Un approccio di segmentazione senza etichette per l'imaging intravitale del microambiente del tumore mammario

Brian M. Burkel; David R. Inman; María Virumbrales-Muñoz; Erica J. Hoffmann; Suzanne M. Ponik

doi:10.3791/63413

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Articolo metodologico

Un approccio di segmentazione senza etichette per l'imaging intravitale del microambiente del tumore mammario

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DOI:

10.3791/63413

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24 maggio 2022

Brian M. Burkel¹ , David R. Inman¹ , María Virumbrales-Muñoz¹^,² , Erica J. Hoffmann¹ , Suzanne M. Ponik¹^,³

¹Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, ²Department of Pathology, University of Wisconsin-Madison, ³Carbone Cancer Center, University of Wisconsin-Madison

In questo articolo

Sommario

Il metodo di imaging intravitale qui descritto utilizza la seconda generazione armonica di collagene e la fluorescenza endogena dal cofattore metabolico NAD(P)H per segmentare in modo non invasivo un microambiente tumorale non etichettato in compartimenti tumorali, stromali e vascolari per l'analisi approfondita delle immagini intravitali 4D.

Abstract

La capacità di visualizzare interazioni fisiologiche complesse e dinamiche tra numerosi tipi di cellule e la matrice extracellulare (ECM) all'interno di un microambiente tumorale vivo è un passo importante verso la comprensione dei meccanismi che regolano la progressione del tumore. Mentre questo può essere realizzato attraverso le attuali tecniche di imaging intravitale, rimane impegnativo a causa della natura eterogenea dei tessuti e della necessità di un contesto spaziale all'interno dell'osservazione sperimentale. A tal fine, abbiamo sviluppato un flusso di lavoro di imaging intravitale che accoppia l'imaging di seconda generazione armonica del collagene, la fluorescenza endogena dal cofattore metabolico NAD(P)H e la microscopia di imaging a vita di fluorescenza (FLIM) come mezzo per compartimentare in modo non invasivo il microambiente tumorale in domini di base del nido tumorale, dello stroma circostante o ECM e della vascolarizzazione. Questo protocollo non invasivo descrive in dettaglio il processo passo-passo che va dall'acquisizione di immagini time-lapse di modelli di tumore mammario all'analisi post-elaborazione e alla segmentazione delle immagini. Il vantaggio principale di questo flusso di lavoro è che sfrutta le firme metaboliche per contestualizzare il microambiente tumorale vivo che cambia dinamicamente senza l'uso di etichette fluorescenti esogene, rendendolo vantaggioso per i modelli di xenotrapianti derivati dal paziente umano (PDX) e per il futuro uso clinico in cui i fluorofori estrinseci non sono facilmente applicabili.

Introduzione

La matrice extracellulare (ECM) nel microambiente tumorale è nota per essere depositata dinamicamente e rimodellata da più tipi di cellule per facilitare ulteriormente la progressione della malattia ^1,2,3. Queste alterazioni della matrice forniscono segnali sia meccanici che biologici che alterano il comportamento cellulare e spesso si traducono in un ciclo continuo di rimodellamento della matrice⁴. L'indagine sull'interazione dinamica e reciproca tra le cellule tumorali e la matrice extracellulare viene spesso condotta utilizzando colture tridimen....