Articolo metodologico

Misurazione del contenuto di ferro non eme tissutale utilizzando un saggio colorimetrico basato su bathofenantrolina

DOI:

10.3791/63469

⸱

31 gennaio 2022

 , 
1i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 2Basic and Clinical Research on Iron Biology, IBMC - Instituto de Biologia Molecular e Celular, Universidade do Porto, 3Iron and Innate Immunity, IBMC - Instituto de Biologia Molecular e Celular, Universidade do Porto, 4ICBAS - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Qui viene fornito un protocollo per la misurazione del contenuto di ferro non eme nei tessuti animali, utilizzando un test colorimetrico semplice e consolidato che può essere facilmente implementato nella maggior parte dei laboratori.

Abstract

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Il ferro è un micronutriente essenziale. Sia il sovraccarico di ferro che la carenza sono altamente dannosi per l'uomo e i livelli di ferro nei tessuti sono finemente regolati. L'uso di modelli animali sperimentali di sovraccarico o carenza di ferro è stato determinante per far progredire la conoscenza dei meccanismi coinvolti nella regolazione sistemica e cellulare dell'omeostasi del ferro. La misurazione dei livelli totali di ferro nei tessuti animali viene comunemente eseguita con la spettroscopia di assorbimento atomico o con un saggio colorimetrico basato sulla reazione del ferro non eme con un reagente batofenantrolina. Per molti anni, il saggio colorimetrico è stato utilizzato per la misurazione del contenuto di ferro non eme in una vasta gamma di tessuti animali. A differenza della spettroscopia di assorbimento atomico, esclude il contributo dell'eme ferro derivato dall'emoglobina contenuta nei globuli rossi. Inoltre, non richiede sofisticate capacità analitiche o attrezzature molto costose e può quindi essere facilmente implementato nella maggior parte dei laboratori. Infine, il test colorimetrico può essere basato su cuvette o adattato a un formato a micropiastre, consentendo una maggiore produttività del campione. Il presente lavoro fornisce un protocollo ben consolidato che è adatto per la rilevazione di alterazioni nei livelli di ferro nei tessuti in una varietà di modelli animali sperimentali di sovraccarico di ferro o carenza di ferro.

Introduzione

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Il ferro è un micronutriente essenziale, necessario per la funzione delle proteine coinvolte in processi biologici cruciali come il trasporto di ossigeno, la produzione di energia o la sintesi del DNA. È importante sottolineare che sia l'eccesso di ferro che la carenza di ferro sono altamente dannosi per la salute umana e i livelli di ferro nei tessuti sono finemente regolati. L'assorbimento anormale del ferro nella dieta, le diete carenti di ferro, le ripetute trasfusioni di sangue e l'infiammazione cronica sono cause comuni di disturbi associati al ferro che colpiscono miliardi di persone in tutto il mondo1,2,3.

Modelli animali sperimentali di sovraccarico o carenza di ferro sono stati strumentali per far progredire la nostra conoscenza dei meccanismi coinvolti nella regolazione sistemica e cellulare dell'omeostasi del ferro4. Nonostante i sostanziali progressi compiuti negli ultimi due decenni, molti aspetti chiave rimangono sfuggenti. Nei prossimi anni, la misurazione accurata dei livelli totali di ferro nei tessuti animali rimarrà un passo fondamentale per far progredire la ricerca nel campo della biologia del ferro.

La maggior parte dei laboratori quantifica il ferro tissutale con la spettroscopia di assorbimento atomico (AAS), la spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente (ICP-MS) o un saggio colorimetrico basato sulla reazione del ferro non eme con un reagente batofenantrolina. Quest'ultimo si basa sul metodo originale descritto da Torrance e Bothwell oltre 50 anni fa5,6. Mentre una variante di questo metodo è stata successivamente sviluppata utilizzando la ferrozina come alternativa alla bathofenantrolina7, quest'ultimo rimane il reagente cromogenico più ampiamente citato in letteratura.

Il metodo di scelta dipende spesso dalle competenze e dall'infrastruttura disponibili. Mentre AAS e ICP-MS sono più sensibili, il saggio colorimetrico rimane ampiamente utilizzato perché presenta i seguenti importanti vantaggi: i) esclude il contributo di ferro eme derivato dall'emoglobina contenuta nei globuli rossi; ii) non richiede sofisticate capacità analitiche o attrezzature altamente costose; e iii) il saggio originale basato su cuvette può essere adattato a un formato a micropiastre, consentendo una maggiore produttività del campione. L'approccio colorimetrico presentato in questo lavoro viene abitualmente utilizzato per quantificare le alterazioni nei livelli di ferro non eme tissutale in una varietà di modelli animali sperimentali di sovraccarico di ferro o carenza di ferro, dai roditori ai pesci e alla mosca della frutta. Qui viene fornito un protocollo per la misurazione del contenuto di ferro non eme nei tessuti animali, utilizzando un test colorimetrico semplice e ben consolidato che la maggior parte dei laboratori dovrebbe trovare facile da implementare.

