Articolo metodologico

Espansione del toolkit per l'imaging in vivo del trasporto assonale

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DOI:

10.3791/63471

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23 dicembre 2021

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1Department of Neuromuscular Diseases, UCL Queen Square Institute of Neurology, University College London, 2UCL Queen Square Motor Neuron Disease Centre, University College London, 3UK Dementia Research Institute, University College London

In questo articolo

Sommario

Utilizzando topi fluorescenti transgenici, vengono descritti protocolli dettagliati per valutare il trasporto assonale in vivo di endosomi e mitocondri di segnalazione all'interno di assoni motori e sensoriali del nervo sciatico intatto in animali vivi.

Abstract

Il trasporto assonale mantiene l'omeostasi neuronale consentendo il traffico bidirezionale di diversi organelli e carichi. Le interruzioni nel trasporto assonale hanno conseguenze devastanti per i singoli neuroni e le loro reti e contribuiscono a una pletora di disturbi neurologici. Poiché molte di queste condizioni coinvolgono meccanismi autonomi e non autonomi delle cellule e spesso mostrano uno spettro di patologia attraverso i sottotipi neuronali, i metodi per identificare e analizzare con precisione i sottoinsiemi neuronali sono imperativi.

Questo documento descrive i protocolli per valutare il trasporto assonale in vivo di endosomi e mitocondri di segnalazione nei nervi sciatici di topi anestetizzati. Vengono fornite istruzioni graduali per 1) distinguere i neuroni motori da quelli sensoriali in vivo, in situ ed ex vivo utilizzando topi che esprimono selettivamente proteine fluorescenti all'interno dei motoneuroni colinergici; e 2) valutare separatamente o contemporaneamente il trasporto assonale in vivo di endosomi e mitocondri di segnalazione. Questi approcci intravitali complementari facilitano l'imaging simultaneo di diversi carichi in distinti assoni nervosi periferici per monitorare quantitativamente il trasporto assonale in salute e malattia.

Introduzione

Il sistema nervoso periferico (PNS) collega il sistema nervoso centrale (SNC) ai suoi bersagli distali, consentendo al relè di segnali efferenti di esercitare il controllo motorio e segnali afferenti di fornire feedback sensoriali. Utilizzando la moltitudine di progressi nella genetica dei topi, gli scienziati hanno sviluppato diversi modelli murini per studiare molte malattie / sindromi che affliggono il PNS 1,2,3. Poiché la maggior parte delle patologie neurodegenerative sono multifattoriali con contributi cellulari autonomi e non autonomi 4,5, districare patologie specifiche di cellule / neuroni può fornire informazioni cruciali e nuove sui meccanismi della malattia.

A tal fine, lo sviluppo di topi transgenici batterici con cromosoma artificiale (BAC)-transgenico6 ha permesso l'espressione endogena selettiva di proteine fluorescenti in sottoinsiemi mirati di neuroni. Ad esempio, sono disponibili topi BAC-transgenici, che esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) nei neuroni colinergici7 o glicinergici8, o una variante della proteina fluorescente rossa (tdTomato) nei neuroni parvalbumin-positivi9. In alternativa, l'espressione neuronale selettiva delle proteine fluorescenti può essere ottenuta tramite la tecnologia Cre-loxP 10. Ad esempio, i ceppi di topo che esprimono Cre-ricombinasi in sottoinsiemi di neuroni (ad esempio, colina acetiltransferasi (ChAT)-Cre) possono essere allevati con topi che esprimono una proteina fluorescente (ad esempio, tdTomato o GFP) da un locus costitutivo (ad esempio, Gt(ROSA)26Sor) sotto il controllo di un repressore trascrizionale affiancato da siti loxP11 (ad esempio, generando topi che esprimono tdTomato solo nei neuroni colinergici). Infatti, utilizzando la ricombinazione Cre-loxP, sono stati generati topi transgenici che esprimono proteine fluorescenti gialle negli assoni del tratto corticospinale discendente12.

Inoltre, i recenti progressi nell'editing genetico CRISPR/Cas9, come ORANGE, consentono il tagging fluorescente di più proteine neuronali endogene, con espressione ottenibile alla risoluzione su scala nanometrica13. Inoltre, in combinazione con ceppi di topo che esprimono Cre, ORANGE-CAKE può essere utilizzato per etichettare più proteine endogene in singoli neuroni13. In alternativa, il tracciamento neuronale virale-mediato consente anche l'etichettatura di sottoinsiemi neuronali e può essere ottenuto con combinazioni mirate di sierotipi virali e/o promotori cellulari specifici 14,15,16,17.

Oltre ai metodi di etichettatura neuronale, le linee di topo sono state anche progettate per esprimere proteine reporter mirate a specifici organelli, come i mitocondri che esprimono la proteina fluorescente ciano (Mito.CFP)18 o gli autofagosomi che esprimono GFP (LC3.GFP)19. Inoltre, le linee di topo sono state progettate per valutare la dinamica del calcio specificamente nei neuroni (ad esempio, Thy1.GCaMP)20,21. Complessivamente, con l'avanzamento di tali modelli, nuove applicazioni sperimentali consentono agli scienziati di porre domande biologiche e patologiche più precise sul SNC e sul PNS.

Il ruolo principale dei nervi motori periferici è quello di trasmettere segnali elettrici al muscolo scheletrico per suscitare movimento. Inoltre, e verificandosi su scale temporali più lunghe, messaggi neurochimici e fisiologici sotto forma di diversi organelli (ad esempio, mitocondri, endolisosomi, endosomi di segnalazione) attraversano la rete citoscheletrica in modo unidirezionale o bidirezionale per aiutare a mantenere l'omeostasi neuronale 22,23,24. Le menomazioni nel trasporto assonale hanno conseguenze disastrose per la salute neuronale e sono legate a molte malattie dello sviluppo neurologico e neurodegenerative25. A livello molecolare, le menomazioni nel trasporto assonale possono interrompere gli eventi fisiologici che regolano la segnalazione sinaptica e la plasticità, la trascrizione genica e la traduzione locale in tutto l'assone26,27. Mentre esiste una moltitudine di strumenti per studiare questi eventi in cellule / neuroni in coltura28,29, la valutazione delle dinamiche di trasporto assonale e degli eventi biologici legati agli assonali in vivo sono necessari per confermare le intuizioni chiave sui processi fisiologici e patologici30.

