Strategie di inoculazione per infettare le radici delle piante con microrganismi trasmessi dal suolo

I terreni naturali sono abitati da un numero sorprendente di microbi che possono essere neutri, dannosi o benefici per le piante¹. Molti agenti patogeni delle piante sono trasmessi dal suolo, circondano le radici e attaccano l'organo sotterraneo. Questi microrganismi appartengono a un'ampia varietà di cladi: funghi, oomiceti, batteri, nematodi, insetti e alcuni virus ^1,2. Una volta che le condizioni ambientali favoriscono l'infezione, le piante sensibili si ammaleranno e le rese delle colture diminuiranno. Gli effetti dei cambiamenti climatici, come il riscaldamento globale e gli estremi meteorologici, aumenteranno la percentuale di patogeni vegetali trasmessi dal suolo³. Pertanto, diventerà sempre più importante studiare questi microbi distruttivi e il loro impatto sulla produzione di alimenti e mangimi, ma anche sugli ecosistemi naturali. Inoltre, ci sono mutualisti microbici nel terreno che interagiscono strettamente con le radici e promuovono la crescita, lo sviluppo e l'immunità delle piante. Di fronte agli agenti patogeni, le piante possono reclutare attivamente avversari specifici nella rizosfera che possono supportare la sopravvivenza dell'ospite sopprimendo i patogeni 4,5,6,7. Tuttavia, i dettagli meccanicistici e i percorsi coinvolti nelle interazioni benefiche radice-microbo sono spesso ancora sconosciuti⁶.

È quindi essenziale espandere la comprensione generale delle interazioni radice-microbo. Sono necessari metodi affidabili per inoculare radici con microrganismi trasmessi dal suolo per eseguire studi modello e trasferire i risultati alle applicazioni agricole. Le interazioni benefiche nel suolo sono studiate, ad esempio, con Serendipita indica (precedentemente nota come Piriformospora indica), Rhizobium spp. che fissa l'azoto o funghi micorrizici, mentre noti patogeni vegetali trasmessi dal suolo includono Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp. e Verticillium spp.1. Gli ultimi due sono generi fungini che sono distribuiti a livello globale e causano malattie vascolari². Verticillium spp. (Ascomycota) può infettare centinaia di specie vegetali - in gran parte dicotiledoni, tra cui annuali erbacee, piante perenni legnose e molte piante coltivate ^2,8. Le Ife di Verticillium entrano nella radice e crescono sia intercellulari che intracellulari verso il cilindro centrale per colonizzare i vasi xilema ^2,9. In questi vasi, il fungo rimane per la maggior parte del suo ciclo vitale. Poiché la linfa dello xilema è povera di nutrienti e trasporta composti di difesa delle piante, il fungo deve adattarsi a questo ambiente unico. Ciò si ottiene con la secrezione di proteine correlate alla colonizzazione che consentono all'agente patogeno di sopravvivere nel suo ospite^10,11. Dopo aver raggiunto la vascolarizzazione radicale, il fungo può diffondersi all'interno dei vasi xilema acropetalmente al fogliame, il che porta alla colonizzazione sistemica dell'ospite ^9,12. A questo punto, la pianta è influenzata negativamente nella crescita ^9,10,13. Ad esempio, si verificano arresto della crescita e foglie gialle e senescenza prematura 13,14,15,16.

Un membro di questo genere è verticillium longisporum, che è altamente adattato agli ospiti brassicacei, come la colza agronomicamente importante, il cavolfiore e la pianta modello Arabidopsis thaliana¹². Diversi studi hanno combinato V. longisporum e A. thaliana per ottenere ampie informazioni sulle malattie vascolari trasmesse dal suolo e sulle conseguenti risposte di difesa delle radici 13,15,16,17. Semplici test di suscettibilità possono essere realizzati utilizzando il sistema modello V. longisporum / A. thaliana e risorse genetiche consolidate sono disponibili per entrambi gli organismi. Strettamente correlato a V. longisporum è l'agente patogeno Verticillium dahliae. Sebbene entrambe le specie fungine svolgano uno stile di vita vascolare e un processo di invasione simili, la loro efficienza di propagazione dalle radici alle foglie e i sintomi della malattia suscitati in A. thaliana sono diversi: mentre V. longisporum di solito induce la senescenza precoce, l'infezione da V. dahliae provoca l'appassimento¹⁸. Recentemente, un riassunto metodologico ha presentato diverse strategie di inoculazione radicale per infettare A. thaliana con V. longisporum o V. dahliae, assistendo nella pianificazione di configurazioni sperimentali¹⁹. Nel campo, V. longisporum causa occasionalmente danni significativi nella produzione di colza¹², mentre V. dahliae ha una gamma di ospiti molto ampia che comprende diverse specie coltivate, come vite, patate e pomodoro⁸. Ciò rende entrambi i patogeni modelli economicamente interessanti da studiare.

