Articolo metodologico

Trasformazione naturale, espressione proteica e crioconservazione del cianobatterio filamentoso Phormidium lacuna

DOI:

10.3791/63470

⸱

1 febbraio 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Botanical Institute, Karlsruhe Institute of Technology KIT, 2Institute for Biological Interfaces 5 (IBG 5), Karlsruhe Institute of Technology KIT, 3Institut für Technische Mikrobiologie, Hochschule Mannheim

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phormidium lacuna è un cianobatterio filamentoso che è stato isolato dalle piscine rocciose marine. Questo articolo descrive l'isolamento dei filamenti da fonti naturali, l'estrazione del DNA, il sequenziamento del genoma, la trasformazione naturale, l'espressione di sfGFP, la crioconservazione e i metodi di motilità.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I cianobatteri sono al centro della ricerca di base e dei progetti biotecnologici in cui l'energia solare viene utilizzata per la produzione di biomassa. Phormidium lacuna è un cianobatterio filamentoso recentemente isolato. Questo documento descrive come i nuovi cianobatteri filamentosi possono essere isolati dalle piscine rocciose marine. Descrive anche come il DNA può essere estratto dai filamenti e come i genomi possono essere sequenziati. Sebbene la trasformazione sia stabilita per molte specie unicellulari, è meno frequentemente segnalata per i cianobatteri filamentosi. Un metodo semplificato per la trasformazione naturale di P. lacuna è descritto qui. P. lacuna è l'unico membro dell'ordine Oscillatoriales per il quale è stabilita la trasformazione naturale. Questo documento mostra anche come la trasformazione naturale viene utilizzata per esprimere la proteina fluorescente verde superfolder (sfGFP). Un promotore endogeno cpcB ha indotto un'espressione circa 5 volte più forte rispetto ai promotori cpc560, A2813 o psbA2 di Synechocystis sp. PCC6803. Inoltre, è stato stabilito un metodo per la crioconservazione di P. lacuna e Synechocystis sp.CPP 6803 e sono descritti metodi per valutare la motilità in un mezzo liquido e su superfici di agar e plastica.

Introduzione

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I cianobatteri sono organismi procariotici che utilizzano la fotosintesi come fonte di energia 1,2. La ricerca è sempre più focalizzata sulle specie cianobatteriche. Diversi cianobatteri possono essere trasformati con il DNA3. I geni possono essere eliminati o sovraespressi in queste specie. Tuttavia, la trasformazione è limitata a poche specie 4,5,6,7,8,9,10,11, e può essere difficile stabilire la trasformazione in ceppi provenienti da collezioni di colture o dal wild 8. I ceppi della specie filamentosa Phormidium lacuna (Figura 1) sono stati isolati dalle cave di roccia marine, in cui le condizioni ambientali, come le concentrazioni di sale o la temperatura, fluttuano nel tempo. Questi cianobatteri filamentosi possono essere utilizzati come organismi modello per l'ordine Oscillatoriales12 a cui appartengono.

Durante gli studi che testano il trasferimento genico mediante elettroporazione 13,14 è stato scoperto che P. lacuna può essere trasformato dalla trasformazione naturale15. In questo processo, il DNA viene assorbito naturalmente da alcune cellule. Rispetto ad altri metodi di trasformazione16,17, la trasformazione naturale ha il vantaggio di non richiedere strumenti aggiuntivi che potrebbero complicare la procedura. Ad esempio, l'elettroporazione richiede cuvette adeguate, fili intatti e selezione della tensione corretta. P. lacuna è attualmente l'unico membro oscillatoriales suscettibile di trasformazione naturale. Poiché il protocollo originale si basa su protocolli di elettroporazione, includeva ancora diverse fasi di lavaggio che potrebbero non essere necessarie. Sono stati testati diversi approcci per semplificare il protocollo, portando al protocollo di trasformazione qui presentato.

La sequenza del genoma è essenziale per ulteriori studi molecolari basati sul knockout genico o sulla sovraespressione. Sebbene le sequenze del genoma possano essere ottenute con macchine di sequenziamento di nuova generazione in brevi periodi, l'estrazione del DNA può essere difficile e dipende dalla specie. Con P. lacuna, sono stati testati diversi protocolli. È stato quindi stabilito un metodo modificato basato sul bromuro di cetilmetil ammonio (CTAB), con conseguente purezza accettabile delle rese di DNA e DNA di ciascun ciclo di purificazione per continuare il lavoro in laboratorio. Il genoma di cinque ceppi potrebbe essere sequenziato con questo protocollo. Il successivo passo logico di trasformazione è stato quello di stabilire l'espressione proteica in P. lacuna.

