Rilevamento di lacune post-replicative accumulo e riparazione nelle cellule umane utilizzando il test delle fibre di DNA

Summary

Qui descriviamo due modifiche del test della fibra di DNA per studiare le lacune del DNA a singolo filamento nella replicazione del DNA dopo l'induzione della lesione. Il test della fibra S1 consente il rilevamento di lacune post-replicative utilizzando l'endonucleasi S1 specifica per ssDNA, mentre il test di riempimento delle lacune consente la visualizzazione e la quantificazione della riparazione del gap.

Abstract

Il test della fibra di DNA è un metodo semplice e robusto per l'analisi della dinamica della forcella di replicazione, basato sull'immunodetezione di analoghi nucleotidici che vengono incorporati durante la sintesi del DNA nelle cellule umane. Tuttavia, questa tecnica ha una risoluzione limitata di poche migliaia di kilobasi. Di conseguenza, le lacune post-replicative del DNA a singolo filamento (ssDNA) piccole come poche centinaia di basi non sono rilevabili dal test standard. Qui, descriviamo una versione modificata del test della fibra di DNA che utilizza la nucleasi S1, un enzima che scinde specificamente l'ssDNA. In presenza di gap ssDNA post-replicativi, la nucleasi S1 prenderà di mira e fenderà i gap, generando tratti più corti che possono essere utilizzati come read-out per gli ssDNA gaps sulle forche in corso. Queste lacune post-replicative di ssDNA si formano quando il DNA danneggiato viene replicato in modo discontinuo. Possono essere riparati tramite meccanismi disaccoppiati dalla replicazione del genoma, in un processo noto come gap-filling o riparazione post-replicativa. Poiché i meccanismi di riempimento delle lacune coinvolgono la sintesi del DNA indipendentemente dalla fase S, le alterazioni nello schema di etichettatura delle fibre di DNA possono anche essere impiegate per monitorare gli eventi di riempimento delle lacune. Complessivamente, queste modifiche del test delle fibre di DNA sono potenti strategie per capire come si formano e si riempiono le lacune post-replicative nel genoma delle cellule umane.

Introduction

Lavori seminali hanno fornito prove dell'accumulo di lacune post-replicative a singolo filamento (ssDNA) durante il trattamento con agenti dannosi per il DNA nei batteri¹ e nelle cellule umane ^2,3. Durante la replicazione di modelli di DNA danneggiati, il meccanismo di sintesi del DNA può bypassare le lesioni impiegando specifiche DNA polimerasi di sintesi translesionale o attraverso meccanismi di commutazione del modello. In alternativa, il replisome può anche semplicemente saltare la lesione lasciando dietro di sé un gap di ssDNA, da riparare in seguito. Più recentemente, uno studio h....

Protocol

Poiché lo studio utilizza cellule umane, il lavoro è stato approvato dal Comitato Etico dell'Istituto di Scienze Biomediche dell'Università di San Paolo (ICB-USP, numero di approvazione #48347515.3.00005467) per la ricerca con campioni umani.

NOTA: I protocolli qui descritti sono stati utilizzati in precedenti pubblicazioni con piccole modifiche 14,16,28. Qui l'attenzione si concentra sull'uso della luce ultravioletta C (UVC) come agente dannoso per il DNA. Tuttavia, anche altri agenti dannosi per il DNA come il cisplatino e l'idrossiurea sono stat....

Results

Nel test S1 Fiber, se il trattamento con un agente genotossico porta a lacune post-replicative di ssDNA, le lunghezze complessive delle fibre di DNA dai nuclei trattati con S1 saranno più brevi dopo il trattamento con danno al DNA rispetto ai campioni non trattati e ai campioni che sono stati trattati con l'agente genotossico ma non sono stati sottoposti a scissione S1 (Figura 1).

In alternativa, se il trattamento con nucleasi S1 non influisce in modo significativ.......