Nel corso degli anni, il Laboratorio Schiavo ha ottimizzato i protocolli per porre diverse domande sul trasporto assonale 31,32,33,34,35,36. Questi esperimenti si sono espansi dalla scoperta che un frammento atossico di neurotossina tetanica (HCT) etichettato fluorescentmente viene internalizzato nei terminali assonali nel muscolo scheletrico attraverso interazioni con nidogeni e polisialogangliosidi37. Una volta interiorizzato, HCT viene trasportato retrogradamente in endosomi di segnalazione Rab7-positivi, contenenti neurotrofine, destinati ai corpi cellulari dei neuroni motori e sensoriali 38,39,40,41. Parallelamente, i progressi nella tecnologia di imaging hanno permesso l'analisi in tempo reale di fasci nervosi periferici e singoli assoni in topi vivi anestetizzati30. La prima incursione nella valutazione della dinamica del trasporto assonale in vivo in patologia ha rivelato menomazioni presintomatiche nel trasporto di endosomi e mitocondri di segnalazione nel modello murino SOD1G93A di sclerosi laterale amiotrofica (SLA)35. È importante sottolineare che è improbabile che questi difetti rappresentino semplicemente conseguenze secondarie della neurodegenerazione, data la scoperta che la perdita di motoneuroni può verificarsi in assenza di perturbazioni di trasporto assonale in un modello murino della malattia di Kennedy42 e in un modello FUS mutante eterozigote di SLA43. Tali deficit di trasporto assonale possono essere corretti nei topi SLA utilizzando inibitori di specifiche chinasi33 o recettori del fattore di crescita34. Inoltre, il trattamento dei neuroni con uno specifico bloccante dell'istone deacetilasi altera il trasporto mitocondriale in vivo36. Più recentemente, riportiamo che la modulazione BDNF-dipendente del trasporto assonale è disregolata in distinti sottotipi di motoneuroni nei topiSLA 44.

Utilizzando un toolkit in continua espansione per la valutazione delle dinamiche di trasporto assonale 28,29, questo protocollo video delinea diverse applicazioni che consentiranno ulteriori approfondimenti su diversi scenari biologici e patologici. In primo luogo, i topi transgenici che esprimono selettivamente proteine fluorescenti nei neuroni colinergici (cioè motoneuroni) vengono utilizzati per discriminare tra assoni motori e sensoriali sia in vivo che ex vivo. L'HCT marcato fluorescentemente viene quindi caricato in endosomi di segnalazione in tre linee transgeniche per differenziare le dinamiche di trasporto assonale in distinti neuroni periferici. Il prossimo protocollo sperimentale descrive in dettaglio un approccio di fluorescenza multiplex per valutare il trasporto mitocondriale specificamente nei motoneuroni allevando topi ChAT.tdTomato con topi Mito-CFP. Infine, vengono fornite istruzioni su come visualizzare contemporaneamente mitocondri ed endosomi di segnalazione all'interno dello stesso assone in vivo.

Protocollo

Tutti i mouse maneggiati e gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con l'Animals (Scientific Procedures) Act (1986) e sono stati approvati dall'University College London - Queen Square Institute of Neurology Ethics Committee.

1. Animali

  1. Ospitare tutti gli animali in gabbie ventilate individualmente in un ambiente a temperatura e umidità controllata e mantenerli su un ciclo luce/buio di 12 ore con accesso ad libitum a cibo e acqua.
  2. Utilizzare topi maschi e femmine dei seguenti ceppi transgenici: 1) topi eterozigoti Tg (Chat-EGFP) GH293Gsat / Mmucd, indicati come topi ChAT.eGFP; 2) eterozigote B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J, indicato come HB9. Topi GFP; e 3) eterozigoti B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J, indicati come topi Mito.CFP.
  3. Generare topi ChAT.tdTomato incrociando topi omozigoti B6;129S6-Chat tm2(cre)Lowl/J, denominati topi ChAT.Cre, con topi omozigoti B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J, denominati topi Rosa26.tdTomato.
  4. Genera topi ChAT.tdTomato::Mito.CFP incrociando topi ChAT.tdTomato eterozigoti con topi Mito.CFP eterozigoti.

