Articolo metodologico

Test genetici preimpianto per aneuploidia su una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione basata su semiconduttori

DOI:

10.3791/63493

⸱

17 agosto 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Women, Children, and Reproduction, Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research, 2Department of Biopharmaceutics, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Chinese PLA General Hospital, 4Clinical Laboratory, Northern Theater Air Force Hospital, 5Guangzhou Darui Reproduction Technology Co., Ltd.

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo presenta le procedure generali in laboratorio richieste nei test genetici preimpianto per l'aneuploidia su una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione basata su semiconduttori. Qui presentiamo i passaggi dettagliati dell'amplificazione dell'intero genoma, della selezione dei frammenti di DNA, della costruzione della libreria, della preparazione del modello e del flusso di lavoro del sequenziamento con risultati rappresentativi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il sequenziamento di nuova generazione ha acquisito un'importanza crescente nell'applicazione clinica nella determinazione delle varianti genetiche. Nel test genetico preimpianto, questa tecnica ha i suoi vantaggi unici in termini di scalabilità, produttività e costi. Per il test genetico preimpianto per l'analisi delle aneuploidie, il sistema di sequenziamento di nuova generazione (NGS) basato su semiconduttori qui presentato fornisce un approccio completo per determinare le varianti genetiche strutturali con una risoluzione minima di 8 Mb. Dall'acquisizione del campione al report finale, il processo di lavoro richiede più passaggi con una stretta aderenza ai protocolli. Poiché vari passaggi critici potrebbero determinare l'esito dell'amplificazione, la qualità della libreria, la copertura delle letture e l'output dei dati, le informazioni descrittive con dimostrazione visiva diversa dalle parole potrebbero offrire maggiori dettagli al funzionamento e alla manipolazione, che possono avere un grande impatto sui risultati di tutti i passaggi critici. I metodi qui presentati mostreranno le procedure coinvolte nell'amplificazione dell'intero genoma (WGA) delle cellule di Trophectoderm (TE) sottoposte a biopsia, nella costruzione della libreria genomica, nella gestione del sequenziatore e, infine, nella generazione di report sulle varianti del numero di copie.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'aneuploidia è l'anomalia nel numero di cromosomi dovuta alla presenza di uno o più cromosomi extra o all'assenza di uno o più cromosomi. Gli embrioni che portano qualche tipo di aneuploidia, come la perdita di un cromosoma X (sindrome di Turner), copie extra di autosomi, come trisomie dell'autosoma 21 (sindrome di Down), 13 (sindrome di Patau) e 18 (sindrome di Edwards), o cromosomi sessuali extra come 47, XXY (sindrome di Klinefelter) e 47, XXX (sindrome Triple X), possono sopravvivere a termine con difetti alla nascita1. L'aneuploidia è la causa principale degli aborti spontanei del primo trimestre e del fallimento della fecondazione in vitro (IVF)2. È stato riferito che il tasso di aneuploidia potrebbe variare dal 25,4% all'84,5% attraverso i diversi strati di età del ciclo naturale e del gruppo di controllo medicato nella pratica della fecondazione in vitro3.

La tecnologia di sequenziamento di nuova generazione sta diventando selvaggiamente applicata nella determinazione clinica delle informazioni genetiche; Fornisce un accesso pratico alla sequenza del genoma con efficienza e throughput elevato. In particolare, il sequenziamento di nuova generazione ha rivoluzionato anche la diagnosi di disturbi con fattori genetici e test per l'anomalia nel genoma4. Utilizzando la tecnologia di sequenziamento dei semiconduttori per trasferire direttamente i segnali chimici nel sequenziamento della bioreazione in dati digitali, il sistema di sequenza basato su semiconduttori fornisce un rilevamento diretto e in tempo reale per sequenziare i dati in 3-7 h 5,6.

In una procedura di fecondazione in vitro, il test genetico preimpianto (PGT) indaga il profilo genetico dell'embrione prima di essere trasferito nell'utero per migliorare l'esito della fecondazione in vitro e ridurre il rischio di malattie genetiche nei neonati 1,7. Nella PGT combinata con le tecniche NGS, il materiale genetico estratto da meno di 10 cellule viene amplificato con kit di amplificazione dell'intero genoma o un reagente di amplificazione dell'intero genoma sviluppato in modo indipendente. Ciò richiede solo una fase nella fase di amplificazione e non richiede pre-amplificazione, per ottenere prodotti di amplificazione dell'intero genoma. Primer o pannelli per la variante del numero di copie e il sequenziamento speciale dei loci genici sono progettati e applicati nella libreria costruita.

