Questo protocollo presenta un riepilogo dettagliato delle strategie per inoculare le radici delle piante con microbi trasmessi dal suolo. Esemplificato per i funghi Verticillium longisporum e Verticillium dahliae, vengono descritti tre diversi sistemi di infezione delle radici. Vengono evidenziate le potenziali applicazioni e le possibili analisi a valle e vengono discussi vantaggi o svantaggi per ciascun sistema.
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Articolo metodologico
Strategie di inoculazione per infettare le radici delle piante con microrganismi trasmessi dal suolo
In questo articolo
Sommario
Abstract
La rizosfera ospita una comunità microbica altamente complessa in cui le radici delle piante sono costantemente sfidate. Le radici sono a stretto contatto con un'ampia varietà di microrganismi, ma gli studi sulle interazioni trasmesse dal suolo sono ancora indietro rispetto a quelli eseguiti su organi fuori terra. Sebbene alcune strategie di inoculazione per infettare piante modello con patogeni radicali modello siano descritte in letteratura, rimane difficile ottenere una panoramica metodologica completa. Per affrontare questo problema, vengono descritti con precisione tre diversi sistemi di inoculazione delle radici che possono essere applicati per ottenere informazioni sulla biologia delle interazioni radice-microbo. Per esempio, le specie di Verticillium (vale a dire, V. longisporum e V. dahliae) sono state impiegate come patogeni modello di invasione delle radici. Tuttavia, i metodi possono essere facilmente adattati ad altri microbi colonizzanti le radici, sia patogeni che benefici. Colonizzando lo xilema vegetale, i funghi vascolari trasmessi dal suolo come il Verticillium spp. esibiscono uno stile di vita unico. Dopo l'invasione delle radici, si diffondono attraverso i vasi xilemici acropetalmente, raggiungono il germoglio e suscitano sintomi di malattia. Tre specie vegetali rappresentative sono state scelte come ospiti modello: Arabidopsis thaliana, colza economicamente importante (Brassica napus) e pomodoro (Solanum lycopersicum). Vengono forniti protocolli passo-passo. Vengono mostrati risultati rappresentativi di saggi di patogenicità, analisi trascrizionali di geni marcatori e conferme indipendenti da parte di costrutti reporter. Inoltre, i vantaggi e gli svantaggi di ciascun sistema di inoculazione sono discussi in modo approfondito. Questi protocolli collaudati possono aiutare a fornire approcci per domande di ricerca sulle interazioni radice-microbo. Sapere come le piante affrontano i microbi nel terreno è fondamentale per sviluppare nuove strategie per migliorare l'agricoltura.
Introduzione
I terreni naturali sono abitati da un numero sorprendente di microbi che possono essere neutri, dannosi o benefici per le piante1. Molti agenti patogeni delle piante sono trasmessi dal suolo, circondano le radici e attaccano l'organo sotterraneo. Questi microrganismi appartengono a un'ampia varietà di cladi: funghi, oomiceti, batteri, nematodi, insetti e alcuni virus 1,2. Una volta che le condizioni ambientali favoriscono l'infezione, le piante sensibili si ammaleranno e le rese delle colture diminuiranno. Gli effetti dei cambiamenti climatici, come il riscaldamento globale e gli estrem....
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Protocollo
1. Mezzi per colture fungine e sistemi di inoculazione vegetale
- Brodo di destrosio di patate liquide (PDB): preparare 21 g/L di PDB in acqua ultrapura in un matraccio termostabile.
- Brodo liquido di destrosio Czapek (CDB): Preparare 42 g/L CDB in acqua ultrapura in un matraccio termostabile.
- Mezzo per il sistema di inoculazione della capsula di Petri: preparare un pallone termostabile con 1,5 g/L di Murashige e Skoog medium (MS) e 8 g/L di agar in acqua ultrapura.
NOTA: Evitare lo zucchero in questo mezzo in quanto porterà a un'eccessiva crescita fungina dopo l'inoculazione. - Mezzo per il sistema di inoculazion....
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Risultati
Seguendo il protocollo, le piante sono state coltivate e inoculate con V. longisporum (ceppo Vl4325) o V. dahliae (isolato JR218). Vari scenari sono stati progettati per dimostrare l'efficacia e per evidenziare alcune capacità dei protocolli dati. Vengono mostrati i risultati rappresentativi.
L'induzione espressionale di geni coinvolti nella biosintesi antimicrobica indol-glucosinolato (IG) è un indicatore affidabile pe.......