2. Iniezioni intramuscolari di HCT fluorescente

  1. Preparazione pre-operatoria
    1. Express HCT (HCT441, residui 875-1315) fusi con un tag migliorato ricco di cisteina nei batteri come proteina di fusione glutatione-S-transferasi come da 45. Etichettare HCT con AlexaFlour555 C2 maleimmide31, dializzare in tampone di dialisi ghiacciato (10 mM HEPES-NaOH, 100 mM NaCl, pH 7,4), congelarlo in azoto liquido e conservarlo a -80 °C. Prima di eseguire esperimenti in vivo , testare HCT in vitro per il successo dell'assorbimento e del trasporto nei neuroni primari.
    2. Diluire la fluorescenza HCT (ad esempio, HCT-555) a una concentrazione finale e sperimentalmente consistente compresa tra 2,5 e 10 μg/μL in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) in un tubo da 0,2 mL. In questa fase, aggiungere più composti / fattori alla soluzione HCT, se necessario (ad esempio, fattore neurotrofico derivato dal cervello).
      NOTA: Il volume finale deve essere appropriato per le dimensioni del muscolo o dei muscoli di interesse. Ad esempio, preparare un volume di iniezione di 3-4 μL per il muscolo tibiale anteriore (TA) e ~ 1 μL per il muscolo soleo più piccolo. Mantenere la concentrazione di lavoro di HCT tra 2,5 e 10 μg/μL indipendentemente dal volume finale.
    3. Mescolare la soluzione HCT utilizzando una pipetta o un vortice e ruotare brevemente verso il basso a bassa velocità utilizzando una centrifuga desktop per raccogliere il liquido e rimuovere bolle di grandi dimensioni. Proteggere l'HCT dalla luce e dal trasporto su ghiaccio.
    4. Utilizzare una micropipetta di vetro tirato per iniezioni intramuscolari ottimali nei muscoli più piccoli (ad esempio, soleo) o per iniezioni di nervo intrasciatico. Tirare micropipette di vetro graduato (come da 46) prima dell'intervento chirurgico.
      NOTA: per abilitare il pipettaggio e limitare il flusso su e fuori la parte posteriore della micropipetta, rompere con cura un piccolo pezzo dalla punta affilata usando una pinza fine sotto un microscopio di dissezione. Fare attenzione a smaltire l'estremità rotta nell'apposito cestino.
    5. Sterilizzare e pulire tutti gli strumenti chirurgici prima dell'uso.
  2. Chirurgia-iniezioni intramuscolari
    1. Prepararsi per l'intervento chirurgico fissando un telo chirurgico sterile su un tappetino termico impostato a 37 ° C. Posizionare e mettere a fuoco il microscopio operatorio. Per iniziare l'intervento chirurgico, disimballare sul drappo chirurgico gli strumenti chirurgici presterilizzati, il nastro chirurgico, i tamponi di cotone sterili, l'etanolo al 70% (v / v) in acqua, la soluzione salina sterile, le suture e un ago Hamilton o micropipette di vetro tirate.
    2. Assicurarsi che la macchina anestetica abbia ossigeno e isoflurano sufficienti per tutta la durata della procedura chirurgica. Dirigere il flusso dell'anestesia verso la camera di induzione e accendere la macchina anestetica.
      1. Per iniziare, utilizzare una portata di ossigeno di 1-2 L / min e 5% di isoflurano. Posizionare il mouse nella camera di induzione per iniziare l'anestesia. Quando il riflesso di raddrizzamento è assente, ridurre l'anestesia al 2-3% di isoflurano, dirigere il flusso dell'anestesia al boccaglio e trasferire il topo al boccaglio situato in un'area separata dello spazio chirurgico.
    3. Assicurarsi che entrambi i riflessi di astinenza corneale e pedale siano assenti prima di radere l'area di pelliccia che copre i muscoli da iniettare. Una volta completato, rimuovere quanta più pelliccia rasata possibile dal mouse utilizzando il lato appiccicoso del nastro chirurgico e posizionare il mouse su bilance per registrare il suo peso pre-chirurgico.
    4. Applicare con attenzione il lubrificante per gli occhi utilizzando un batuffolo di cotone e trasferire il mouse e il boccaglio nell'area chirurgica.
      NOTA: Cercare di limitare la quantità di pelliccia rasata che viene trasferita anche all'area chirurgica. Utilizzare nastro chirurgico per fissare la testa al boccaglio per evitare che il mouse scivoli fuori. Utilizzando un batuffolo di cotone separato, applicare l'etanolo sulla regione rasata per sterilizzare e ridurre la contaminazione della pelliccia.
    5. Posizionare il corpo in base al muscolo da iniettare. Ad esempio, per il TA, posizionare il mouse sul retro e allungare l'arto posteriore a ~ 10 ° dalla linea mediana. In alternativa, per le iniezioni di soleus, posizionare l'animale su un fianco ed estendere l'arto posteriore a ~ 45 ° dalla linea mediana. Quando l'arto posteriore è nella posizione corretta, utilizzare del nastro chirurgico sul piede per evitare movimenti indesiderati durante l'intervento chirurgico.
      NOTA: Le procedure di iniezione per i muscoli TA, gastrocnemio e soleo sono state precedentemente dettagliate32.
    6. Prima di fare un'incisione, confermare che l'anestesia è sufficiente testando il riflesso di prelievo del pedale. Monitorare continuamente l'anestesia e mantenerla durante tutta la procedura chirurgica con una valutazione regolare della respirazione e del riflesso di astinenza.
    7. A questo punto, aspirare la soluzione HCT funzionante nella siringa Hamilton o nella micropipetta di vetro tirata.
    8. Fare una piccola incisione sui muscoli di interesse nelle aree che corrispondono con le regioni della piastra terminale del motore 46,47,48. Forare la fascia esterna sul muscolo e iniettare lentamente l'HCT come da 32. Lasciare la siringa/micropipetta in posizione per 5-10 s prima di ritirarsi lentamente.
    9. Chiudere le incisioni con 1-2 punti di sutura e trasferire il mouse in una gabbia di recupero isolata. Monitorare il topo dopo l'intervento chirurgico per un minimo di 30 minuti, prima di restituirlo alla gabbia di casa. Quando il topo si è ripreso con successo e il monitoraggio post-chirurgico è completo, riportare la gabbia alle normali condizioni abitative.