Pertanto, i seguenti protocolli utilizzano sia V. longisporum che V. dahliae come patogeni radicali modello per esemplificare possibili approcci per le inoculazioni radicali. Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), colza (Brassica napus) e pomodoro (Solanum lycopersicum) sono stati scelti come ospiti modello. Descrizioni dettagliate delle metodologie sono disponibili nel testo sottostante e nel video di accompagnamento. Vengono discussi vantaggi e svantaggi per ciascun sistema di inoculazione. Nel complesso, questa raccolta di protocolli può aiutare a identificare un metodo adatto per domande di ricerca specifiche nel contesto delle interazioni radice-microbo.

1. Mezzi per colture fungine e sistemi di inoculazione vegetale

1. Brodo di destrosio di patate liquide (PDB): preparare 21 g/L di PDB in acqua ultrapura in un matraccio termostabile.
2. Brodo liquido di destrosio Czapek (CDB): Preparare 42 g/L CDB in acqua ultrapura in un matraccio termostabile.
3. Mezzo per il sistema di inoculazione della capsula di Petri: preparare un pallone termostabile con 1,5 g/L di Murashige e Skoog medium (MS) e 8 g/L di agar in acqua ultrapura.
   NOTA: Evitare lo zucchero in questo mezzo in quanto porterà a un'eccessiva crescita fungina dopo l'inoculazione.
4. Mezzo per il sistema di inoculazione a base di bicchieri di plastica: preparare un matraccio termostabile con 4,4 g/L MS, 0,2 g/L MgSO₄, 1 g/L KNO₃, 0,5 g/L 2-(N-morfolino)etanosolfonico (MES) e 6,0 g/L di agar in acqua ultrapura e regolare il pH a 5,7 con 5 M KOH.
   NOTA: Evitare lo zucchero in questo mezzo in quanto porterà a un'eccessiva crescita fungina dopo l'inoculazione.
5. 1/4 MS medium: Preparare 1,2 g/L MS in acqua ultrapura.
6. Utilizzare l'autoclave per sterilizzare tutte le soluzioni di cui sopra. Mettere i palloni di vetro nel cestello, chiudere il coperchio e sterilizzare per 15 minuti a 121 °C e 98,9 kPa.

2. Sterilizzare la superficie dei semi delle piante

NOTA: Utilizzare sempre il protocollo sottostante per sterilizzare la superficie dei semi di Arabidopsis, colza e pomodoro prima della semina.

1. Trasferire i semi in un tubo di reazione da 2 ml. Posizionare il tubo in un essiccatore con una capacità interna di 5,8 L.
2. Generare gas di cloro nell'essiccatore aggiungendo 6 mL di acido cloridrico al 33% (HCl) in 100 ml di ipoclorito di sodio acquoso al 12% (NaClO).
3. Chiudere immediatamente il coperchio dell'essiccatore e incubare i semi per 3 ore nel gas.

3. Preparazione dell'inoculo con spore di Verticillium (conidi derivati asessuati)

NOTA: Coltivare V. dahliae (ceppo JR2) allo stesso modo di V. longisporum (ceppo Vl43)17,18,19. Assicurarsi che tutte le apparecchiature e i supporti siano privi di germi e che tutti i passaggi vengano eseguiti in una cappa a flusso laminare per mantenere l'inoculo axenico.