La sfGFP utilizzata come proteina marcatore in questo protocollo può essere rilevata con qualsiasi microscopio a fluorescenza. Tutti i promotori che sono stati testati potrebbero essere utilizzati per l'espressione di P. lacuna sfGFP. Il crescente numero di ceppi derivanti dalla trasformazione ha portato alla necessità di un metodo per conservare le colture. Tali metodi sono stabiliti per Escherichia coli e molti altri batteri18. Nei protocolli standard, le colture di glicerolo vengono preparate, trasferite in azoto liquido e conservate a -80 °C. Questo metodo richiede solo pochi passaggi ed è altamente affidabile per quelle specie per le quali è stabilito. Il protocollo standard non era fattibile per P. lacuna perché le cellule viventi non potevano essere recuperate in tutti i casi. Tuttavia, quando il glicerolo è stato rimosso dopo lo scongelamento, le cellule di tutti gli studi sono sopravvissute. Vengono presentati metodi semplici per l'analisi della motilità di P. lacuna, che possono essere combinati con la mutagenesi knockout per indagare il pili di tipo IV o il ruolo dei fotorecettori. Questi saggi sono diversi da quelli dei cianobatteri unicellulari 19,20,21 e possono essere utili anche per altre Oscillatorie.

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Protocollo

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1. Isolamento dall'ambiente naturale

NOTA: Alghe verdi, diatomee, cianobatteri filamentosi e altre microalghe possono essere isolati. Il protocollo può essere utilizzato per qualsiasi specie di microalga da pozze rocciose che crescono in condizioni di laboratorio. I cianobatteri filamentosi che appartengono agli Oscillatoriales possono essere facilmente riconosciuti dal loro movimento e dalla forma filamentosa. La specie può essere identificata in uno stato semipuro mediante sequenziamento del genoma o sequenziamento dell'rRNA 16S.

  1. Trasferire campioni di acqua di mare liquida da piscine rocciose marine (cioè cavità nella costa rocciosa) in palloni da 50 ml. Per ogni pallone, annotare il luogo esatto o le coordinate della fonte naturale. Se possibile, filtrare il contenuto attraverso reti da 50 μm per ridurre le quantità di zooplancton. Conservare i campioni a 4 °C fino a quando non possono essere sottoposti a sottocoltura.
  2. Trasferire 1 mL di colture in piastre di Petri da 10 cm contenenti il 3% di bacto-agar in f/2 medium22,23 (vedi tabella dei materiali). Preparare fino a 20 piatti. Coltivare sotto luce bianca di 50 μmol m-2 s-1.
    NOTA: per la coltivazione possono essere utilizzate intensità luminose più elevate. Intensità fino a 400 μmol m-2 s-1 può essere utilizzata per P. lacuna, anche se altre specie potrebbero essere più sensibili alla luce.
  3. Dopo una settimana, trasferire le cellule desiderate in piastre di agar fresche usando una pinza sterile. Isolare le cellule al microscopio binoculare in condizioni sterili. Conservare la vecchia piastra di agar a 4 °C fino a quando le cellule appaiono e crescono sulla nuova piastra di agar.
  4. Ripeti questa fase di trasferimento ogni settimana per eliminare la contaminazione. Utilizzare l'occhio nudo per rilevare la contaminazione pesante e un microscopio con ingrandimento 400x per ulteriori controlli di contaminazione.
  5. Se un campione sembra privo di contaminazione, testare la contaminazione batterica o fungina su piastre di agar. Trasferire una frazione della coltura con un anello di inoculazione su una piastra lb24 agar (diametro 10 cm), mantenere la piastra a temperatura ambiente e verificare la crescita di contaminanti nell'arco di 1-3 giorni.
  6. Se si ottiene una specie cianobatterica filamentosa sterile, utilizzarla per ulteriori lavori di coltura. Coltivare P. lacuna in liquido o su piastre di bacto-agar. Utilizzare palloni da 250 mL con 50 mL di terreno f/2 o mezzo f/2+ per la coltura liquida.