3. Trasporto assonale in vivo

  1. Esposizione del nervo sciatico
    1. Impostare la camera ambientale del microscopio a 37 °C almeno 1 ora prima dell'imaging.
    2. Prepararsi a esporre il nervo sciatico disponendo il drappo chirurgico, gli strumenti, il nastro, i tamponi di cotone sterili, l'etanolo al 70% e la soluzione salina sterile intorno all'area chirurgica. Assicurarsi che la macchina anestetica abbia riserve sufficienti di ossigeno e isoflurano per un massimo di 2 ore per mouse. Crea un cuneo con parafilm o nastro invisibile tagliandolo in un rettangolo stretto (ad esempio, ~ 1 cm di larghezza per topi più grandi) con una punta angolata e posizionalo sotto il nervo sciatico esposto per aiutare il processo di imaging. Posizionare la camera di induzione sopra un tappetino termico e impostarla sulla temperatura corporea.
      NOTA: Quattro ore sono un tempo sufficiente affinché HCT sia stato assunto e trasportato retrogradamente dal sito di iniezione al nervo sciatico; quindi, un singolo topo può essere preparato per la ri-anestesia dopo questo tempo.
    3. Dirigere il flusso di anestesia nella camera di induzione, accendere la macchina anestetica con una portata di ossigeno di 1-2 L / min e 3-4% di isoflurano e posizionare il mouse nella camera di induzione per iniziare l'anestesia.
      NOTA: poiché l'esperimento di trasporto assonale in vivo è una procedura terminale, non è necessario lubrificare gli occhi.
    4. Quando il riflesso di raddrizzamento è assente, ridurre l'anestesia al 2-3% di isoflurano, dirigere il flusso di anestesia al boccaglio e trasferire il mouse al boccaglio. Utilizzare il nastro chirurgico per fissare la testa al boccaglio, estendere l'arto posteriore mirato a ~ 45 ° dalla linea mediana e utilizzare il nastro chirurgico sul piede per mantenere questa posizione.
      NOTA: l'anestesia ridotta è vantaggiosa a questo punto in quanto può limitare l'impatto degli artefatti respiratori durante il processo di imaging.
    5. Assicurarsi che i riflessi di astinenza corneale e del pedale siano assenti, quindi utilizzare le forbici per tagliare via la pelle sovrastante il nervo sciatico32 (cioè una vasta area che si estende dal midollo spinale centrale all'arto posteriore medio-inferiore). Rimuovere il muscolo bicipite femorale sovrastante, così come qualsiasi altra muscolatura e tessuto connettivo che si trova vicino al nervo sciatico. Evitare di danneggiare il nervo sciatico e i vasi sanguigni circostanti, in particolare quelli situati vicino all'aspetto laterale della rotula / aspetto prossimale della testa del gastrocnemio laterale.
    6. Quando il nervo sciatico intatto è sufficientemente esposto, applicare la soluzione salina sterile preriscaldata nell'area intorno al nervo sciatico per prevenire l'essiccazione. Utilizzare pinze curve per interrompere il tessuto connettivo profondo e posizionare il "cuneo" di parafilm pre-preparato sotto il nervo. Una volta completato, posizionare un batuffolo di cotone imbevuto di soluzione salina sulla zona esposta e spostare il mouse nella camera di induzione posizionata sopra il tappetino termico (impostato a 37 °C), che deve ancora essere riempito con isoflurano in O2.
  2. In vivo imaging assonale
    1. Posizionare un vetro di copertura 22 x 64 mm sullo stadio del microscopio personalizzato e fissarne la posizione con del nastro adesivo. Selezionare e applicare l'olio per immersione all'obiettivo, quindi collegare lo stadio del microscopio al microscopio invertito. Sollevare lentamente l'obiettivo immerso nell'olio fino a quando non viene effettuato il contatto tra l'olio e il vetro di copertura.
      NOTA: gli obiettivi 40x, 1.3 numerical aperture (NA) DIC Plan-Apochromat o 63x, 1.4 NA DIC Plan-Apochromat oil-immersion possono essere utilizzati per visualizzare il trasporto in vivo nel nervo sciatico.
    2. Spostare il boccaglio anestetico sul palco del microscopio e fissare i tubi dell'anestesia con del nastro adesivo per evitare disturbi all'anestesia. Rimuovere il batuffolo di cotone dal nervo sciatico e trasferire il mouse dalla camera di induzione al boccaglio, con il nervo esposto rivolto verso il vetro di copertura. Utilizzare nastro chirurgico per garantire che la testa del topo sia fissata al boccaglio e mantenere il livello più basso ed efficace di anestesia. Sollevare delicatamente il topo per la coda e aggiungere soluzione salina sterile al coperchio vicino al nervo sciatico esposto per limitare l'essiccazione e aiutare l'imaging.
      NOTA: Chiudere tutte le porte della camera ambientale per garantire che l'area rimanga a temperatura corporea.
    3. Utilizzando gli oculari, individuare il nervo sciatico, determinare il punto focale ottimale e selezionare un'area di interesse contenente organelli assonali mobili.
      NOTA: una spiegazione dettagliata di questo processo è stata precedentemente descritta32.
    4. Passare al software del computer facendo clic sul pulsante Acquisizione (o equivalente) e selezionare un'area di interesse. Utilizzare uno zoom digitale per ottenere un ingrandimento totale di >80x e ruotare l'area selezionata per visualizzare orizzontalmente gli assoni (ad esempio, carico retrogrado in movimento da destra a sinistra e carico anterogrado in movimento da sinistra a destra).
      NOTA: i parametri di direzionalità dipendono dall'utente, ma devono rimanere coerenti durante gli esperimenti.
    5. Ottimizza l'intensità del segnale regolando parametri come l'intensità laser (0,2 - 1%), l'apertura stenopeica (1 AU - max), il guadagno (Master) (700 - 1000), l'offset digitale (-50 - 0) e il guadagno digitale (1,0 - 4,0). Per ridurre la potenziale influenza della fototossicità, mantenere l'intensità del laser a ≤ 1% ove possibile, con un'intensità massima del laser del 2%. Modificare tutti gli altri parametri prima di regolare l'intensità del laser per un rilevamento ottimale del segnale.
    6. Fare clic sulla casella Regioni (o equivalente), selezionare un'area rettangolare di interesse, quindi in Modalità di acquisizione (o equivalente), impostare le dimensioni del fotogramma su un minimo di 1024 x 1024 pixel e iniziare l'acquisizione time-lapse di 100-1.000 fotogrammi.
      NOTA: la velocità di acquisizione dei fotogrammi desiderata dipende dall'utente (ad esempio, il trasporto può essere valutato con frame rate compresi tra 0,1 e 6 s) e può essere regolata con parametri software, come regione di interesse, tempo di velocità di scansione, media di acquisizione e direzionalità laser. Ad esempio, per ottenere un frame rate più lento, aumentare l'altezza/larghezza della regione di interesse, acquisire velocità di scansione più lente, aumentare la media di acquisizione e utilizzare la direzionalità laser singola e viceversa per un frame rate più veloce. La velocità di acquisizione dei fotogrammi deve rimanere coerente tra set di dati comparabili perché l'imaging a frequenze diverse può causare incoerenze. Carichi veloci come gli endosomi di segnalazione richiedono un frame rate più veloce (ad esempio 0,1-3 s) rispetto agli organelli più lenti come i mitocondri che possono essere analizzati utilizzando una frequenza più lenta (ad esempio 2,5-6 s).
    7. Mira a catturare un minimo di 10 carichi mobili da un minimo di tre assoni per topo.
      NOTA: sulla base di calcoli di potenza a due campioni e fronte/retro (con potenza standard di 0,8 (1−β) e tasso di errore di tipo I del 5% (α)), le dimensioni del campione di 6-8 sono sufficienti per identificare le differenze di trasporto assonale tra i modelli wild-type e disease35,43.
    8. Una volta completata l'imaging, eutanasizzare immediatamente il topo mentre è sotto anestesia (ad esempio, lussazione cervicale). Il tessuto post mortem, come i muscoli e i nervi sciatici, può anche essere raccolto per ulteriori analisi.