1. Riempire 150 mL di PDB liquido (fase 1.1) in un matraccio da 500 mL e integrare il mezzo con 500 mg/L di cefotaxime.
2. Aggiungere Verticillium conida dalla conservazione del glicerolo al supporto PDB. Chiudere il pallone con un tappo di schiuma sterile.
3. Incubare la coltura per 7-10 giorni in una scatola buia a temperatura ambiente (RT) sotto agitazione orizzontale continua (agitatore rotante; 60 giri / min). Ciò si traduce in piccole sfere micelie bianche.
4. Rimuovere ed eliminare il surnatante PDB con attenzione. La maggior parte dei miceli dovrebbe rimanere nel pallone.
5. Aggiungere 100 mL di CDB liquido (fase 1.2) sul micelio nel matraccio e integrare il mezzo con 500 mg/L di cefotaxima.
6. Incubare altri 4-5 giorni in una scatola scura a RT sotto scuotimento continuo e orizzontale (agitatore rotativo, 60 giri / min) per indurre la sporulazione. Il surnatante diventerà giallastro-grigiastro quando i conidi vengono rilasciati.
7. Filtrare una porzione (5-10 mL) del liquido contenente conidi attraverso una carta da filtro (livello di ritenzione delle particelle di 8-12 μm) in un tubo di raccolta sterile da 50 mL. Questo separa le spore dai miceli.
8. Determinare la concentrazione di spore utilizzando una camera di conteggio delle cellule e un microscopio. Diluire con mezzo 1/4 MS privo di germi in acqua ultrapura fino ad ottenere le concentrazioni di spore indicate di seguito.
   NOTA: Al microscopio, i conidi di V. longisporum sono per lo più disegnati a lungo e di dimensioni 7,1-8,8 μm, mentre i conidi V. dahliae sono più corti (3,5-5,5 μm) e piuttosto sferici²⁰.
9. Usa questi conidi appena raccolti come inoculo. Assicurarsi di condurre gli esperimenti sempre con conidi appena raccolti e non con scorte congelate, poiché il congelamento riduce significativamente il numero di spore vitali¹⁹.
10. Per la conservazione a lungo termine, congelare le spore come soluzione di spore ad alta concentrazione (circa 1 x 10⁸ spore/ml) in glicerolo al 25% a -80 °C (conservabile fino a 1 anno). Per i prossimi esperimenti, utilizzare questi stock di glicerolo per inoculare il mezzo PDB nel passaggio 3.2.

4. Un sistema di inoculazione sterile in vitro a base di piastre di Petri

NOTA: Per il sistema a capsula di Petri¹⁷, assicurarsi che tutte le apparecchiature e i supporti siano privi di germi e che tutti i passaggi vengano eseguiti in una cappa a flusso laminare.

1. Dopo l'autoclave, versare il mezzo (vedere il punto 1.3) nelle piastre di Petri.
2. Dopo l'indurimento del mezzo, reimballare le piastre di Petri in un sacchetto di plastica sterile e conservarle capovolta per una notte in frigorifero (4-10 °C). Un mezzo refrigerato aiuta a prevenire lo scorrimento del mezzo nei passaggi successivi.
3. Tagliare e rimuovere un canale di infezione e il terzo superiore del mezzo solidificato con un bisturi (Figura 1A). Evitare di ottenere liquido o aria sotto il mezzo agar durante il taglio; altrimenti, il mezzo scivolerà e chiuderà il canale di infezione.