2. Estrazione del DNA

NOTA: Questo metodo è adottato da 25 26

  1. Preparare due boccette con 50 ml di f/2 medio. Inoculare ciascuno con ~ 1 mL di filamenti di P. lacuna da altre colture in crescita. Conservare le colture per 7 giorni o più in agitazione (rotazione orizzontale) a 50 giri/min sotto luce bianca (50 μmol m-2 s-1) a 25 °C.
  2. Trattare la coltura con ultrasuoni (vedi la Tabella dei materiali) per 2 minuti con piena energia. Misurare OD a 750 nm; verificare che sia ~ 0,5. Continua a far crescere le culture se l'OD è troppo basso.
  3. Raccogliere i filamenti da 5.000 × g, 20 minuti di centrifugazione. Rimuovere il surnatante. Trasferire i filamenti con liquido residuo nella camera di una French Press27. Impostare la pressione della French Press a 20.000 psi ed estrarre le cellule.
    NOTA: La stampa francese lisa tutte le cellule e rilascerà il DNA; forti forze di taglio produrranno frammenti di DNA da 1.500 bp.
  4. Centrifugare il campione per 10 minuti a 10.000 × g e rimuovere il surnatante.
  5. Aggiungere al pellet 400 μL di tampone di lisi (4 M urea, 0,1 M Tris/Cl, pH 7,4) e 50 μL di proteinasi K (10 mg/mL). Riscaldare il campione a 55 °C per 60 minuti con agitazione a 550 giri/min.
  6. Aggiungere 1 mL di tampone di estrazione del DNA (3% CTAB, 1,4 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,1 M Tris/Cl, 1% Sarkosyl, 0,1 M DTT, pH 8) e incubare per 60 min a 55 °C e 550 rpm. Trasferire le soluzioni in tubi di centrifugazione e aggiungere due volumi di cloroformio/isoamilalcol (24/1).
  7. Dopo l'agitazione, centrifugare il campione per 5 minuti a 9.000 × g. Trasferire la fase acquosa superiore in flaconcini di reazione e aggiungere 1 mL di etanolo ghiacciato e 50 μL di acetato di sodio 3 M.
  8. Vorticare il campione e posizionarlo a -20 °C per 1 ora o più.
  9. Centrifugare per 5 minuti a 10.000 × g (4 °C) ed eliminare il surnatante. Lavare il pellet con il 70% di etanolo.
  10. Centrifugare nuovamente il campione. Rimuovere il surnatante e asciugare il pellet durante la notte. Sciogliere il DNA in acqua priva di nucleasi. Misurare lo spettro del DNA per verificare se l'OD 260 nm/OD 280 nm è compreso tra 1,6 e 1,9.
  11. Analizzare la dimensione del DNA su un gel di elettroforesi di agarosio28.
  12. Sequenziare il DNA genomico mediante sequenziamento di nuova generazione per 300 cicli, con un'impostazione di fine accoppiata e una lunghezza di lettura di 150 basi (vedi le Tabelle dei materiali).
  13. Eseguire l'assemblaggio con il programma informatico appropriato; si veda l'esempio riportato nella Tabella dei Materiali.
  14. Inviare la bozza del genoma al server RAST per l'annotazione.
    NOTA: Carica sequenze di DNA per ottenere un'annotazione completa in pochi minuti.

3. Trasformazione naturale ed espressione GFP

NOTA: La trasformazione si basa su un vettore plasmidico propagato in E. coli; pGEM-T o pUC19 possono essere utilizzati come vettori backbone. Le tecniche di clonazione sono stabilite in molti laboratori; vedi anche protocolli standard28 e gli articoli sui vettori di trasformazione per P. lacuna15,29. Esempi di vettori per l'espressione sfGFP sono descritti nella sezione dei risultati rappresentativi. I dettagli di quattro vettori non ancora pubblicati sono forniti nel file supplementare 1.