Risultati

Questo documento descrive in dettaglio un protocollo versatile che espande il toolkit di trasporto assonale in vivo nei modelli di roditori. La Figura 1 dimostra che gli assoni dei motoneuroni possono essere differenziati sia dagli assoni dei neuroni sensoriali che dalle cellule di Schwann utilizzando topi transgenici. La Figura 1A illustra l'espressione di eGFP negli assoni motori colinergici da un topo ChAT.eGFP animato e anestetizzato. La Figura 1B utilizza un metodo alternativo per ottenere l'espressione di tdTomato in un nervo appena asportato (cioè senza ulteriore elaborazione tissutale) da un topo ChAT.tdTomato. Quindi, l'uso di ceppi transgenici come ChAT.eGFP, ChAT.tdTomato o Hb9.GFP consente l'etichettatura specifica dell'assone del motore in vivo.

In alternativa, gli assoni possono anche essere identificati iniettando traccianti/marcatori (ad esempio, HCT31,32 o virus che codificano eGFP15) nei muscoli scheletrici. La Figura 2 evidenzia tale applicazione, raffigurando otto assoni ChAT.eGFP-positivi che esprimono robustamente che contengono endosomi di segnalazione HCT-555-positivi (frecce bianche), ~ 4 ore dopo l'iniezione della sonda nel muscolo TA. Usando questo disegno sperimentale, abbiamo potuto identificare i α-motoneuroni innervanti che innervano l'TA, che sono prevalentemente44. Altri cinque assoni ChAT.eGFP con espressione eGFP meno robusta (Figura 2A, asterischi arancioni) erano parzialmente sfocati e probabilmente si trovavano leggermente più in profondità all'interno del nervo sciatico.

Inoltre, abbiamo identificato endosomi di segnalazione HCT-555-positivi negli assoni sensoriali eGFP-negativi (frecce gialle). Come tale, utilizzando questo paradigma sperimentale, si può specificamente valutare e confrontare il trasporto assonale degli endosomi di segnalazione nei neuroni motori rispetto a quelli sensoriali in vivo. In effetti, utilizzando questo ceppo reporter transgenico, abbiamo scoperto che il trasporto degli endosomi di segnalazione negli assoni motori ChAT.eGFP-positivi è più veloce rispetto agli assoni sensoriali ChAT.eGFP-negativi, che possono essere differenziati in modo affidabile utilizzando larghezze assonali43.

Abbiamo precedentemente identificato assoni del motoneurone utilizzando il topo ChAT.eGFP in vivo43. Riportiamo ora che HB9. I topi GFP possono anche essere utilizzati per ottenere l'identificazione degli assoni dei motoneuroni in vivo. In effetti, la Figura 3 presenta una serie di immagini time-lapse di HB9. Assoni GFP contenenti endosomi di segnalazione HCT-555-positivi in movimento retrogrado. Si noti che, a differenza dell'espressione guidata da ChAT, GFP ha un modello più puntato / granulare in HB9. Assoni GFP; la ragione di ciò non è chiara.

Abbiamo precedentemente descritto come monitorare la dinamica mitocondriale in vivo nei nervi sciatici tramite iniezioni di nervo intrasciatico del colorante mirato mitocondriale, tetrametilrodramina, estere etilico, perclorato (TMRE)32,36. Per differenziare in modo affidabile i mitocondri motori da quelli sensoriali, il topo Mito.CFP, che esprime CFP sotto il promotore Thy1 18, può essere incrociato con topi transgenici che esprimono un gene reporter fluorescente in specifici tipi neuronali. Infatti, allevando topi Mito.CFP con topi ChAT.tdTomato (indicati come ChAT.tdTomato::Mito.CFP), abbiamo potuto visualizzare i mitocondri specificamente negli assoni motori, come mostrato nella Figura 4. In questo esempio di multiplex dal vivo, è stato possibile visualizzare cinque assoni ChAT.tdTomato, quattro dei quali contengono mitocondri CFP-positivi. Inoltre, è stato possibile identificare anche il nodo di Ranvier (freccia bianca nel pannello iii). Inoltre, i nodi di Ranvier sono chiaramente rilevabili in ChAT.eGFP, HB9. Mouse GFP e Mito.CFP (non mostrati). Questi ceppi a doppio transgenico consentono l'imaging intravitale time-lapse di topi vivi anestetizzati per monitorare il contenuto mitocondriale specifico del motoneurone e le dinamiche di trasporto assonale.

Infine, gli endosomi e i mitocondri di segnalazione possono essere visualizzati contemporaneamente all'interno degli stessi assoni in vivo iniettando HCT nei muscoli dei topi Mito.CFP (Figura 5). Iniezioni intramuscolari di HCT-555 sono state eseguite nel muscolo TA in un topo Mito.CFP ~ 4 ore prima dell'imaging. Sia i mitocondri (pannelli i) che gli endosomi di segnalazione (pannelli ii) sono stati visualizzati simultaneamente in assoni muscolo-specifici (cioè assoni che innervano il TA). In effetti, si possono osservare organelli in movimento anterogradi (triangoli gialli) e retrogradi (triangoli verdi e cerchi) e organelli in stallo (triangoli e cerchi arancioni). Utilizzando questo paradigma sperimentale, si possono valutare le complesse interazioni funzionali tra mitocondri assonali ed endosomi di segnalazione in vivo. Nel complesso, dimostriamo diversi approcci sperimentali per valutare il trasporto assonale di endosomi di segnalazione e / o mitocondri, in particolare nei motoneuroni colinergici in vivo.