4. Distribuire 50-100 semi di Arabidopsis sterilizzati in superficie con una punta di pipetta sterile sulla superficie superiore tagliata. Metti i semi nell'angolo in cui la superficie dell'agar tagliata entra in contatto con la parete della capsula di Petri in modo che le radici possano crescere tra il mezzo e la parete della capsula di Petri. Ciò faciliterà l'inoculazione in seguito.
5. Chiudere le piastre di Petri e sigillarle con nastro adesivo permeabile all'aria per consentire lo scambio di gas.
6. Dopo la stratificazione per 2 giorni nell'oscurità a 4 °C, posizionare le piastre verticalmente in un rack adatto e far crescere le piante a 22 °C ± 1 °C in condizioni di lunga giornata (16 h luce / 8 h buio) in una camera di crescita.
7. Quando la maggior parte delle radici raggiunge il canale di infezione (piantine di circa 9-11 giorni), adagiare le piastre orizzontalmente, aprirle e aggiungere 500 μL di Verticillium conidia appena raccolto con una concentrazione di 4 x 10⁵ spore/mL direttamente nel canale di infezione, assicurandosi che il liquido sia distribuito uniformemente nel canale.
8. Allo stesso modo, preparare piastre di controllo aggiungendo 500 μL di una soluzione simulata invece di spore (mezzo 1/4 MS privo di germi).
9. Incubare le piastre orizzontalmente per un paio di minuti fino a quando il liquido non si è immerso e non può fuoriuscire quando le piastre vengono nuovamente posizionate verticalmente. Quindi, chiudere il coperchio e sigillare le piastre con nastro adesivo permeabile all'aria.
10. Incubare le piastre verticalmente nella camera di crescita. Facoltativamente, coprire le parti della radice con scatole di carta nera per scurire le radici e i funghi trasmessi dal suolo (vedi¹⁹).
11. Eseguire le analisi nei punti temporali preferiti dopo l'inoculazione a seconda della domanda di ricerca (fare riferimento alle legende delle figure per i punti temporali esatti utilizzati qui). Di seguito sono riportati alcuni suggerimenti.
    1. Tagliare le foglie dalle radici e raccoglierle entrambe separatamente. Togliere le strisce di agar dalle piastre di Petri per accedere facilmente alle radici e tirarle fuori con cura dall'agar usando una pinza. Congelare immediatamente tutto il materiale vegetale in azoto liquido.
       1. Macinare i campioni in azoto liquido. Estrarre il DNA totale da 100 mg di materiale fogliare per determinare tramite una PCR quantitativa (qPCR) la quantità di DNA fungino rispetto al DNA vegetale (vedere¹⁹).
       2. Macinare i campioni in azoto liquido. Prendi 100 mg di materiale vegetale ed estrai l'RNA totale. Condurre la PCR quantitativa a trascrizione inversa (qRT-PCR) per determinare l'espressione dei geni delle piante (o dei geni fungini) durante l'infestazione (vedere¹⁹).
    2. Rimuovere con cura le radici dall'agar evitando lesioni ed esaminarle al microscopio fluorescente.
       1. Determinare l'induzione di geni marcatori in linee reporter vegetali (ad esempio, luciferasi, β-glucuronidasi o reporter fluorescenti 17,19,21).
       2. Visualizza la propagazione fungina alla radice utilizzando linee reporter fungine (ad esempio, V. longisporum che esprime costitutivamente la proteina fluorescente verde potenziata, Vl-sGFP⁹) o mediante tecniche di colorazione (ad esempio, attraverso 5-bromo-4-cloro-3-indossil-N-acetil-beta-d-glucosaminide (X-beta-D-Glc-Nac)¹⁸).

