Phormidium lacuna è un cianobatterio filamentoso che è stato isolato dalle piscine rocciose marine. Questo articolo descrive l'isolamento dei filamenti da fonti naturali, l'estrazione del DNA, il sequenziamento del genoma, la trasformazione naturale, l'espressione di sfGFP, la crioconservazione e i metodi di motilità.
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Articolo metodologico
Trasformazione naturale, espressione proteica e crioconservazione del cianobatterio filamentoso Phormidium lacuna
In questo articolo
Sommario
Abstract
I cianobatteri sono al centro della ricerca di base e dei progetti biotecnologici in cui l'energia solare viene utilizzata per la produzione di biomassa. Phormidium lacuna è un cianobatterio filamentoso recentemente isolato. Questo documento descrive come i nuovi cianobatteri filamentosi possono essere isolati dalle piscine rocciose marine. Descrive anche come il DNA può essere estratto dai filamenti e come i genomi possono essere sequenziati. Sebbene la trasformazione sia stabilita per molte specie unicellulari, è meno frequentemente segnalata per i cianobatteri filamentosi. Un metodo semplificato per la trasformazione naturale di P. lacuna è descritto qui. P. lacuna è l'unico membro dell'ordine Oscillatoriales per il quale è stabilita la trasformazione naturale. Questo documento mostra anche come la trasformazione naturale viene utilizzata per esprimere la proteina fluorescente verde superfolder (sfGFP). Un promotore endogeno cpcB ha indotto un'espressione circa 5 volte più forte rispetto ai promotori cpc560, A2813 o psbA2 di Synechocystis sp. PCC6803. Inoltre, è stato stabilito un metodo per la crioconservazione di P. lacuna e Synechocystis sp.CPP 6803 e sono descritti metodi per valutare la motilità in un mezzo liquido e su superfici di agar e plastica.
Introduzione
I cianobatteri sono organismi procariotici che utilizzano la fotosintesi come fonte di energia 1,2. La ricerca è sempre più focalizzata sulle specie cianobatteriche. Diversi cianobatteri possono essere trasformati con il DNA3. I geni possono essere eliminati o sovraespressi in queste specie. Tuttavia, la trasformazione è limitata a poche specie 4,5,6,7,8,9,10,11, e può essere difficile stabilire la trasformazione in ceppi provenienti da collezioni di colture o
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Protocollo
1. Isolamento dall'ambiente naturale
NOTA: Alghe verdi, diatomee, cianobatteri filamentosi e altre microalghe possono essere isolati. Il protocollo può essere utilizzato per qualsiasi specie di microalga da pozze rocciose che crescono in condizioni di laboratorio. I cianobatteri filamentosi che appartengono agli Oscillatoriales possono essere facilmente riconosciuti dal loro movimento e dalla forma filamentosa. La specie può essere identificata in uno stato semipuro mediante sequenziamento del genoma o sequenziamento dell'rRNA 16S.
- Trasferire campioni di acqua di mare liquida da piscine rocciose marine (cioè cavit....
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Risultati
Seguendo i metodi sopra menzionati, 5 diversi ceppi di P. lacuna sono stati isolati dalle piscine rocciose e sequenziati (Figura 1 e Tabella 1). Tutte le colture erano sterili dopo circa 1 anno di sottocoltura tranne P. lacuna HE10JO. Questo ceppo è ancora contaminato da Marivirga atlantica, un batterio marino. Durante le successive escursioni di Helgoland, altri cianobatteri filamentosi sono stati isolati da pozze rocciose, che sono diverse da
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Discussione