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Figura 1: Assoni motori del nervo sciatico. (A) Immagine rappresentativa a piano singolo di assoni motori eGFP-positivi ottenuta in vivo da un topo ChAT.eGFP. (B) Immagine rappresentativa a piano singolo di assoni motori tdTomato-positivi in un nervo sciatico asportato da un topo ChAT.tdTomato. Le distinzioni nel calibro degli assoni derivano da differenze nell'età e nelle dimensioni del topo. Barre di scala = 50 μm. Abbreviazioni: eGFP = proteina fluorescente verde potenziata; ChAT = colina acetiltransferasi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Trasporto assonale in vivo di endosomi di segnalazione nel motore del nervo sciatico vivo e nei neuroni sensoriali di un topo ChAT.eGFP. (A-C) Immagini rappresentative di assoni colinergici che esprimono eGFP (A) e contenenti endosomi di segnalazione HCT-555-positivi (B) e la fusione (C). Le frecce bianche evidenziano un assone motore eGFP-positivo contenente endosomi di segnalazione HCT-555-positivi, le frecce ciano identificano un assone motorio privo di endosomi di segnalazione HCT-555-positivi e le frecce gialle evidenziano un assone sensoriale eGFP-negativo che trasporta endosomi di segnalazione HCT-555-positivi. Gli asterischi arancioni identificano gli assoni motori con espressione eGFP più debole. Barra della scala = 25 μm. Abbreviazioni: eGFP = proteina fluorescente verde potenziata; ChAT = colina acetiltransferasi; HCT-555 = dominio legante la tossina del tetano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Serie di immagini time-lapse che rappresentano il trasporto assonale in vivo di endosomi di segnalazione in motoneuroni vivi di un HB9. Mouse GFP. (A-D) Immagini time-lapse scattate ogni 3 s raffiguranti assoni del motoneurone che esprimono proteine fluorescenti verdi (i) e contenenti endosomi di segnalazione HCT-555-positivi (ii) e la fusione (iii). Ogni cerchio dello stesso colore identifica lo stesso endosoma in movimento su fotogrammi diversi. Il movimento retrogrado è da destra a sinistra. Barra della scala = 10 μm. Abbreviazioni: GFP = proteina fluorescente verde; HCT-555 = dominio legante la tossina del tetano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: Trasporto assonale in vivo di mitocondri in motoneuroni del nervo sciatico vivo di un ChAT.tdTomato:: Mito.CFP: topo. (A-C) Immagini rappresentative di assoni motori tdTomato-positivi (A), contenenti mitocondri CFP-positivi (B), e la fusione (C). Le immagini inserite i-iii contengono un ingrandimento più elevato da ciascun pannello. La freccia bianca rappresenta un nodo sospetto di Ranvier. Barre di scala = 25 (A-C) e 10 μm (i-iii). Abbreviazioni: ChAT = colina acetiltransferasi; CFP = proteina fluorescente ciano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-5
Figura 5: Serie di immagini time-lapse che rappresentano il trasporto assonale simultaneo in vivo dei mitocondri e gli endosomi di segnalazione nei motoneuroni del nervo sciatico vivo di un topo Mito.CFP. (A-C) Immagini time-lapse scattate ogni 3 s raffiguranti il trasporto assonale di entrambi i mitocondri (i) e gli endosomi di segnalazione (ii) all'interno dello stesso assone del nervo sciatico (iii). I triangoli gialli identificano i carichi in movimento anterogrado, i cerchi / triangoli verdi identificano i carichi in movimento retrogrado e i cerchi / triangoli arancioni identificano i carichi stazionari. Il movimento anterogrado è da sinistra a destra, mentre il movimento retrogrado è nella direzione opposta. Barra di scala = 10 μm. Abbreviazioni: HCT-555 = dominio legante la tossina del tetano; CFP = proteina fluorescente ciano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Questo protocollo descrive in dettaglio i passaggi per valutare il trasporto assonale in vivo di endosomi e mitocondri di segnalazione in assoni intatti del nervo sciatico del topo. In effetti, viene fornita una configurazione sperimentale che consente agli utenti di 1) distinguere i neuroni motori da quelli sensoriali in vivo, in situ ed ex vivo utilizzando topi che esprimono proteine reporter fluorescenti espresse selettivamente nei motoneuroni; 2) valutare il trasporto assonale in vivo di endosomi di segnalazione specificamente negli assoni dei motoneuroni utilizzando tre diversi topi transgenici; 3) studiare il trasporto assonale in vivo dei mitocondri specificamente negli assoni dei motoneuroni; e 4) valutare contemporaneamente le dinamiche di trasporto in vivo degli endosomi e dei mitocondri di segnalazione all'interno dello stesso assone. Questo approccio ha un vasto potenziale per studiare il trasporto assonale in condizioni basali e può essere utilizzato per valutare le perturbazioni patologiche in diverse malattie che colpiscono i nervi motori e sensoriali periferici.

Usando i precedenti paradigmi sperimentali come base 31,32, qui abbiamo modi nuovi e robusti per differenziare il trasporto assonale che si verifica nei neuroni motori rispetto a quelli sensoriali usando topi reporter transgenici. Utilizzando il topo Mito.CFP, questo approccio è stato ulteriormente sviluppato per valutare il trasporto mitocondriale in vivo evitando iniezioni di NERVO INTRASCIATICO di TMRE36. Ciò aggira possibili danni neurali e perturbazioni nel trasporto assonale causati dall'iniezione intranerva della sonda. Inoltre, questo protocollo consente la visualizzazione del trasporto assonale di più organelli negli assoni motori innervando i muscoli con proprietà fisiologiche distinte (ad esempio, muscoli a contrazione rapida e muscoli resistenti alla fatica a contrazione lenta). Pertanto, la segnalazione delle dinamiche di trasporto assonale dell'endosoma e/o mitocondriale può essere valutata in diversi sottoinsiemi di α-motoneuroni44. Inoltre, il trasporto assonale di quegli organelli in contesti patologici può essere valutato anche attraverso incroci con modelli murini di diverse malattie neurodegenerative 1,2,3.

Il toolkit di trasporto assonale è in continua espansione28,29 e sono stati sviluppati protocolli ex vivo per valutare le dinamiche di trasporto utilizzando espianti di corno ventrale di topoin coltura 49 o preparati nervo-muscolo di topo asportati50. Inoltre, lo sviluppo di protocolli per valutare il trasporto assonale nei51 neuroni corticali derivati da cellule staminali pluripotenti umane indotte (hiPSC) o nei motoneuroni spinali derivati da hiPSC52 ha permesso lo studio di neuroni umani con mutazioni che causano malattie. Tali protocolli all'avanguardia nel tessuto di topo e nelle cellule umane possono fornire informazioni critiche sulla funzione neuronale, facilitare nuove scoperte patomeccaniche in modelli di malattie neurodegenerative ed essere utilizzati per testare molecole e strategie terapeutiche.