  1. Eseguire tutte le fasi utilizzando materiale sterile in condizioni di laboratorio sterili (banco pulito, vetreria sterile).
  2. Inoculare 2 x 50 mL di terreno liquido f/2 in due palloni da 250 mL con 2 x 1 mL di filamenti di P. lacuna provenienti da una coltura in esecuzione. Coltivare in luce bianca (50 μmol m-2 s-1) sotto agitazione (rotazione orizzontale, 50 rpm) per ~5 giorni a 25 °C.
  3. Preparare ~ 200 μg del DNA del vettore di trasformazione utilizzando un kit di preparazione midi (vedere la tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
  4. Omogeneizzare 100 mL di sospensione cellulare P. lacuna (vedi Tabella dei Materiali) a 10.000 giri/min per 3 min. Misurare OD a 750 nm (valore desiderato = 0,35).
  5. Centrifugare la sospensione cellulare per 15 min a 6.000 × g. Rimuovere il surnatante e sospendere il pellet in 800 μL (volume totale compresi liquido residuo e filamenti) del liquido rimanente e del mezzo f/2+ aggiuntivo.
  6. Prendi otto piastre di bacto-agar f/2+ (diametro 10 cm) contenenti 120 μg/mL di kanamicina. Pipetta 10 μg di DNA nel mezzo di ogni piastra di agar. Immediatamente pipettare 100 μL di sospensione cellulare nel mezzo di ogni piastra di agar (sopra il DNA).
  7. Tenere la piastra di agar senza coperchio sul banco pulito per consentire al liquido in eccesso di evaporare. Chiudere il piatto e coltivarlo in luce bianca a 25 °C per 2 giorni.
  8. Distribuire i filamenti di ciascuna piastra di agar con un anello di inoculazione su diverse piastre fresche di bacto-agar f/2+ contenenti 120 μg/mL di kanamicina. Coltivare le piastre in luce bianca a 25 °C e controllare regolarmente le colture al microscopio.
  9. Identifica i filamenti viventi trasformati dopo 7-28 giorni al microscopio. Cerca filamenti sani e verdi (Figura 2) diversi dagli altri filamenti. Se questi filamenti verdi possono essere identificati, continuare con il passaggio successivo; altrimenti, conservare il piatto per altri 7 giorni.
  10. Utilizzare una pinza per trasferire questi filamenti viventi identificati in 50 mL di mezzo liquido f/2+ con kanamicina da 250 μg/mL. Coltivare in bianco chiaro a 25 °C su uno shaker (rotazione orizzontale, 50 giri/min). Osserva la crescita per un massimo di quattro settimane.
  11. Trasferire i filamenti su un mezzo agar contenente 250 μg/mL di kanamicina e attendere che i filamenti crescano. Dopo diversi giorni, trasferire singoli filamenti in una piastra di agar fresca con una maggiore concentrazione di kanamicina, ad esempio 500 μg / mL. Conservare la piastra originale.
  12. Assicurarsi che i filamenti siano propagati in un'alta concentrazione di kanamicina in coltura liquida o su agar. Aumentare nuovamente la concentrazione di kanamicina per accelerare la segregazione.
    NOTA: P. lacuna trasformata cresce fino a 10.000 μg/mL di kanamicina. Altre specie potrebbero non tollerare concentrazioni così elevate.
  13. Se le cellule resistenti vengono coltivate e distribuite ampiamente su una piastra, testare l'integrazione dell'inserto nel genoma di P. lacuna eseguendo la PCR con primer esterni e interni.
    1. Utilizzare primer progettati per la clonazione dell'inserzione come primer interni.
    2. Per la progettazione dei primer esterni, selezionare sequenze che siano 5' e 3' del sito di inserimento proposto sul genoma di P. lacuna ma al di fuori dell'inserzione.
    3. Per le reazioni PCR, utilizzare primer interni e primer esterni. Utilizzare i ceppi resistenti e il tipo wild.
      NOTA: i primer interni indicano che l'inserto è presente; i primer esterni mostrano che l'inserto è inserito nel locus corretto.
  14. Per ogni reazione PCR, posizionare ~ 10 mg dei filamenti direttamente nei tubi PCR ed eseguire la PCR secondo i protocolli standard24. Se non si ottiene alcun prodotto, variare la temperatura di ricottura e lavare i filamenti con acqua.
    NOTA: Molte polimerasi diverse possono essere utilizzate nella PCR. Le polimerasi standard, come la Taq polimerasi, hanno un tasso di errore più elevato rispetto alle polimerasi di controllo degli errori, che sono più costose. Questa PCR analitica non richiede alcuna polimerasi di controllo degli errori. Tuttavia, la polimerasi di controllo degli errori deve essere testata se nessun prodotto PCR è ottenuto con una polimerasi standard.
  15. Analizzare i prodotti PCR della linea resistente sull'elettroforesi dell'agarosio24.
    1. Confronta le posizioni della banda con il marcatore e confronta il tipo wild e il trasformante. Con i primer interni ed esterni, cerca una banda più grande per il trasformante rispetto al tipo wild (a causa dell'inserimento della cassetta di resistenza) o due bande per il trasformante: una con le dimensioni della banda wild-type e una più grande. Poiché quest'ultimo caso indica una segregazione incompleta, continuare la coltivazione con alte concentrazioni di kanamicina.
      NOTA: Per maggiori dettagli sulla PCR e l'elettroforesi, vedere15,24 o altra letteratura standard.
  16. Per l'espressione GFP: osservare singoli filamenti con un microscopio a fluorescenza (vedi la Tabella dei materiali) ad un ingrandimento dell'obiettivo impostato a 40x o 63x. Cattura un'immagine di trasmissione in campo luminoso e un'immagine a fluorescenza. Utilizzare le seguenti impostazioni per GFP: passabanda a 470 nm per l'eccitazione, passaggio di banda a 525 nm per l'emissione e uno splitter del fascio da 495 nm, tempo di esposizione iniziale di 500 ms.
  17. Regolare il tempo di esposizione per chiari segnali di fluorescenza, evitando intensità di saturazione. Provare a utilizzare la stessa impostazione per tutti gli esempi.
  18. Poiché anche i filamenti wild-type mostreranno fluorescenza, cattura immagini con le stesse impostazioni di cui sopra per questa fluorescenza di sfondo.
    NOTA: la GFP che esprime la deformazione deve avere un segnale più alto; altrimenti, non sta esprimendo GFP.
  19. In base ai tempi di esposizione e alle intensità dei pixel delle immagini a fluorescenza, calcolare e confrontare il contenuto GFP dei diversi filamenti.