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Protocollo

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I topi C57BL/6 sono stati acquistati commercialmente e i topi epcidina-null (Hamp1−/−) su uno sfondo C57BL/68 sono stati un gentile regalo di Sophie Vaulont (Institut Cochin, Francia). Gli animali sono stati ospitati presso la struttura per animali i3S in specifiche condizioni prive di agenti patogeni, in un ambiente a temperatura e luce controllata, con libero accesso al chow e all'acqua dei roditori standard. La spigola europea (Dicentrarchus labrax) è stata acquistata da un allevamento ittico commerciale e ospitata presso l'impianto per animali ICBAS, in un ambiente a temperatura e luce controllata, e alimentata quotidianamente ad libitum con mangimi standard per spigole. Tutte le procedure che coinvolgono animali vertebrati sono state approvate dal Comitato etico per gli animali i3S e dall'autorità nazionale, Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV). Le informazioni sui reagenti, le attrezzature e gli animali commerciali sono elencate nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione della soluzione

NOTA: Maneggiare e preparare tutti i reagenti e le soluzioni con bicchieri senza ferro o stoviglie usa e getta. Non lasciare che materiali metallici di laboratorio (ad esempio, spatole in acciaio inossidabile) entrino in contatto con qualsiasi reagente o soluzione, a causa del rischio di contaminazione da ferro. Assicurati che qualsiasi bicchiere riutilizzabile sia privo di ferro. Lavare i materiali con apposito detergente di laboratorio per 30-60 min, risciacquare con acqua deionizzata, immergere durante la notte in una soluzione di acido nitrico al 37% diluita 1:3 con acqua deionizzata, risciacquare nuovamente con acqua deionizzata e lasciare asciugare.

  1. Miscela acida: aggiungere 10 g di acido tricloroacetico a 82,2 ml di acido cloridrico al 37% in una bottiglia di vetro, sciogliere accuratamente e regolare il volume finale a 100 ml con acqua deionizzata. Agitare prima dell'uso. In alternativa, utilizzare solo il 37% di acido cloridrico per la digestione dei tessuti.
    NOTA: La soluzione è stabile per almeno 2 mesi se conservata in flaconi di reagente di vetro marrone scuro.
    ATTENZIONE: l'acido cloridrico e l'acido tricloroacetico sono corrosivi e le forme concentrate rilasciano vapori acidi tossici. Indossare indumenti protettivi, guanti resistenti alle sostanze chimiche e occhiali antispruzzo chimico in ogni momento quando si maneggiano gli acidi. Evitare di respirarli e maneggiare sempre gli acidi sotto una cappa aspirante.
  2. Acetato di sodio saturo: aggiungere 228 g di acetato di sodio anidro a 400 ml di acqua deionizzata in una bottiglia di vetro e agitare durante la notte a temperatura ambiente. Lasciare riposare la soluzione e precipitare per un giorno. Se non si verifica alcuna precipitazione, continuare ad aggiungere piccole quantità di acetato di sodio. Conservare la soluzione in una bottiglia di vetro.
  3. Reagente cromogeno: Per preparare 1 mL di reagente cromogeno, aggiungere 1 mg di sale disodico acido disolfonico 4,7-difenil-1,10-fenantrolina a 500 μL di acqua deionizzata e 10 μL di acido tioglicolico concentrato (100%) e sciogliere completamente. Portare il volume finale a 1 mL con acqua deionizzata.
    NOTA: Preparare tutto il reagente cromogeno necessario. La soluzione è stabile per 1 mese se protetta dalla luce.
  4. Reagente cromogeno di lavoro (WCR): aggiungere 1 volume del reagente cromogeno a 5 volumi di acetato di sodio saturo e 5 volumi di acqua deionizzata.
    NOTA: Questa soluzione deve essere preparata al momento del consumo.
  5. Soluzione standard di ferro madre: per preparare una soluzione di ferro da 20 mM, posizionare 111,5 mg di polvere di ferro carbonilico in un matraccio tarato da 250 ml contenente 5.480 μL di acido cloridrico al 37%. Lasciare sciogliere durante la notte a temperatura ambiente (o incubare a bagnomaria bollente). Quindi, portare la soluzione a un volume finale di 100 ml con acqua deionizzata.
    NOTA: La soluzione standard può essere conservata a tempo indeterminato se conservata in un recipiente ben sigillato.
  6. Working Iron Standard Solution (WISS): aggiungere 13,5 μL di acido cloridrico al 37% a 500 μL di acqua deionizzata. Aggiungere 10 μL della soluzione standard di ferro stock e portare il volume finale a 1 mL con acqua deionizzata (11.169 μg di Fe/mL, 200 μM; misurato da AAS).
    NOTA: La soluzione di lavoro deve essere preparata al momento del consumo.

