Rilevamento di lacune post-replicative accumulo e riparazione nelle cellule umane utilizzando il test delle fibre di DNA

Davi J. Martins; Stephanie Tirman; Annabel Quinet; Carlos F. M. Menck

doi:10.3791/63448

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Articolo metodologico

Rilevamento di lacune post-replicative accumulo e riparazione nelle cellule umane utilizzando il test delle fibre di DNA

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DOI:

10.3791/63448

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3 febbraio 2022

Davi J. Martins^*¹ , Stephanie Tirman^*² , Annabel Quinet² , Carlos F. M. Menck¹

¹Department of Microbiology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo, ²Division of Oncology, Department of Internal Medicine, Washington University in St. Louis

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui descriviamo due modifiche del test della fibra di DNA per studiare le lacune del DNA a singolo filamento nella replicazione del DNA dopo l'induzione della lesione. Il test della fibra S1 consente il rilevamento di lacune post-replicative utilizzando l'endonucleasi S1 specifica per ssDNA, mentre il test di riempimento delle lacune consente la visualizzazione e la quantificazione della riparazione del gap.

Abstract

Il test della fibra di DNA è un metodo semplice e robusto per l'analisi della dinamica della forcella di replicazione, basato sull'immunodetezione di analoghi nucleotidici che vengono incorporati durante la sintesi del DNA nelle cellule umane. Tuttavia, questa tecnica ha una risoluzione limitata di poche migliaia di kilobasi. Di conseguenza, le lacune post-replicative del DNA a singolo filamento (ssDNA) piccole come poche centinaia di basi non sono rilevabili dal test standard. Qui, descriviamo una versione modificata del test della fibra di DNA che utilizza la nucleasi S1, un enzima che scinde specificamente l'ssDNA. In presenza di gap ssDNA post-replicativi, la nucleasi S1 prenderà di mira e fenderà i gap, generando tratti più corti che possono essere utilizzati come read-out per gli ssDNA gaps sulle forche in corso. Queste lacune post-replicative di ssDNA si formano quando il DNA danneggiato viene replicato in modo discontinuo. Possono essere riparati tramite meccanismi disaccoppiati dalla replicazione del genoma, in un processo noto come gap-filling o riparazione post-replicativa. Poiché i meccanismi di riempimento delle lacune coinvolgono la sintesi del DNA indipendentemente dalla fase S, le alterazioni nello schema di etichettatura delle fibre di DNA possono anche essere impiegate per monitorare gli eventi di riempimento delle lacune. Complessivamente, queste modifiche del test delle fibre di DNA sono potenti strategie per capire come si formano e si riempiono le lacune post-replicative nel genoma delle cellule umane.

Introduzione

Lavori seminali hanno fornito prove dell'accumulo di lacune post-replicative a singolo filamento (ssDNA) durante il trattamento con agenti dannosi per il DNA nei batteri¹ e nelle cellule umane ^2,3. Durante la replicazione di modelli di DNA danneggiati, il meccanismo di sintesi del DNA può bypassare le lesioni impiegando specifiche DNA polimerasi di sintesi translesionale o attraverso meccanismi di commutazione del modello. In alternativa, il replisome può anche semplicemente saltare la lesione lasciando dietro di sé un gap di ssDNA, da riparare in seguito. Più recentemente, uno studio h....