5. Un sistema di inoculazione sterile in vitro organizzato con bicchieri di plastica

NOTA: Come indicato nella prima descrizione di questa tecnica¹⁹, assicurarsi che tutte le apparecchiature e i fluidi siano privi di germi e che tutti i passaggi vengano eseguiti in una cappa a flusso laminare.

1. Utilizzare bicchieri di plastica trasparente con un volume totale di 500 ml e sterilizzarli in un bagno di etanolo al 70% -75% per almeno 20 minuti. Asciugare le tazze nella cappa a flusso laminare.
2. Versare il mezzo autoclavato (vedere punto 1.4) nei bicchieri di plastica. Facoltativamente, aggiungere cefotaxime (concentrazione finale di 50 mg/L) al mezzo autoclavato per evitare contaminazioni batteriche. Utilizzare 150 ml di mezzo per tazza per esperimenti con Arabidopsis o più medio (250-300 ml per tazza) per esperimenti con specie vegetali più grandi (colza, pomodoro).
3. Posizionare uno strato di plastica (sterilizzato prima incubando in etanolo al 70%-75% per 20 minuti) sul mezzo prima che si solidifichi (Figura 1B).
   NOTA: questo strato di plastica contiene quattro fori prefabbricati agli angoli per posizionare semi sterilizzati in superficie. Ciò consente ai semi di accedere al mezzo. Successivamente, questo strato separatore impedisce alle foglie di toccare il mezzo contenente funghi, in modo che i microbi non possano attaccare direttamente le foglie e debbano prendere il percorso radicale. Un altro foro è al centro, consentendo di tagliare il canale di infezione.
4. Quando il mezzo si è solidificato, tagliare l'agar con un bisturi attraverso il foro centrale prefabbricato ad una profondità di circa 1,5 cm. Rimuovere l'agar tagliato per creare un canale di infezione in cui le spore fungine possono essere aggiunte in seguito.
5. Grattare leggermente il mezzo agar con una punta di pipetta nei quattro fori più piccoli per interrompere la pelle solidificata (questo consente ai semi di assorbire l'acqua dal mezzo acquoso di agar). Posizionare i semi usando una punta di pipetta nei fori più piccoli.
6. Chiudere il bicchiere di plastica con un secondo bicchiere di plastica invertito e sigillare con nastro adesivo permeabile all'aria. Il nastro deve consentire lo scambio di gas.
7. Dopo la stratificazione per 3 giorni al buio a 4 °C, incubare i sistemi di tazze sotto 12 ore di luce / 12 ore di oscurità (Arabidopsis, colza) o 16 ore di luce / 8 ore di oscurità (pomodoro) in camere di crescita a una temperatura costante di 22 °C e 60% di umidità.
8. Seguire l'età raccomandata delle piante per l'inoculazione: 21 giorni per Arabidopsis; 5-7 giorni per la colza; 12 giorni per il pomodoro.
9. Inoculare le piantine con Verticillium aggiungendo 1 mL di soluzione di conidi (concentrazione raccomandata: 4 x 10⁵ spore/mL) nel canale di infezione. Per preparare i campioni di controllo, aggiungere 1 mL di soluzione simulata senza spore (mezzo 1/4 MS privo di germi) nel canale.
10. Eseguire le analisi nei punti temporali preferiti dopo l'inoculazione a seconda della domanda di ricerca (fare riferimento alle legende delle figure per i punti temporali esatti utilizzati qui). Di seguito sono riportati alcuni suggerimenti.
    1. Scatta fotografie delle piante con una fotocamera digitale dall'alto mantenendo la stessa distanza per ogni foto. Quantificare l'area fogliare (ad esempio, con ImageJ²² o BlattFlaeche^17,19; utilizzare la lunghezza delle tazze per impostare la scala) e confrontare i gruppi infetti e di controllo. Classificare lo sviluppo dei sintomi della malattia (ad esempio, foglie più piccole, più giallastre o necrotiche).
       NOTA: Se ci sono steli su Arabidopsis, rimuoverli per ottenere foto migliori delle rosette.
    2. Rimuovere le radici e definire la biomassa (peso fresco) dei germogli da campioni infetti e controllare i campioni mediante pesatura. Determinare il peso fresco relativo¹⁹.
    3. Raccogliere i campioni per le analisi molecolari come segue.
    4. Arabidopsis: Rimuovere gli steli se ce ne sono. Tagliare le rosette alla base dalle radici. Assicurati di escludere tutto il materiale radicale dal campione e raccogli rosette intere. Combinare 4-5 rosette di piante diverse in un unico campione e congelare il materiale fogliare in azoto liquido.
    5. Estrarre accuratamente le radici dal mezzo con una pinza, premere e tamponarle con un tovagliolo di carta per rimuovere i resti di agar e combinare 4-5 radici di piante diverse in un unico campione. Congelare immediatamente in azoto liquido.
    6. Colza / pomodoro: tagliare i segmenti del gambo dall'ipocotile (ad esempio, 1 cm di lunghezza; prendere sempre la stessa regione del gambo). Combinare il materiale di 4-5 piante in ogni campione e congelare in azoto liquido.
    7. Macinare i campioni in azoto liquido. Estrarre il DNA totale da 100 mg del materiale fogliare o dello stelo per determinare tramite qPCR la quantità di DNA fungino rispetto al DNA vegetale (vedere¹⁹).
    8. Macinare i campioni in azoto liquido, prelevare 100 mg di materiale vegetale ed estrarre l'RNA totale. Condurre la qRT-PCR per determinare l'espressione dei geni delle piante (o dei geni fungini) al momento dell'infestazione (vedere¹⁹).