2. Essiccazione del campione

  1. Tagliare un campione di tessuto del peso di 10-100 mg con una lama di bisturi. Pesarlo accuratamente in una bilancia analitica/di precisione su un piccolo pezzo di parafilm (Fresh Weight).
  2. Utilizzando una pinzetta di plastica, posizionare il pezzo di tessuto in una piastra a 24 pozzetti (non scivolata per consentire l'evaporazione dell'acqua) e lasciarlo asciugare su un incubatore standard a 65 °C per 48 ore.
  3. In alternativa, utilizzare un forno di digestione a microonde da laboratorio per asciugare campioni di tessuto. Usando una pinzetta di plastica, posizionare il pezzo di tessuto pesato in una tazza di Teflon senza ferro e asciugarlo nel microonde. Impostare i parametri operativi in base al manuale di istruzioni dello strumento.
    NOTA: Come riferimento, i parametri operativi per l'essiccazione dei campioni di fegato utilizzando il forno di digestione specifico (vedere Tabella dei materiali) sono mostrati nella Tabella 1.
  4. Utilizzando pinzette di plastica, posizionare ogni pezzo di tessuto essiccato su un piccolo pezzo di parafilm all'interno di una bilancia analitica/ di precisione e pesarlo accuratamente (Peso secco).

3. Digestione acida del campione

  1. Utilizzando pinzette di plastica, trasferire ogni pezzo di tessuto essiccato in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml.
  2. Aggiungere 1 mL della miscela acida e chiudere il tubo del microcentrifuga. Preparare un bianco acido allo stesso modo, tranne per il fatto che il tessuto viene omesso.
    ATTENZIONE: La miscela acida è corrosiva e rilascia vapori tossici. Indossare indumenti protettivi, guanti resistenti agli agenti chimici e occhiali antispruzzo chimico quando si maneggia la miscela acida. Evita di respirarlo e maneggialo sempre sotto una cappa aspirante.
  3. Digerire i tessuti incubando i tubi microcentrifuga in un incubatore a 65 °C per 20 ore.
  4. Dopo il raffreddamento a temperatura ambiente, trasferire 500 μL dell'estratto di acido chiaro (giallo) (surnatante) in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 mL utilizzando una micropipetta dotata di punte di plastica. Se non è possibile ottenere un surnatante chiaro, eseguire una breve centrifugazione.
    ATTENZIONE: Il surnatante è altamente acido. Indossare indumenti protettivi, guanti resistenti agli agenti chimici e occhiali antispruzzo chimico quando si maneggiano i supernatanti. Maneggiateli sempre sotto una cappa aspirante.
    NOTA: A questo punto, gli estratti acidi possono essere immediatamente utilizzati per il saggio colorimetrico o congelati a -20 °C per un uso successivo. Scongelare completamente i campioni congelati a temperatura ambiente e vorticarli prima dell'uso.

4. Sviluppo del colore

  1. Preparare le reazioni cromogene come indicato nella Tabella 2 in tubi microcentrifuga da 1,5 mL o, per una maggiore produttività, direttamente nelle micropiastre di polistirene a fondo piatto, trasparenti e non trattate. Preparare tutte le reazioni (acido bianco, standard e campione) almeno in duplice copia.
  2. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.

5. Lettura dell'assorbanza

  1. Misurare l'assorbanza del campione in uno spettrofotometro o in un lettore di piastre a una lunghezza d'onda di 535 nm rispetto a un riferimento d'acqua deionizzato. Le piastre possono essere lette senza fili o con coperchio. Nella custodia con coperchio, rimuovere l'eventuale condensa formatasi a causa del rilascio di vapori acidi dal coperchio poco prima della misurazione per evitare possibili interferenze con la lettura dell'assorbanza.
    NOTA: l'assorbanza ottica del bianco acido letto contro l'acqua deionizzata (riferimento) deve essere inferiore a 0,015; l'assorbanza ottica dello standard e dei campioni deve essere compresa tra 0,100 e 1,000. Per i campioni con contenuto di ferro molto elevato o molto basso, potrebbe essere necessario regolare i volumi di estratto acido (surnatante) e diH2O (Tabella 2): se l'assorbanza è superiore a 1,0, utilizzare un volume di campione (surnatante) più piccolo; quando l'assorbanza è inferiore a 0,1, utilizzare un volume maggiore del surnatante. Il volume del campione (Vsmp) viene preso in considerazione quando si calcola il contenuto di ferro tissutale di ciascun campione (vedere il passaggio 6).