4. Crioconservazione

NOTA: P. lacuna e il cianobatterio unicellulare Synechocystis sp. PCC 6803 sono utilizzati. Il metodo attuale funziona meglio per P. lacuna.

  1. Coltivare P. lacuna o Synechocystissp PCC 6803 per almeno 10 giorni in 10 mL di mezzo f/2+ o BG-11, rispettivamente, sotto luce bianca (50 μmol m-2 s-1) a 25 °C sotto agitazione (rotazioni orizzontali, 50 rpm).
  2. Omogeneizzare la coltura di P. lacuna (vedi Tabella dei Materiali) a 10.000 giri/min per 3 min o con un dispositivo ad ultrasuoni (vedi tabella dei materiali) per 2 min a piena energia. Determinare OD 750 nm di entrambe le colture per verificare se il valore è compreso tra 1 e 7.
  3. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 6.000 × g per 15 min. Rimuovere il surnatante.
  4. Sospendere il pellet cellulare in 800 μL di mezzo f/2+ o BG-11 (volume finale) e trasferirlo in un crioviale da 2 mL. Aggiungere 800 μL di una soluzione di glicerolo al 50% alla sospensione cellulare. Chiudere il flaconcino e mescolare invertendo ripetutamente.
  5. Trasferire il crioviale in azoto liquido e conservarlo in una criobox in un congelatore a -80 °C. Notare la posizione della scatola all'interno del congelatore e le coordinate del campione all'interno della scatola.
  6. Per il recupero delle cellule, estrarre la crioviale e scongelare il contenuto a temperatura ambiente. Trasferire il contenuto in un tubo di reazione da 2 ml.
  7. Lavare il campione due volte. Per il 1° lavaggio, centrifugare a 6.000 × g per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospescere il pellet in 2 mL di mezzo f/2+ o BG-11. Per il 2° lavaggio, rifiltrare a 6.000 × g per 5 minuti, rimuovere il surnatante e sospendere il pellet in 2 ml di mezzo f/2+ o BG-11.
  8. Per verificare l'integrità di queste celle pronte per la coltivazione, trasferire il pellet a 9 ml di terreno e coltivarle in luce bianca (50 μmol m-2 s-1) sotto agitazione (55 rpm). Confronta l'OD 750 nm della coltura il primo giorno e dopo 1 settimana.

5. Motilità del Phormidium lacuna

NOTA: Verranno descritti tre diversi saggi. La stessa cultura viene utilizzata in tutti i casi.