6. Un sistema di inoculazione a base di suolo in vaso

1. Mescolare accuratamente il terreno e la sabbia in un rapporto volumetrico 3: 1 (terra: sabbia) per facilitare il lavaggio del substrato dalle radici. Versare il composto in un sacchetto di autoclave. Se la miscela è troppo secca, aggiungere una quantità appropriata di acqua e mescolarla nel substrato. Vapore a 80 °C per 20 minuti in autoclave per ridurre al minimo le contaminazioni microbiche.
   NOTA: Evitare il riscaldamento a oltre 80 °C, in quanto ciò potrebbe influire sui nutrienti organici del suolo.
2. Riempire i vasi con la miscela di terra e sabbia e trasferirli in vassoi. Aggiungere acqua nei vassoi a circa 1/3 dell'altezza di una pentola, in modo che la miscela di terra e sabbia venga completamente imbevuta d'acqua. Inoltre, spruzzare il substrato con un flacone spray per garantire condizioni di partenza bagnate.
3. Semina 3-4 semi in ogni vaso (Figura 1C) assicurandoti che i semi abbiano una distanza sufficiente l'uno dall'altro. Tenerli per 3 giorni al buio a 4 °C per la stratificazione per sincronizzare la germinazione.
   NOTA: Pre-coltivare un eccesso di piante, che consente una selezione di piante di dimensioni simili per gli esperimenti di inoculazione e riduce le deviazioni dovute alle differenze individuali.
4. Lasciare che le piantine crescano in condizioni di lunga giornata (16 h di luce / 8 h di buio; temperatura costante di 22 °C; 60% di umidità) con annaffiature regolari.
5. Seguire l'età raccomandata delle piante per l'inoculazione: 21 giorni per Arabidopsis, 7 giorni per la colza e 10 giorni per il pomodoro. Scegli piante di dimensioni simili per eseguire l'"inoculazione a immersione radicale"15,17,23,24. Prendi il terreno dai vasi e scava con cura le radici.
6. Lavare delicatamente solo le radici in un contenitore d'acqua e tenere le rosette fuori dall'acqua. Incubare le radici lavate per 60 minuti in una capsula di Petri contenente la soluzione di spore verticillium (concentrazione consigliata: 2 x 10⁶ spore/mL). Per il gruppo di controllo non infetto, incubare le radici per 60 minuti nella soluzione simulata senza spore (mezzo 1/4 MS privo di germi).
7. Preparare nuovi vasi con terreno umido e sterilizzato a vapore (80 °C per 20 min) senza sabbia. Usa una punta della pipetta per fare un buco al centro del terreno in ogni pentola.
8. Posizionare direttamente le radici nel foro (trasferire solo una pianta per vaso). Dopo aver inserito le radici, assicurarsi di riempire accuratamente i fori con il terreno. Evitare di premere il terreno, altrimenti il rinvaso può causare sintomi di stress come foglie viola.
9. Coltivare gruppi infetti e di controllo in condizioni di lunga giornata (16 ore di luce / 8 ore di buio; una temperatura costante di 22 °C; 60% di umidità) con irrigazione regolare.
10. Eseguire le analisi nei punti temporali preferiti dopo l'inoculazione a seconda della domanda di ricerca (fare riferimento alle legende delle figure per i punti temporali esatti utilizzati qui). Di seguito sono riportati alcuni suggerimenti.
    1. Scatta fotografie delle piante con una fotocamera digitale dall'alto, mantenendo la stessa distanza per ogni foto. Quantificare l'area fogliare (ad esempio, con ImageJ²² o BlattFlaeche^17,19; utilizzare il diametro dei vasi per impostare la scala) e confrontare i gruppi infetti e di controllo. Classificare lo sviluppo dei sintomi della malattia (ad esempio, foglie più piccole, più giallastre o necrotiche)¹³.
       NOTA: La rimozione degli steli di Arabidopsis facilita lo scatto di foto delle rosette.
    2. Rimuovere le radici e definire la biomassa (peso fresco) dei germogli da campioni infetti e controllare i campioni mediante pesatura. Determinare il peso fresco relativo¹⁹.
    3. In alternativa, misurare l'altezza della pianta o classificare la crescita fungina dai segmenti staminali per valutare la gravità della malattia¹³.
    4. Raccogliere campioni per analisi molecolari come segue.
    5. Arabidopsis: rimuovere gli steli. Tagliare le rosette alla corona della radice. Combina 4-5 rosette di piante diverse in un unico campione. Congelare il materiale fogliare in azoto liquido.
       NOTA: Nel caso delle radici, è difficile pulirle sufficientemente dal terreno senza riprogrammare l'espressione genica attraverso il lavaggio.
    6. Colza / pomodoro: tagliare i segmenti del gambo dall'ipocotile (ad esempio, 1 cm di lunghezza; prendere sempre la stessa regione del gambo). Combina il materiale di 4-5 piante in un campione e congelalo in azoto liquido.
    7. Macinare i campioni in azoto liquido. Estrarre il DNA totale da 100 mg di materiale fogliare o stelo per determinare tramite qPCR la quantità di DNA fungino rispetto al DNA vegetale (vedere¹⁹).
    8. Macinare i campioni in azoto liquido, prelevare 100 mg di materiale vegetale ed estrarre l'RNA totale. Condurre la qRT-PCR per determinare l'espressione dei geni delle piante (o dei geni fungini) al momento dell'infestazione (vedere¹⁹).

7. Analisi dei dati

1. Calcola la deviazione media e standard (± SD) in base alle repliche biologiche.
2. Calcolare i valori relativi dividendo tutti i risultati del gruppo infetto per il risultato del controllo. Visualizzare la media come, ad esempio, "relativa al finto" o "relativa al wild-type".
3. Determinare la significatività statistica tra i gruppi.