Diversi passaggi critici devono essere seguiti per il successo dell'implementazione di queste tecniche e alcune note importanti sono state fornite nella sezione protocollo. I principali requisiti per l'imaging intravitale sono il microscopio confocale invertito con inserto dello stadio personalizzato e l'attrezzatura per mantenere l'anestesia e la temperatura ottimale. Infatti, è necessario un sistema anestetico mobile specializzato per 1) induzione dell'anestesia, 2) dissezione / elaborazione dei tessuti (cioè esposizione del nervo sciatico) e 3) mantenimento dell'anestesia durante l'imaging intravitale (come precedentemente dettagliato in 31,32). Soprattutto quando si utilizzano obiettivi di ingrandimento più elevati (ad esempio, 40x o 63x), la profondità dell'anestesia può influire sulla qualità dell'immagine, poiché un'anestesia più profonda induce grandi respiri "gaspy" che si traducono in frequenti spostamenti della messa a fuoco. Tali movimenti di grandi dimensioni avranno senza dubbio un impatto sulle analisi del trasporto post-imaging (ad esempio, il monitoraggio dei carichi utilizzando i plug-in Delle Fiji TrackMate53 o KymoAnalyzer54) poiché i movimenti respiratori producono artefatti nei video time-lapse che possono renderli inadatti al tracciamento automatizzato o richiedere una valutazione più dispendiosa in termini di tempo. Inoltre, abbiamo anche osservato artefatti di imaging causati da arterie pulsanti all'interno del nervo sciatico, che possono essere risolti solo scegliendo una diversa regione di imaging. Il microscopio deve essere dotato di una camera ambientale in grado di mantenere costante la temperatura corporea, poiché la temperatura e il pH influenzano il trasporto assonale55. Inoltre, l'applicazione di analgesici post-operatoria dovrebbe essere evitata, in quanto possono alterare le dinamiche di trasporto56. Se il disegno sperimentale è longitudinale e richiede immagini ripetute (ad esempio, 57), i protocolli di dissezione devono essere opportunamente regolati per essere minimamente invasivi e possono richiedere un'ulteriore approvazione etica / licenza.

Alcune considerazioni sperimentali devono essere tenute a mente. In primo luogo, la maggior parte dei protocolli qui descritti comportano l'uso di topi transgenici che possiedono proteine reporter fluorescenti nei mitocondri o negli assoni dei motoneuroni. Ognuna di queste linee di topo dovrebbe essere allevata e immaginata come emi/eterozigote. Le eccezioni, tuttavia, sono le linee di topo ChAT.Cre e Rosa26.tdTomato che possono essere mantenute separatamente come omozigoti, con la prole emizigote risultante che consente l'espressione di tdTomato nei neuroni colinergici dopo la ricombinazione di Cre-loxP . Quando si incrociano topi emi/eterozigoti transgenici (ad esempio, Mito.CFP) con altri topi emi/eterozigoti transgenici (ad esempio, ChAT.eGFP), è necessario considerare attentamente la strategia di allevamento, poiché ottenere il numero desiderato di progenie a doppio mutante può richiedere molto tempo. Inoltre, quando si alleva la generazione F1 di topi ChAT.Cre e Rosa26.tdTomato (cioè ChAT.tdTomato) con ceppi transgenici aggiuntivi (ad esempio, Mito.CFP), ci si dovrebbe aspettare ancora meno topi portatori dei tripli transgeni desiderati. Inoltre, si deve anche considerare la potenziale sovrapposizione di fluorofori quando si allevano topi a due reporter con proprietà di lunghezza d'onda vicine (ad esempio, Mito-CFP-eccitazione: 435 nm, emissione: 485 nm, allevati con eccitazione ChAT.eGFP: 488 nm, emissione: 510 nm), sebbene possa essere possibile superare questo problema con lo smixing spettrale58.

Questa tecnica ha alcune limitazioni da considerare. In questo lavoro e nei nostri precedenti protocolli31,32, abbiamo mostrato come diversi marcatori geneticamente codificati e diversi metodi di colorazione possono essere utilizzati per etichettare e tracciare organelli distinti in vivo. Tuttavia, non tutte le sonde sono adatte a questo approccio sperimentale. Abbiamo valutato le iniezioni nel muscolo TA o soleo della subunità beta della tossina del colera (CTB)-488 (0,5-1,5 μg / μL ~ 4 h prima dell'imaging), una sonda utilizzata abitualmente per etichettare i corpi cellulari dei motoneuroni in esperimenti traccianti retrogradi in vivo 59,60. Tuttavia, quando iniettato da solo o co-iniettato con HCT-555, l'etichettatura CTB-488 era scarsa nonostante l'uso di concentrazioni simili a quelle utilizzate per il successo del tracciamento retrogrado dei motoneuroni. Pertanto, concludiamo che, nonostante CTB sia un eccellente marcatore in vitro di endosomi di segnalazione in colture neuronali61, HCT rimane la sonda gold standard per identificare gli endosomi di segnalazione in vivo negli assoni del nervo sciatico.

Utilizzando diversi percorsi, abbiamo anche testato sonde utilizzate abitualmente per etichettare i lisosomi, come LysoTracker verde DND-26, e marcatori di idrolasi lisosomiali attive, come BODIPY-FL-pepstatin A per Cathepsin D62 e Magic Red per Cathepsin B, ma senza successo. Abbiamo provato la somministrazione intramuscolare di BODIPY-FL-pepstatina A (2,5 μg nel TA ~ 4 h prima dell'imaging), nonché l'iniezione del nervo intrasciatico di 2 μL di LysoTracker (10 μM), BODIPY-FL-pepstatina A (10 μM) o Magic Red (1/10) 30-60 minuti prima dell'imaging. Nonostante queste sonde che evidenziano il nervo, non siamo stati in grado di trovare organelli chiaramente etichettati. Le sonde si sono accumulate intorno agli assoni, probabilmente trattenute dalle cellule di Schwann. Quindi, l'etichettatura infruttuosa dei lisosomi può essere dovuta a una carente consegna della sonda nei neuroni, sebbene l'esistenza di concentrazioni più adatte non possa essere esclusa. Dato che l'etichettatura TMRE funziona in condizioni simili (ad esempio, iniezioni di nervo intrasciatico), l'intensità di etichettatura può essere dipendente dal colorante e deve essere testata per ciascun marcatore in modo indipendente. Tuttavia, concludiamo che il targeting dei lisosomi in vivo con queste sonde non è fattibile alle concentrazioni sopra indicate.