Sebbene molti ceppi di cianobatteri siano disponibili dalle collezionidi colture 32,33,34,35,36, c'è ancora una domanda di nuovi cianobatteri dall'ambiente naturale perché queste specie sono adattate a proprietà specifiche. P. lacuna è stato raccolto da piscine rocciose ed è adattato alle variazioni delle concentrazioni di sale e della temperatura
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Il lavoro è stato sostenuto dal Karlsruher Institute of Technology.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
Terreni di coltura
vitaminica software ImageJ basato su LinuxServer di annotazione RAST https://rast.nmpdr.org input: sequenza di DNA del genoma, rileva frame di lettura aperti, elenca sequenze proteiche e le loro funzioni
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Autoclave 3870 ELV | Tuttnauer | 3870 ELV | |
| Bacto Agar | OttoNorwald | 214010 | |
| BG-11 Soluzione d'acqua dolce | Sigma Aldrich | C3061 | |
| BG-11 medio | Merck | 73816-250ML | |
| Acido borico | Merck | 10043-35-3 | H3BO3 |
| Cloruro di calcio diidrato | Carl Roth | 10035-04-8 | CaCl2 · 2 H2O |
| Palloni per colture cellulari Cellstar con tappo a vite con filtro, sterile, 250 mL | Greiner | 658190 | |
| Palloni per colture cellulari Cellstar con tappo a vite con filtro, sterile, 50 mL | Greiner | 601975 | |
| Centrifuga LYNX 4000 | Thermo Scientific | 75006580 | e rotore |
| Centrifuga microstar 17 | VWR International | N/A | per fino a 13.000 giri/min |
| Bromuro di cetiltrimetilammonio (CTAB) | PanReac AppliChem | 57-09-0 | C19H42BrN |
| Cloroformio : Alcool isoamilico 24 : 1 | PanReac AppliChem | A1935 | |
| Cloruro di cobalto(II) esaidrato | Merck | 7791-13-1 | CoCl2 · 6 H2O |
| Solfato di rame(II) pentaidrato | Merck | 7758-99-8 | CuSO4 · 5 H2O |
| D(+)-Biotina | Carl Roth | 58-85-5 | C10H16N2O3S |
| Scala DNA 1 kb | New England Biolabs | N3232 | |
| Scala DNA 100 bp | New England Biolabs | N3231 | |
| Aiuto al pipettaggio elettrico accujet-pro S | Brand GmbH | 26360 | per il pipettaggio 1-25 mL |
| Etanolo | VWR | 64-17-5 | C2H6O |
| Acido etilendiammina tetraacetico sale disodico diidrato | Carl Roth | 6381-92-6 | EDTA-Na2 · 2 H2O |
| Microscopio a fluorescenza ApoTome | Zeiss | ||
| Axio Imager 2 | Zeiss | ||
| French Pressure Cell Press | American Instrument Company | N/A | |
| Sistema di documentazione su gel Saffe Image | Invitrogen | ||
| Sistema di gelelctroforesi Mupid-One/-exu | ADVANCED | ||
| Vetreria, diversa | |||
| Glicerolo | Carl Roth | 56-81-5 | C3H8O3 |
| Cloruro di ferro (III) esaidrato | Merck | 10025-77-1 | FeCl3 · 6 H2O |
| Kanamicina | Sigma-Aldrich | 25389-94-0 | |
| Solfato di Kanamicina | Carl Roth | 25389-94-0 | C18H36N4O11 · H2SO4 |
| Lauroylsarcosine, sale di sodio (sarcosil) | Sigma Aldrich | 137-16-6 | C15H28NO3 · Na |
| LB Brodo (Lennox) | Carl Roth | X964.4 | |
| Sorgente luminosa, tubo fluorescente L18W/954 luce diurna | OSRAM | coltivazione di cianobatteri | |
| Sorgente luminosa, pannello LED XL 6500K 140 W | Bloom Star | N/A | coltivazione di cianobatteri, fino a 1.000 &; mol m-2 s-1 |
| Cloruro di magnesio esaidrato | Carl Roth | 7791-18-6 | MgCl2 · 6 H2O |
| Cloruro di manganese(II) tetraidrato | Serva | 13446-34-9 | MnCl2 · 4 H2O |
| Microscopio DM750 | Zeiss | ||
| Kit di estrazione del plasmide per la preparazione del midi NucleoBond Xtra Midi kit | Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG | REF740410.50 | |
| Minicomputer Raspberry Pi 4 + | Conrad Electronics | 2138863-YD | per la registrazione time-lapse |
| Fotocamera oculare EC3 | Leica | per la registrazione continua fino a 30 s | |
| Fotocamera oculare MikrOkular Full HD | Bresser | per registrazioni time-lapse, accoppiato al minicomputer Raspberry Pi | |
| Piastre di Petri polistirole, 100 mm x 20 mm | Merck | P5606-400EA | |
| Piastre di Petri polistirolo, 60 mm x 15 mm | Merck | P5481-500EA | |