6. Calcolo del contenuto di ferro tissutale

  1. Calcola il contenuto di ferro del tessuto non eme con la seguente equazione:
    Ferro tissutale (μg/g di tessuto secco) = figure-protocol-1
    AT = assorbanza del campione di prova
    AB = assorbanza del bianco acido
    AS = assorbanza dello standard
    Fes = concentrazione di ferro di WISS (μg Fe/mL)
    W = peso del tessuto secco (g)
    Vsmp = volume del campione (volume variabile del surnatante nella Tabella 2 convertito in mL)
    Vf = volume finale della miscela acida dopo incubazione notturna a 65 °C (corrispondente al volume acido più il volume del tessuto secco in ml; se il peso del campione non differisce in modo significativo, assumere un volume costante ≈ 1 mL)
    Vstd = volume standard di ferro (volume di WISS nella tabella 2 convertito in mL)
    Vrv = volume di reazione finale (volume totale nella tabella 2 convertito in mL)

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Risultati

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Confronto tra cuvette e micropiastre a 96 pozzetti
La misurazione del ferro non eme tissutale per reazione con un reagente batofenantrolina originariamente descritto da Torrance e Bothwell5,6 si basa sull'uso di uno spettrofotometro per la lettura dell'assorbanza. Quindi, i volumi impiegati nella reazione cromogena sono compatibili con le dimensioni di una normale cuvetta spettrofotometrica. Il presente lavoro descrive un adattamento del metod...

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Discussione

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Viene fornito un protocollo per la misurazione del contenuto di ferro non eme nei tessuti animali, utilizzando un adattamento del saggio colorimetrico basato sulla batofenantrolina originariamente descritto da Torrance e Bothwell5,6. Le fasi critiche del metodo sono l'essiccazione del campione di tessuto; denaturazione proteica e rilascio di ferro inorganico per idrolisi acida; riduzione del ferro ferrico (Fe3+) allo stato ferroso (Fe2+) in ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato finanziato da Fondi Nazionali attraverso FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., nell'ambito del progetto UIDB/04293/2020.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastra trasparente UV a 96 pozzettiSarstedt82.1581.001
Bilancia analiticaKernABJ 220-4M
Acetato di sodio anidroMerck106268
Bathophenanthroline sulfonato (acido dissolfonico 4,7-difenil-1,10-fenantrolina)Sigma-AldrichB1375
C57BL/6 topi (Mus musculus)Charles River Laboratories
Polvere di ferro carbonilico, ≥ 99,5%Sigma-Aldrich44890
Cuvette monouso in polimetilmetacrilato (PMMA)VWR634-0678P
Acqua sterile a doppia distillazioneB. Braun0082479E
Lettore di micropiastre a fluorescenzaBioTek InstrumentsFLx800
Acido cloridrico, 37%Sigma-Aldrich258148
Forno per digestione a microonde e tazze in teflon biancoCEMMDS-2000
Acido nitricoFisher Scientific15687290
FornoBinderED115
Cibo per roditoriHarlan Laboratories2014STeklad Global 14% Protein Roditore Mantenimento Dieta contenente 175 mg/kg di ferro
Branzino (Dicentrarchus labrax)Sonrionansa
Mangime per spigoleSkrettingL-2 Alterna 1P
Spettrofotometro UV-Vis a fascio singoloShimadzuUV mini 1240
Acido tioglicolicoMerck100700
Acido tricloroaceticoMerck100807

Riferimenti

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  1. Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. A red carpet for iron metabolism. Cell. 168, 344-361 (2017).
  2. Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. Hepcidin and anemia: A tight relationship. Frontiers in Physiology. 10, 1294(2019).
  3. Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T. Anemia of inflammation. Blood. 133 (1), 40-50 (2019).
  4. Altamura, S., et al. Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models. Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872(2020).
  5. Torrance, J. D., Bothwell, T. H. A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples. South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).
  6. Torrence, J. D., Bothwell, T. H. Tissue iron stores. Methods in Haematology. Cook, J. D. , Churchill Livingston Press. New York. 104-109 (1980).
  7. Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. Microanalysis of non-heme iron in animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).
  8. Lesbordes-Brion, J. C., et al. Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis. Blood. 108, 1402-1405 (2006).
  9. Jumbo-Lucioni, P., et al. Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 11, 297(2010).
  10. Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F. Iron Absorption in Drosophila melanogaster. Nutrients. 5, 1622-1647 (2013).
  11. Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. High-throughput non-heme iron assay for animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).
  12. Adrian, W. J., Stevens, M. L. Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver. Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).

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