Figura 1: Compilazione dei tre sistemi di inoculazione e dei singoli passaggi nei protocolli. Queste figure illustrano i sistemi con l'impianto modello Arabidopsis thaliana. Per altre specie vegetali, i tempi devono essere regolati. Evidenziano le caselle arancioni, per le quali le analisi successive sono più raccomandate con il rispettivo sistema. (A) Per il sistema di inoculazione nelle piastre di Petri¹⁷, versare il mezzo e lasciarlo solidificare. Conservare i piatti in frigorifero per una notte. Quindi, tagliare e rimuovere il terzo superiore e il canale di infezione (IC) con un bisturi (le aree bianche nell'illustrazione sono state rimosse dall'agar, mentre le aree bluastre rappresentano l'agar). Posizionare i semi sulla superficie tagliata e chiudere le piastre di Petri. Dopo la stratificazione, posizionare le piastre verticalmente e lasciare che le piante crescano. Una volta che la maggior parte delle radici ha raggiunto il canale di infezione, aggiungere la soluzione di spore con una pipetta direttamente nel canale. Assicurarsi che la soluzione sia distribuita uniformemente. Chiudere le piastre di Petri e incubarle verticalmente in una camera di crescita. Gli approcci che possono seguire sono l'analisi espressionale con PCR quantitativa a trascrizione inversa (qRT-PCR), la microscopia con linee reporter e la quantificazione del DNA microbico. (B) Per il sistema di inoculazione in bicchieri di plastica¹⁹, versare il mezzo e trasferire lo strato di plastica separatore con i fori prefabbricati (quattro piccoli fori negli angoli per posizionare i semi e un grande foro al centro per il canale di infezione). Lascia che il mezzo si solidifichi. Tagliare e rimuovere il mezzo agar nel foro centrale con un bisturi per ottenere il canale di infezione (IC). Gratta il mezzo nei fori più piccoli e trasferisci i semi. Chiudere la tazza con una tazza rovesciata e sigillare con nastro impermeabile all'aria (simboleggiato in giallo). Lascia che le piante crescano. Per l'inoculazione, aggiungere la soluzione di spore con una pipetta direttamente nel canale di infezione. Chiudere il sistema e continuare la coltivazione nella camera di crescita. Gli approcci che possono seguire sono l'analisi espressionale con qRT-PCR, la quantificazione del DNA microbico e la determinazione del peso fresco, dell'area fogliare o di altre caratteristiche della malattia. (C) "Inoculazione a immersione radicale"15,17,23,24: per il sistema di inoculazione a base di suolo, riempire i vasi con una miscela di terra:sabbia. Trasferisci i semi e lascia crescere le piantine. Scava piante di dimensioni simili e lava le radici in acqua. Posizionare le radici lavate in una capsula di Petri tenendo la soluzione con le spore. Dopo l'incubazione, inserire singole piante in vasi con terra. Gli approcci che possono seguire sono l'analisi espressionale nelle foglie con qRT-PCR, la quantificazione del DNA microbico e la determinazione del peso fresco, dell'area fogliare o di altre caratteristiche della malattia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Seguendo il protocollo, le piante sono state coltivate e inoculate con V. longisporum (ceppo Vl4325) o V. dahliae (isolato JR218). Vari scenari sono stati progettati per dimostrare l'efficacia e per evidenziare alcune capacità dei protocolli dati. Vengono mostrati i risultati rappresentativi.

L'induzione espressionale di geni coinvolti nella biosintesi antimicrobica indol-glucosinolato (IG) è un indicatore affidabile per la valutazione di un'infezione da Verticillium 17,19,26. In Arabidopsis, MYB51 (proteina 51 del dominio MYB; AT1G18570) codifica per un fattore di trascrizione coinvolto nell'attivazione dei geni necessari per la biosintesi delle IG27. MYB51 può servire come gene marcatore che indica l'infestazione di successo in quanto è costantemente indotto nelle radici da V. longisporum26 o altri funghi trasmessi dal suolo come Phytophthora parasitica26 e Fusarium oxysporum21. Due giorni dopo l'inoculazione (2 dpi) nel sistema basato sulla capsula di Petri, l'induzione di MYB51 è stata visualizzata nelle radici di Arabidopsis. La linea di piante reporter PromMYB51::YFP21 ha rivelato un'attivazione del promotore e un'analisi qRT-PCR ha confermato una significativa induzione trascrizionale di questo gene (Figura 2A-B). Tali esperimenti mirano a determinare i cambiamenti espressivi nelle radici durante l'infezione.

Poiché le specie di Verticillium utilizzate in questo studio svolgono uno stile di vita vascolare e si diffondono dalla radice al germoglio attraverso i vasi xilema, la quantità di DNA fungino può essere determinata nelle foglie come parametro per il grado di propagazione fungina. L'arabidopsis è stata inoculata nella radice nel sistema in vitro in bicchieri di plastica e le rosette sono state raccolte 12 giorni dopo. Rispetto al valore di fondo rilevato nel controllo simulato, sono state trovate notevoli quantità di DNA fungino nelle foglie di piante infette (Figura 2C). Ciò dimostra che l'infezione è progredita con successo. Per ulteriori esami, la quantità di DNA fungino può essere quantificata in diversi genotipi vegetali per ottenere informazioni sulle risposte di difesa delle radici. Inoltre, le radici sono state raccolte in questo momento per testare l'induzione del gene marcatore tramite qRT-PCR. L'abbondanza di trascrizioni myB51 è stata significativamente arricchita (Figura 2D). Ciò dimostra che i test di suscettibilità e le analisi espressive possono essere facilmente eseguiti in parallelo con il sistema a tazza, il che sottolinea il grande vantaggio di questa procedura.