  1. Coltivare P. lacuna in mezzo f/2 sotto agitazione orizzontale (50 rpm) in luce bianca (50 μmol m-2 s-1) per ~5 giorni fino a quando l'OD stimato 750 nm è 0,35. Conservare il campione a 4 °C fino all'uso.
  2. Omogeneizzare i filamenti (vedi tabella dei materiali) a 10.000 giri/min per 3 min o con ultrasuoni (vedi tabella dei materiali) per 1 min alla massima potenza e ciclo di 1. Misura OD 750 nm. Se superiore a 0,35, diluire la frazione con mezzo f/2. Utilizzare questa soluzione nei saggi di motilità nei passaggi 5.3, 5.4 e 5.5.
  3. Saggio per il movimento in mezzo liquido
    1. Per l'osservazione diretta della motilità, trasferire 8 mL di terreno contenente P. lacuna (dal punto 5.2) in una capsula di Petri di 6 cm. Attendere alcuni minuti fino a quando il campione raggiunge la temperatura ambiente. Coprire la capsula di Petri con un foglio di cellophane.
    2. Posizionare un vetrino per microscopio sul tavolo x-y di un microscopio standard con una fotocamera. Accendere la luce del microscopio. Idealmente, utilizzare sempre le stesse impostazioni elettriche e ottiche per l'illuminazione. Sposta un obiettivo 4x o 10x nel percorso della luce.
    3. Posizionare la capsula di Petri sopra la diapositiva. Regolare i singoli filamenti o fasci di filamenti in base ai movimenti x, y e z della tabella.
      NOTA: a causa della disposizione tridimensionale, solo una parte della sezione pertinente può essere messa a fuoco. La lamina di cellophane consente di regolare la messa a fuoco senza restrizioni.
    4. Osservare i movimenti di singoli filamenti o fasci. Assicurarsi che la lente dell'obiettivo non tocchi il liquido. Registrare i movimenti dei filamenti con una telecamera al microscopio standard (vedere Video supplementare S1).
  4. Saggio per il movimento sulla superficie
    1. Per l'osservazione della motilità del filamento sulle superfici dell'agar, preparare piastre di Petri da 6 cm con f/2 bacto-agar. Assicurarsi che l'agar sia abbastanza alto da consentire alla lente dell'obiettivo di avvicinarsi alla superficie dell'agar. In alternativa, preparare uno strato di agar spessore ~ 3 mm e registrare i filamenti attraverso l'agar (tenere la piastra capovolta o utilizzare un microscopio invertito).
    2. Pipetta 0,5 mL di una soluzione contenente P. lacuna (dal punto 5.2) sulla superficie bacto-agar di una capsula di Petri di 6 cm. Lasciare che il liquido entri nella superficie. Chiudi la capsula di Petri e osserva il movimento dei filamenti sulla superficie usando un obiettivo 4x o 10x.
    3. Assicurarsi che le stesse impostazioni elettriche e ottiche del microscopio siano utilizzate durante la registrazione e nelle registrazioni successive.
    4. Cattura registrazioni time-lapse utilizzando una fotocamera oculare e un sistema di minicomputer. Assicurarsi che l'intervallo di tempo tra le immagini successive sia di 5 s-1 min. Programmare lo script Linux del minicomputer per controllare la registrazione time-lapse. Vedere File supplementare 2 per uno script di esempio e Video supplementare S2 come esempio.
  5. Saggio per fototaxi
    1. Per gli esperimenti di fototassi, preparare supporti per diodi a emissione luminosa (LED) (qui, con una stampante 3D) in cui sono montati i LED da 5 mm selezionati per irradiare un'area di 20 mm2 dal basso verso l'alto (Figura 3). Se necessario, utilizzare molti supporti LED in parallelo, collegando elettricamente ciascun LED tramite un resistore e un potenziometro a un alimentatore regolabile. Misurare e regolare le intensità dei LED, a seconda dell'esperimento. Assicurarsi che l'intera impostazione si trovi in una stanza buia o in un contenitore buio chiuso.
    2. Posizionare 8 mL del mezzo contenente P. lacuna (dal punto 5.2) in una capsula di Petri da 6 cm. Regolare l'intensità luminosa del LED. Chiudere la capsula di Petri con il coperchio e posizionarla su un supporto LED in modo che il LED sia al centro della capsula di Petri.
    3. Dopo la durata desiderata (tipicamente 2 giorni), scatta un'immagine della capsula di Petri con una fotocamera per smartphone puntata direttamente sulla posizione del trattamento della luce. Utilizzare un pannello LED bianco per l'irradiazione del campione. Utilizzare le impostazioni manuali della fotocamera; evitare riflessi di luce; regolare sempre per ottenere la stessa distanza tra l'obiettivo della fotocamera e il campione. Assicurarsi che le impostazioni di esposizione forniscano un'immagine adatta per analisi successive utilizzando ImageJ.
    4. Quantifica il diametro del cerchio centrale dei filamenti utilizzando il software ImageJ.
      1. Apri ImageJ, fai clic su File | Aprire, selezionare il file desiderato e fare clic su Invio.
      2. Selezionare il pulsante Dritto (con una linea retta). Premere il pulsante sinistro del mouse per tracciare una linea da un'estremità della capsula di Petri all'estremità opposta. Assicurarsi che la linea passi attraverso il centro del cerchio di filamenti.
      3. Premere CTRL-K sulla tastiera o fare clic su Analizza | Traccia profilo nel menu ImmagineJ. Cerca una finestra x-y con intensità di pixel tracciate rispetto alla distanza: un profilo 1D della capsula di Petri. Assicurati che l'intensità di pixel più bassa sia leggermente superiore a 0 e il valore più alto inferiore a 255.
      4. Stimare un valore medio per l'intensità dei pixel al di fuori del cerchio e un altro valore medio per l'intensità dei pixel nel cerchio. Nella posizione y tra questi valori, stimare i valori x di entrambi i lati del cerchio puntando con il mouse su queste posizioni. Annotare entrambi i valori e calcolare la differenza.
      5. Ottenete il valore x più alto puntando il mouse sull'asse y a destra. Si noti che questo valore e rappresenta il diametro della capsula di Petri. Se questo diametro è di 5 cm, calcolare il diametro del cerchio centrale del filamento come d/e × 5 cm.