Un tipico flusso di lavoro di test genetici preimpianto-aneuploidia (PGT-A) in NGS comporta procedure seriali e richiede un intenso carico di lavoro del personale di laboratorio8. Alcuni errori di rollback delle procedure causati da errori possono portare a perdite indesiderate di tempo e risorse del laboratorio. Una procedura operativa standard (SOP) concisa e chiara per il flusso di lavoro PGS-NGS è utile; Tuttavia, i protocolli in formato Word non possono presentare informazioni più dettagliate sull'elaborazione dei campioni, sulla manipolazione dei dispositivi e sulle impostazioni degli strumenti, che possono essere visualizzate in un protocollo video. In questo articolo, un flusso di lavoro convalidato combinato con una dimostrazione visualizzata dei dettagli operativi potrebbe offrire protocolli di riferimento più diretti e intuitivi nella pratica PGT su una piattaforma di sequenziamento dei semiconduttori.

Il protocollo qui descrive un metodo che supporta il dosaggio di fino a 16 biopsie embrionali in parallelo. Per lotti più grandi, si consiglia di utilizzare un protocollo commerciale basato su kit per il sequenziamento dei semiconduttori, come Reproes-PGS.

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Protocollo

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Tutti i protocolli e la biopsia del trofoectoderma (TE) (sezione 1.1.1.1) applicati in questo studio sono stati esaminati e approvati dal comitato etico di ricerca umana dell'ospedale n. 924 il 18 settembre 2017 (NO: PLA924-2017-59). I pazienti/partecipanti hanno fornito il loro consenso informato scritto per partecipare a questo studio.

