440/80 m-2P
NairCVS339826crema depilatoria
Tokai HitSTRG-WELSX-SET
Filtro SHG/FADChroma320740ET450/ 40m-2P
Detergente per vetri scintillantiAmazon.comB00814ME24Detergente per vetri per impiantato MIW
SPC-150 LampadaBecker e Hickl
Lampada chirurgicaFAJB06XV1VQVZMagnetico LED a collo d'oca leggero
micro-forbici chirurgicheExcelta366inossidabile, 3 pollici
Triplo unguento antibioticoActavis PharmaNDC 0472-0179-34
Catetere TVBD30G personalizzato:Catetere 305106 per iniezione TV
Filtro a due fotoniChroma320282ET585 / 65m-2P
Laser a due fotoniCharmeleoncoerente Gel ad ultrasuoni laser multifotone sintonizzabile
ParkerPKR-03-02Gel per immersione in acqua
Urea cristalliSigmaU5128-5GOpzionale: FLIM IRF
ad immersione in acqua con Fisher tubo fotomoltiplicatore GaAsP selezionabile Riscaldatore obiettivo chirurgica antibiotico Ago

Riferimenti

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