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Risultati

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Seguendo i metodi sopra menzionati, 5 diversi ceppi di P. lacuna sono stati isolati dalle piscine rocciose e sequenziati (Figura 1 e Tabella 1). Tutte le colture erano sterili dopo circa 1 anno di sottocoltura tranne P. lacuna HE10JO. Questo ceppo è ancora contaminato da Marivirga atlantica, un batterio marino. Durante le successive escursioni di Helgoland, altri cianobatteri filamentosi sono stati isolati da pozze rocciose, che sono diverse da

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Discussione

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Sebbene molti ceppi di cianobatteri siano disponibili dalle collezionidi colture 32,33,34,35,36, c'è ancora una domanda di nuovi cianobatteri dall'ambiente naturale perché queste specie sono adattate a proprietà specifiche. P. lacuna è stato raccolto da piscine rocciose ed è adattato alle variazioni delle concentrazioni di sale e della temperatura

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il lavoro è stato sostenuto dal Karlsruher Institute of Technology.

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Materiali

Terreni di coltura

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Autoclave 3870 ELVTuttnauer3870 ELV
Bacto AgarOttoNorwald214010
BG-11 Soluzione d'acqua dolceSigma AldrichC3061
BG-11 medioMerck73816-250ML
Acido boricoMerck10043-35-3H3BO3
Cloruro di calcio diidratoCarl Roth10035-04-8CaCl2 · 2 H2O
Palloni per colture cellulari Cellstar con tappo a vite con filtro, sterile, 250 mLGreiner658190
Palloni per colture cellulari Cellstar con tappo a vite con filtro, sterile, 50 mLGreiner601975
Centrifuga LYNX 4000Thermo Scientific75006580e rotore
Centrifuga microstar 17VWR InternationalN/Aper fino a 13.000 giri/min
Bromuro di cetiltrimetilammonio (CTAB)PanReac AppliChem57-09-0C19H42BrN
Cloroformio : Alcool isoamilico 24 : 1PanReac AppliChem
A1935
Cloruro di cobalto(II) esaidratoMerck7791-13-1CoCl2 · 6 H2O
Solfato di rame(II) pentaidratoMerck7758-99-8  CuSO4 · 5 H2O
D(+)-BiotinaCarl Roth58-85-5  C10H16N2O3S
Scala DNA 1 kbNew England BiolabsN3232
Scala DNA 100 bpNew England BiolabsN3231
Aiuto al pipettaggio elettrico accujet-pro SBrand GmbH26360per il pipettaggio 1-25 mL
EtanoloVWR64-17-5C2H6O
Acido etilendiammina tetraacetico sale disodico diidratoCarl Roth6381-92-6EDTA-Na2 · 2 H2O
Microscopio a fluorescenza ApoTomeZeiss
Axio Imager 2Zeiss
French Pressure Cell PressAmerican Instrument CompanyN/A
Sistema di documentazione su gel Saffe ImageInvitrogen
Sistema di gelelctroforesi Mupid-One/-exuADVANCED
Vetreria, diversa
GliceroloCarl Roth56-81-5C3H8O3
Cloruro di ferro (III) esaidratoMerck10025-77-1  FeCl3 · 6 H2O
KanamicinaSigma-Aldrich25389-94-0
Solfato di KanamicinaCarl Roth25389-94-0C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroylsarcosine, sale di sodio (sarcosil)Sigma Aldrich137-16-6C15H28NO3 · Na
LB Brodo (Lennox)Carl RothX964.4
Sorgente luminosa, tubo fluorescente L18W/954 luce diurnaOSRAMcoltivazione di cianobatteri
Sorgente luminosa, pannello LED XL 6500K 140 WBloom StarN/Acoltivazione di cianobatteri, fino a 1.000 &; mol m-2 s-1
Cloruro di magnesio esaidratoCarl Roth7791-18-6MgCl2 · 6 H2O
Cloruro di manganese(II) tetraidratoServa13446-34-9MnCl2 · 4 H2O
Microscopio DM750Zeiss
Kit di estrazione del plasmide per la preparazione del midi NucleoBond Xtra Midi kitMacherey-NAGEL GmbH & Co. KGREF740410.50
Minicomputer Raspberry Pi 4 +Conrad Electronics2138863-YDper la registrazione time-lapse