| Fotometro Nanodrop ND-1000 | Peqlab Biotechnologie | ||
| Fotometro Uvikon XS | Goebel Instrumentelle Analytik GmbH | ||
| Pipetman 100-1.000 µ L | Gilson | SKU: FA10006M | |
| Pipetman 10-100 µ SKU | : FA10004M | ||
| Pipette in plastica 10 mL, sterili | Greiner | 607107 | |
| Provetta in plastica, sterile, 15 mL | Greiner | 188271 | |
| Provetta in plastica, sterile, 50 mL | Greiner | 227261 | |
| Bromuro di potassio | Carl Roth | 7758-02-3 | KBr |
| Cloruro di potassio | Carl Roth | 7447-40-7 | KCl |
| Alimentatore Statron 3252-1 | Statron Gerä tetechnik GmbH | ||
| Alimentatore Voltcraft PPS 16005 | Conrad Electronics | per LED | |
| Proteinasi K | Promega | MC500C | da Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470 |
| Q5 polimerasi | New England Biolabs | M0491S | |
| Kit di sequenziamento NextSeq 500/550 v2.5 | Illumina | ||
| Sistema di sequenziamento NextSeq 550 SY-415-1002 | Illumina | ||
| Shaker Unimax 2010 | Heidolph Strumenti | per la coltivazione | |
| Acetato di sodio | Carl Roth | 127-09-3 | NaCH3COO |
| Cloruro di sodio | Carl Roth | 7647-14-5 | NaCl |
| Sodio diidrogeno fosfato monoidrato | Carl Roth | 10049-21-5 | NaH2PO4 · H2O |
| Fluoruro di sodio | Carl Roth | 7681-49-4 | NaF |
| Carbonato acido di sodio | Carl Roth | 144-55-8 | NaHCO3 |
| Molibdato di sodio diidrato | Serva | 10102-40-6 | Na2MoO4 · 2 H2O |
| Nitrato di sodio | Merck | 7631-99-4 | NaNO3 |
| Solfato di sodio | Carl Roth | 7757-82-6 | Na2SO4 |
| Cloruro di stronzio esaidrato | Carl Roth | 10025-70-4 | SrCl2 · 6 H2O |
| Cloridrato di tiamina | Merck | 67-03-8 | C12H17ClN4OS · HCl |
| TRIS | Carl Roth | 77-86-1 | C4H11NO3 |
| Dispositivo a ultrasuoni UP100H con sonotrodo MS3 | Hielscher Ultrasound Technology | UP100H | |
| Ultraturrax Silent Crusher M | Heidolph Instruments | omogeneizzatore | |
| Urea | Carl Roth | 57-13-6 | CH4N2O |
| Vitamina B12 | Sigma | 68-19-9 | C63H88CoN14O14P |
| Soluzione | 0,3 &; M tiamina-HCl, 2,1 nM di biotina, 0,37 nM cianocobalamina | ||
| Alambicchi d'acqua, Trattamento delle acque | VEOLIA tecnologie dell'acqua | ELGA_21001 | |
| Solfato di zinco eptaidrato | Sigma | 7446-20-0 | ZnSO4 · 7 H2O |
| software, URL | |||
| gatb-minia programma per l'assemblaggio | del DNAhttps://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline | realizza scaffold di grandi dimensioni da brevi letture di DNA, | |
| per l'elaborazione delle immagini (intensità dei pixel, diametro del cerchio) | |||
| > | |||
| Acqua di mare artificiale | 0,41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM KCl , 2,4 mM NaHCO3 ,0,84 mM KBr, 0,49 mM H3BO3, 90 &; M SrCl2, 72 &; M NaF | ||
| f/2 -liquido medio | acqua di mare artificiale, soluzione di oligoelementi 0,1 % (v/v), soluzione vitaminica 0,05 % (v/v), 0,88 mM NaNO3, 36 &; micro; M NaH2PO4 | ||
| f/2+ fluido | f/2-medio, con NaNO3 e NaH2PO4 (0,88 mM NaNO3, 36 &; micro; M NaH2PO4 | ||
| f/2+-agar | 3 % (p/v) bacto agar, acqua di mare artificiale, soluzione di oligoelementi 0,1 % (v/v), soluzione vitaminica 0,05 % (v/v), 8,8 mM NaNO3, 0,36 mM NaH2PO4 | ||
| f/2-agar | 3 % (p/v) bacto agar, acqua di mare artificiale, soluzione di oligoelementi 0,1 % (v/v), soluzione vitaminica 0,05 % (v/v), 0,88 mM NaNO3, 36 &; M NaH2PO4 | ||
| Soluzione di oligoelementi | 0,36 mM NaH2PO4, 12 &; M Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0,91 µ M MnCl2 | ||
| Soluzione vitaminica | 0,3 µ M tiamina-HCl, 2,1 nM di biotina, 0,37 nM di cianocobalamina |
Riferimenti
- Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories. Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).
- Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. Evalua....
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Ristampe e permessi