Discussion

I passaggi critici del protocollo standard di analisi delle fibre di DNA sono stati discussi in una precedente pubblicazione³². Qui, descriviamo le versioni modificate del test standard delle fibre di DNA per studiare la presenza di lacune post-replicative di ssDNA e la loro riparazione mediante gap-filling, inizialmente descritto in¹⁴. Nel contesto della presenza post-replicativa di ssDNA gap, l'uso della nucleasi S1 nel protocollo S1 Fiber sarebbe molto probabilmente adat.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acido acetico, Glacial	Synth	64-19-7	In alternativa, BSA - Biosiero - REF PM-T1725/100
Idrossido di ammonio	Synth	1336-21-6	O simile
Anticorpo anti-topo IgG1 Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11005-Anticorpo
anti-ratto Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21470-Anticorpo
Topo anti-BrdU	Becton Disckson	347580-Anticorpo
Ratto anti-BrdU	Abcam	Ab6326-Cappuccio
di sicurezza biologico	Pachane	PA 410	Utilizzare cappuccio presente in laboratorio
BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma-Aldrich	A3294	O simile
Raschietto cellulare	Thermo Scientific	179693	O simile
CldU	Millipore-Sigma	C6891-Acido
cloridrico	Synth	7647-01-0	O simili
Confocali Zeiss LSM Series (7, 8 o 9)	Zeiss-O		simili
Vetro di copertura (o vetrini coprioggetti)	Thermo Scientific	152460	In alternativa, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) - K5-2460
DMEM - High Glucose	LGC/Gibco	BR30211-05/12100046	Utilizzare terreni di coltura specifici per la linea cellulare utilizzata.
EDTA (acido etilendiamminotetraacetico sale disodico diidrato)	Sigma-Aldrich	E5314	O simile
Microscopio a epifluorescenza Axiovert 200	Zeiss-O		simile
FBS (Siero fetale bovino)	Gibco	12657-029	O simile
Forma Serie II Water Jacketed CO2 Incubator	Thermo Scientific 3110	13-998-074	Utilizzare l'incubatore cellulare presente nel vetrino da laboratorio
	Sigma-Aldrich	S5516	O simile
Glicerolo	Sigma-Aldrich	56-81-5	O simile
Idu	Millipore-Sigma	I7125-Cloruro
di magnesio	Synth	7791-18-6	O simile
Metanolo	Merck	67-56-1	O simile
Vetrini per	microscopioDenville	M1021	In alternativa, Olen - Kasvi Vetrini per microscopio - K5-7105 OR Linea di vetro di precisione - 7105-1
MOPS (Á cido 3-morfolinopropano 1-sulfô nico)	Synth	1132-61-2	O simile
Nocodazolo	Sigma-Aldrich	31430-18-9-PBS
(Soluzione salina tampone fosfato)	Life Thechnologies	3002	O simile
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15140122	O simile
ProLong Gold AntiFade Mountant	Invitrogen	P36930	Qualsiasi soluzione antifade moutant per l'immunofluorescenza potrebbe essere utilizzata
la nucleasi S1 purificata da Aspergillus oryzae	Invitrogen	18001-016	Pre-diluire la nucleasi S1 (1/100 - 1/200) nel tampone di diluizione della nucleasi S1 fornito dal produttore, aliquote e conservare a -20 ° C
SDS (Sodio Dodecil Solfato)	BioRad	161-0302	O simile
Acetato di sodio Triidrato	Sigma-Aldrich	6131-90-4	O simile
Cloruro di sodio	Synth	7647-14-5	O simile
Saccarosio	Sigma-Aldrich	57-50-1	O simile
Tris Base	West Lab Research	BP152-1	O simile
Triton X-100	Synth	9002-93-1	O simile
Trypsin	Gibco		25200072 O simile
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	O simile
Lampada UVC	Non	Specifico-Essenziale	: lunghezza di emissione di 254 nm
VLX-3W Radiometro UV	Vilber Loumart-O		simile
Acetato di zinco	Sigma-Aldrich	557-34-6	O simile