I metodi di anestesia possono alterare letture fisiologiche distinte (ad esempio, funzione della coclea63 ed elettrofisiologia corticale64); tuttavia, se l'anestesia influenzi il trasporto assonale in vivo nel nervo sciatico è attualmente sconosciuto. Data la ridotta attività neuromuscolare in anestesia indotta da isoflurano, è possibile che la cinetica di trasporto differisca rispetto allo stato di veglia. Tuttavia, l'unico studio in vivo che ha indagato direttamente su questo ha rivelato che il trasporto di vescicole dense nelle proiezioni talamocorticali non differisce tra topi anestetizzati e svegli65. Inoltre, poiché le distinzioni nel trasporto tra topi modello wild-type e malattia sono rilevabili in anestesia35,43, è chiaro che l'esposizione all'isoflurano non impedisce l'identificazione di perturbances nella segnalazione di endosomi o traffico mitocondriale.

Questo protocollo ha altre potenziali applicazioni, che sono state descritte di seguito. L'allevamento dei topi transgenici delineati in questo protocollo (ad esempio, Mito.CFP, ChAT.eGFP) con modelli murini di malattie neurodegenerative 1,2,3 consentirà indagini specifiche per sottotipo e/o carico neuronale. Inoltre, le linee Cre66 di topo di recente sviluppo consentirebbero anche la visualizzazione di proteine reporter fluorescenti in distinte popolazioni di assoni sensoriali. Ad esempio, i topi Rosa26.tdTomato possono essere incrociati con un neuropeptide che esprime il recettore Y 2 (Npy2r). Cre mouse per abilitare la fluorescenza di tdTomato nei nocicettori mielinizzati della fibra A67. Inoltre, il controllo temporale può essere ottenuto anche utilizzando sistemi Cre inducibili (ad esempio, tamoxifene)68. Un'altra potenziale applicazione si basa sulla disponibilità di topi transgenici che esprimono proteine reporter fluorescenti nelle cellule di Schwann. Infatti, i topi S100-GFP69 e PLP-GFP70 consentono l'imaging in vivo e / o in situ delle cellule di Schwann e sono stati in prima linea nella ricerca coinvolta nella migrazione delle cellule di Schwann durante la rigenerazione del nervo periferico.

Oltre a queste applicazioni e complementare al topo Mito.CFP è la disponibilità di diverse linee di topo transgenico che esprimono proteine fluorescenti in organelli distinti, come mitocondri e autofagosomi. Ad esempio, lo studio del trasporto mitocondriale in vivo potrebbe essere possibile con il topo mito::mKate271 o il topo mitoDendra fotoconvertibile57. Inoltre, il trasporto di mitofagosomi in vivo può essere possibile utilizzando il topo mito-Keima72 sensibile al pH e il topo mito-QC73 per le analisi mitofagiche. Inoltre, le difficoltà di marcatura lisosomiale che abbiamo incontrato possono essere superate utilizzando topi che esprimono LAMP1-GFP, con l'avvertenza che LAMP1 è presente anche negli organelli endocitici distinti dai lisosomi74.

In sintesi, abbiamo fornito nuovi modi per valutare il trasporto assonale in vivo di diversi organelli in specifici assoni nervosi periferici da diversi topi transgenici. L'imaging simultaneo di diversi organelli sarà particolarmente importante, date le recenti scoperte di interazioni assonali e co-traffico di organelli come mitocondri ed endosomi 75,76. Riteniamo che i metodi presentati saranno utili per migliorare la comprensione della fisiologia basale degli assoni in vivo e districare importanti meccanismi patologici che guidano la neurodegenerazione dei nervi periferici.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare Robert M. Brownstone (Queen Square Institute of Neurology, University College London) per aver condiviso i topi ChAT-eGFP, ChAT.Cre e Rosa26.tdTomato e Pietro Fratta (Queen Square Institute of Neurology, University College London) per aver condiviso l'HB9. Mouse GFP. Vorremmo ringraziare Elena R. Rhymes, Charlotte J.P. Kremers e Qiuhan Lang (Queen Square Institute of Neurology, University College London) per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da una Junior Non-Clinical Fellowship della Motor Neuron Disease Association (UK) (Tosolini/Oct20/973-799) (APT), dal Wellcome Trust Senior Investigator Awards (107116/Z/15/Z e 223022/Z/21/Z) (GS), un premio uk Dementia Research Institute Foundation (GS); e un Medical Research Council Career Development Award (MR/S006990/1) (JNS).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
PCR da 0,2 mL
etanolo al 70% (v/v) in acqua
AlexaFlour555 C2 maleimmideThermoFisher ScientificA-20346Può anche utilizzare AlexaFlour-488 o -647 Maleimide
B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/JJackson Laboratory7909Rosa26.tdTopi pomodoro
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J topiJackson Laboratory5029HB9. Topi GFP
B6. Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J topiJackson Laboratory7967Mito.CFP topi
B6; 129S6-Chattm2(cre)Lowl/J topiJackson Laboratory6410ChAT.Cre
mouse Computer con controllo del microscopio e software di acquisizione delle immaginiZeissZen
Cotton swab
Centrifuga
Microscopio
Occhio
Pinza curva fineDumont
Pinza dritta fineDumont
Vetrino coprioggetti in vetro (22 x 64 mm, spessore n. 1)
Micropipetta in vetro graduata con marcature in microlitri e stantuffoDrummond Scientific5-000-1001-X10
Tagliacapelli
Siringa da microlitri Hamilton (701 N, volume 10 μ L, ago misura 26 s G, punta smussata, ago L 51 mm)Merck20779
HcT-441N/AN/AVedi Restani et al., 2012 per maggiori dettagli
Pad
Olio da immersione per imaging fluorescente a 37 ° C
Microscopio confocale invertito con camera climaticaZeissLSM 780La maggior parte dei confocali invertiti dovrebbe essere adattabile
Isoflurano
Vaporizzatore/anestesia per isoflurano con pompa a induzione e stabilizzatore per maschera Nastro
magicoinvisibile
Estrattore per micropipette
Soluzione
salina tamponata con fosfato (PBS): 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4, 2,7 mM KCl, 1,8 mM KH2PO4– HCl, pH 7.4
Fattore neurotrofico ricombinante derivato dal cervello umano (BDNF)Peprotech450-02BDNF che può essere co-iniettato con HcT-555
Soluzione salina
Lama del bisturiDumont
Piccole forbici a mollaDumont
Microscopio chirurgico/operatorio
Telo
Sutura
Nastro
Tg(Chat-EGFP) GH293Gsat/Mmucd topiMMRRC000296-UCDChAT.eGFP
Miscelatore
Provetta distillatada tavoloda dissezionelubrificanteriscaldante nastro chirurgicochirurgicachirurgico a vortice

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