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Discussione
A causa delle enormi perdite di resa causate dai fitopatogeni trasmessi dal suolo1, è necessario un miglioramento delle strategie agricole o delle varietà di colture. La limitata comprensione della patogenesi delle malattie trasmesse dal suolo ostacola lo sviluppo di piante più resistenti. È necessario esplorare i meccanismi patologici sottostanti, per i quali è necessaria una solida piattaforma metodologica. Le procedure di inoculazione riportate hanno dimostrato che gli eventi multifattoriali ne.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono Tim Iven e Jaqueline Komorek per il lavoro precedente su questi metodi, il gruppo di Wolfgang Dröge-Laser (Dipartimento di Biologia Farmaceutica, Università di Würzburg, Germania) per aver fornito le attrezzature e le risorse necessarie per questo lavoro, e Wolfgang Dröge-Laser e Philipp Kreisz (entrambi Università di Würzburg) per la correzione critica del manoscritto. Questo studio è stato sostenuto dalla "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG, DR273/15-1,2).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agar (Gelrite) | Carl Roth | Nr. 0039 | tutti i sistemi descritti richiedono Gelrite |
| Arabidopsis thaliana wild-type | NASC stock | Col-0 (N1092) | |
| Autoclave | Systec | VE-100 | |
| BlattFlaeche | Datinf GmbH | BlattFlaeche | software per determinare le aree fogliari |
| Brassica napus wild-type | vedi Floerl et al., 2008 | colza a ciclo rapido | ACaacc |
| Cefotaxime sodico | Duchefa | C0111 | |
| Chicanery matraccio 500 mL | Duran Group / neoLab | E-1090 | Erlenmeyer pallone con quattro deflettori |
| Provette di raccolta 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | 114 x 28 mm |
| Brodo di destrosio Czapek medio | Duchefa | C1714 | |
| Fotocamera digitale | Nikon | D3100 18-55 VR | |
| Essiccatore (essiccatore ) | Duran Group | 200 DN, 5,8 L | Guarnizione con coperchio per trattenere il cloro gassoso |
| Microscopio a fluorescenza | Leica | Leica TCS SP5 II | |
| HCl | Carl Roth | P074.3 | |
| KNO3 | Carl Roth | P021.1 | ≥ 99 % |
| KOH | Carl Roth | 6751 | |
| Leukopor | BSN medical GmbH | 2454-00 AP | nastro non tessuto 2,5 cm x 9,2 m |
| MES (acido 2-(N-morfolino)etansolfonico) | Carl Roth | 4256.2 | Pufferan ≥ 99 % |
| MgSO4 | Carl Roth | T888.1 | Magnesiosolfato-eptaidrato |
| Murashige e Skoog medium (MS) | Duchefa | M0222 | MS comprese le vitamine |
| NaClO | Carl Roth | 9062.1 | |
| Camere di crescita Percival | CLF Plant Climatics GmbH | AR-66L2 | |
| Petri-plates | Sarstedt | 82.1473.001 | dimensioni & Oslash; xH: 92 & volte; Bicchieri di plastica da 16 mm |
| (500 mL, trasparente) | Pro-pac, insalatiera | 5070 | dimensioni: 108 &volte; 81 &volte; 102 mm |
| Filtro in cellulosa pieghettata | Hartenstein | FF12 | livello di ritenzione delle particelle 8– 12 μ m |
| poly klima camera di crescita | poly klima GmbH | PK 520 WLED | |
| Brodo di destrosio di patate medio | SIGMA Aldrich | P6685 | per microbiologia |
| Vasi | Pö ppelmann GmbH | TO 7 D o TO 9,5 D | Ø 7 cm risp. Ø 9,5 cm |
| PromMYB51::YFP | see Poncini et al., 2017 | MYB51 reporter line | YFP (i.e. 3xmVenus con NLS) |
| Provette di reazione 2 mL | Sarstedt | 72.695.400 | PCR Prestazioni testate |
| Agitatore rotativo (orbitale) | Edmund Bü hler | SM 30 C controllo | |
| Sabbia (sabbia per uccelli) | Pet Bistro, Mü ller Holding | 786157 | |
| Soil | Einheitserde spezial | SP Pikier (SP ED 63 P) | |
| Solanum lycopersicum wild-type | vedi Chavarro-Carrero et al., 2021 | Tipo: Moneymaker | |
| Camera di conteggio delle cellule Thoma | Marienfeld | 642710 | profondità 0,020 mm; 0,0025 mm2 |
| Acqua ultrapura (Milli-Q acqua purificata) | MERK | IQ 7003/7005 | acqua ottenuta dopo purificazione |
| Verticillium dahliae | vedi Reusche et al., 2014 | isolato JR2 | |
| Verticillium longisporumZeise | e von Tiedemann, 2002 | ceppo Vl43 |
Riferimenti
- Mendes, R., Garbeva, P., Raaijmakers, J. M. The rhizosphere microbiome: significance of plant beneficial, plant pathogenic, and human pathogenic microorganisms. FEMS Microbiology Review. 37 (5), 634-663 (2013).
- Yadeta, K. A., Thomma, B. P. H. J.
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Ristampe e permessi