Fotocamera oculare EC3Leicaper la registrazione continua fino a 30 s
Fotocamera oculare MikrOkular Full HDBresserper registrazioni time-lapse, accoppiato al minicomputer Raspberry Pi
Piastre di Petri polistirole, 100 mm x 20 mmMerckP5606-400EA
Piastre di Petri polistirolo, 60 mm x 15 mmMerckP5481-500EA
Fotometro Nanodrop ND-1000Peqlab Biotechnologie
Fotometro Uvikon XSGoebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1.000 µ LGilsonSKU: FA10006M
Pipetman 10-100 µ SKU: FA10004M
Pipette in plastica 10 mL, steriliGreiner607107
Provetta in plastica, sterile, 15 mLGreiner188271
Provetta in plastica, sterile, 50 mLGreiner227261
Bromuro di potassioCarl Roth7758-02-3KBr
Cloruro di potassioCarl Roth7447-40-7KCl
Alimentatore Statron 3252-1Statron Gerä tetechnik GmbH
Alimentatore Voltcraft PPS 16005Conrad Electronicsper LED
Proteinasi KPromegaMC500Cda Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470
Q5 polimerasiNew England BiolabsM0491S
Kit di sequenziamento NextSeq 500/550 v2.5Illumina
Sistema di sequenziamento NextSeq 550 SY-415-1002Illumina
Shaker Unimax 2010Heidolph Strumentiper la coltivazione
Acetato di sodioCarl Roth127-09-3NaCH3COO
Cloruro di sodioCarl Roth7647-14-5NaCl
Sodio diidrogeno fosfato monoidratoCarl Roth10049-21-5NaH2PO4 · H2O
Fluoruro di sodioCarl Roth7681-49-4NaF
Carbonato acido di sodioCarl Roth144-55-8NaHCO3
Molibdato di sodio diidratoServa10102-40-6Na2MoO4 · 2 H2O
Nitrato di sodioMerck7631-99-4NaNO3
Solfato di sodioCarl Roth7757-82-6Na2SO4
Cloruro di stronzio esaidratoCarl Roth10025-70-4SrCl2 · 6 H2O
Cloridrato di tiaminaMerck67-03-8C12H17ClN4OS · HCl
TRISCarl Roth77-86-1C4H11NO3
Dispositivo a ultrasuoni UP100H con sonotrodo MS3Hielscher Ultrasound TechnologyUP100H
Ultraturrax Silent Crusher MHeidolph Instrumentsomogeneizzatore
UreaCarl Roth57-13-6CH4N2O
Vitamina B12Sigma68-19-9C63H88CoN14O14P
Soluzione0,3 &; M tiamina-HCl, 2,1 nM di biotina, 0,37 nM cianocobalamina
Alambicchi d'acqua, Trattamento delle acqueVEOLIA tecnologie dell'acquaELGA_21001
Solfato di zinco eptaidratoSigma7446-20-0ZnSO4 · 7 H2O
software, URL
gatb-minia programma per l'assemblaggiodel DNAhttps://github.com/GATB/gatb-minia-pipelinerealizza scaffold di grandi dimensioni da brevi letture di DNA,
per l'elaborazione delle immagini (intensità dei pixel, diametro del cerchio)
>
Acqua di mare artificiale0,41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM  KCl , 2,4 mM NaHCO3 ,0,84 mM KBr, 0,49 mM H3BO3, 90 &; M SrCl2, 72 &; M NaF
f/2 -liquido medioacqua di mare artificiale, soluzione di oligoelementi 0,1 % (v/v), soluzione vitaminica 0,05 % (v/v), 0,88 mM NaNO3, 36 &; micro; M NaH2PO4 
f/2+ fluidof/2-medio, con NaNO3 e NaH2PO4 (0,88 mM NaNO3, 36 &; micro; M NaH2PO4
f/2+-agar3 % (p/v) bacto agar, acqua di mare artificiale, soluzione di oligoelementi 0,1 % (v/v), soluzione vitaminica 0,05 % (v/v), 8,8 mM NaNO3, 0,36 mM NaH2PO4
f/2-agar3 % (p/v) bacto agar, acqua di mare artificiale, soluzione di oligoelementi 0,1 % (v/v), soluzione vitaminica 0,05 % (v/v), 0,88 mM NaNO3, 36 &; M NaH2PO4
Soluzione di oligoelementi0,36 mM NaH2PO4, 12 &; M Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0,91 µ M MnCl2
Soluzione vitaminica0,3 µ M tiamina-HCl, 2,1 nM di biotina, 0,37 nM di cianocobalamina
vitaminica software ImageJ basato su LinuxServer di annotazione RAST https://rast.nmpdr.org input: sequenza di DNA del genoma, rileva frame di lettura aperti, elenca sequenze proteiche e le loro funzioni

Riferimenti

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