Per includere la prova che possono essere introdotte anche altre specie di piante modello, la colza è stata infettata da V. longisporum e il pomodoro con V. dahliae nel sistema in bicchieri di plastica. Il giorno 12 dopo l'inoculazione alle radici, la quantità di DNA fungino è stata quantificata in segmenti di stelo tagliati alla base delle piantine (Figura 2E-F). Il DNA fungino era rilevabile in entrambe le specie vegetali indicando la propagazione dei patogeni all'interno della pianta. Ancora una volta, diversi genotipi vegetali potrebbero essere testati per acquisire conoscenze sui meccanismi di difesa.

Se il microbo colonizzatore della radice di interesse non si diffonde dalle radici alle foglie, non è possibile quantificare la quantità di DNA microbico nelle foglie come parametro per la gravità della malattia. Un'altra opzione per misurare la gravità della malattia è la valutazione e l'estrapolazione dei sintomi presso l'ospite. Per esemplificare questo, Arabidopsis è stato inoculato con V. dahliae nel sistema basato sul suolo ed è stata valutata l'area delle foglie verdi (Figura 2G-H). Mentre le rosette delle piante finte trattate sembravano sane e verdi, le piante infette da agenti patogeni avevano una dimensione ridotta delle foglie e foglie giallastre o addirittura necrotiche. In questo modo, la suscettibilità di diversi genotipi vegetali può essere analizzata e confermata, ad esempio, quantificando il peso fresco.

Figura 2: Risultati rappresentativi ottenuti seguendo i protocolli. (A,B) Le radici di Arabidopsis sono state inoculate con V. longisporum nel sistema delle piastre di Petri. La linea reporter PromMYB51::YFP21 ha rivelato una forte attivazione del promotore MYB51 nelle radici infette rispetto al controllo simulato (microscopia a 2 dpi; barra di scala: 50 μm). L'induzione trascrizionale di MYB51 nelle radici wildtype (WT) è stata ulteriormente confermata con l'analisi qRT-PCR (2 dpi). I valori dei campioni infetti sono indicati in relazione ai campioni fittizi (impostati su 1) (n = 5; ± SD). (C) Colonizzazione sistemica attraverso V. longisporum: dopo aver inoculato le radici di Arabidopsis nel sistema a coppa, la quantità relativa di DNA fungino è stata determinata nelle foglie mediante PCR quantitativa (qPCR; 12 dpi). I valori dei campioni infetti sono indicati in relazione al livello di fondo nei campioni simulati (impostato su 1) (n = 3; ± SD). (D) Le radici infette e finte trattate con V. longisporum sono state raccolte dal sistema a tazza ed è stata eseguita l'analisi qRT-PCR. I valori dei campioni infetti sono indicati in relazione ai campioni fittizi (impostati su 1) (n = 3; ± SD). MYB51 è risultato essere indotto trascrizionalmente (12 dpi). (E) La colza è stata inoculata nel sistema a tazza con V. longisporum e la quantità relativa di DNA fungino è stata quantificata attraverso la qPCR nei segmenti dello stelo (12 dpi). I valori dei campioni infetti sono indicati in relazione al livello di fondo nei campioni simulati (impostato su 1) (n = 3; ± SD). (F) Il pomodoro è stato inoculato nel sistema a tazza con V. dahliae e la quantità relativa di DNA fungino è stata quantificata attraverso qPCR in segmenti di stelo (12 dpi). I valori dei campioni infetti sono indicati in relazione al livello di fondo nei campioni simulati (impostato su 1) (n = 5; ± SD). (G,H) Arabidopsis è stata inoculata con V. dahliae nel sistema a base di suolo e vengono mostrate immagini rappresentative di piante infette e finte trattate (21 dpi). L'area delle foglie verdi è stata esaminata. Rispetto al finto (impostato su 1), le piante infette avevano meno area di foglie verdi (n = 5; ± SD). (B-F,H) Per le coppie di primer vedi19; statistiche: t-test dello studente relativo al finto, * p≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.