1. Isolamento del DNA dalla biopsia dell'embrione umano e amplificazione genomica completa

  1. Protocollo per l'amplificazione dell'intero genoma 9,10
    NOTA: Pico PLEX WGA Kit viene utilizzato per eseguire l'amplificazione dell'intero genoma.
    1. Raccolta e conservazione dei campioni
      1. Biopsia del trophectoderm: prelevare una media di sei-nove cellule dall'ernia TE dell'embrione D5/6 dopo la schiusa assistita per ottenere una quantità qualificata di DNA per la successiva amplificazione.
      2. Trasferire le cellule campione in una provetta PCR in 5 μL di PBS.
      3. Congelare immediatamente i campioni a -80 °C se il protocollo non procede direttamente all'estrazione del DNA.
    2. Lisi cellulare
      NOTA: il file supplementare 1 elenca e serve come riferimento per i volumi raccomandati di ciascun componente durante la preparazione della miscela master durante la lisi cellulare e l'amplificazione dell'intero genoma di lotti di 1, 8, 16 e 32 campioni (con overage per correggere errori di pipettaggio). Quando si formulano altri master mix di questo protocollo, il volume di ciascun componente viene ulteriormente aumentato per adattarsi al consumo di componenti causato da pipettaggi ripetuti. Tutte le centrifughe brevi vengono eseguite su una mini centrifuga da tavolo per 2-10 s a temperatura ambiente (RT), con un RPM fisso di 10.000 con una forza centrifuga di 5.300 x g. La forza centrifuga deve essere compresa tra 2.000 x g e 12.000 x g.
      1. Preparare la miscela di lisi cellulare con 4,8 μL di tampone di diluizione dell'enzima di estrazione e 0,2 μL dell'enzima di estrazione cellulare per campione.
      2. Pipettare 5 μL della lisi cellulare appena preparata mescolare in ciascun campione di cellule da 5 μL in provette PCR e centrifugare brevemente la provetta a RT per 5 s. Non vortice il tubo.
      3. Incubare il campione in un termociclatore come segue: 75 °C, 10 min; 95 °C, 4 min; 25 °C, 14 min. Centrifugare brevemente (5 s) il tubo dopo l'incubazione.
    3. Pre-amplificazione dell'intero genoma del DNA
      1. Preparare la miscela di pre-amplificazione con 4,8 μL del buffer preamplificatore e 0,2 μL dell'enzima preamplificatore per campione.
      2. Pipettare 5 μL della miscela di preamplificazione nelle provette del campione attraverso le pareti della provetta e centrifugare brevemente per 3 s. Evitare che la punta raggiunga il fondo del tubo e non vortice il tubo.
      3. Incubare il campione secondo il programma di termociclatori menzionato nella tabella 1.
    4. Amplificazione del DNA dell'intero genoma
      1. Centrifugare brevemente il campione per 5 s e posizionare il prodotto di incubazione preamplificatore su ghiaccio.
      2. Preparare l'intera miscela di amplificazione del genoma con 25 μL del tampone di amplificazione, 0,8 μL dell'enzima di amplificazione e 34,2 μL di acqua priva di nucleasi per campione.
      3. Miscelare 60 μL della miscela di amplificazione dell'intero genoma appena preparata con i 15 μL del prodotto di incubazione preamplificato; il volume totale deve essere di 75 μL. Centrifugare brevemente per 5 s. Evitare che la punta raggiunga il fondo del tubo e non vortice il tubo.
      4. Posizionare il tubo PCR sul termociclatore ed eseguire il programma del termociclatore menzionato nella Tabella 2.
      5. Centrifugare brevemente i tubi per 5 s e trasferire i prodotti in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 ml.
      6. Quantificare la concentrazione del prodotto WGA con un fluorometro11. I campioni possono essere conservati temporalmente a -20°C per meno di 2 mesi se non si procede alla fase successiva.
  2. Protocollo dei reagenti WGA sviluppati in modo indipendente.
    1. Raccolta e conservazione dei campioni
      1. Prelevare le cellule dall'embrione D5/6 dopo la schiusa assistita per la successiva amplificazione.
      2. Trasferire le cellule campione con 1,5 μL di PBS in una provetta PCR contenente 2 μL di PBS.
        NOTA: PBS è privo di Mg 2+ e Ca2+.
      3. Congelare immediatamente i campioni a -80 °C se non si procede direttamente al protocollo di estrazione del DNA.
    2. Lisi cellulare
      1. Fondere il tampone di lisi cellulare (40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM acido etilenglicole tetraacetico (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM pirofosfato di sodio, 2 mM β-glicerofosfato, 0,1% SDS) a RT e posizionarlo sul ghiaccio. Aggiungere 2 μL di tampone di lisi cellulare a ciascun campione e centrifugare brevemente (5 s).
        NOTA: non vorticare il tubo ed evitare che la punta della pipetta tocchi la superficie liquida nel tubo per evitare di portare le cellule o il DNA fuori dal sistema di reazione.
      2. Incubare il campione in un termociclatore come segue: 55 °C, 20 min; 95 °C, 10 min; 4 °C, tenere. Centrifugare brevemente il tubo a RT per 10 s dopo l'incubazione.
    3. Amplificazione del DNA dell'intero genoma
      1. Centrifugare brevemente il prodotto di lisi cellulare per 5 s e metterlo su ghiaccio.
      2. Preparare l'intera miscela di amplificazione del genoma per ciascun campione miscelando con 16 μL di soluzione premiscelata di amplificazione, 1 μL di enzima di amplificazione e 28 μL di acqua priva di nucleasi. Mescolare delicatamente, centrifugare brevemente (5 s) e mettere il composto su ghiaccio. Non vortice il tubo.
      3. Pipettare 45 μL della miscela di amplificazione dell'intero genoma appena preparata nel prodotto di lisi cellulare preparato al punto 1.2.2.2; Mescolare delicatamente e centrifugare brevemente per 5 s.
        NOTA: non vorticare il tubo ed evitare che la punta della pipetta tocchi il liquido nel tubo.
      4. Posizionare il tubo PCR sul termociclatore ed eseguire il programma come descritto nella Tabella 3.
      5. Centrifugare brevemente i tubi per 5 secondi e trasferire i prodotti in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 ml.
      6. Quantificare la concentrazione del prodotto WGA con un fluorometro11 e registrare i risultati sulla scheda QA (analisi della qualità). I prodotti con concentrazioni qualificate possono essere conservati temporaneamente a -20 °C per meno di 2 mesi se non si procede alla fase successiva.

2. Selezione del frammento di amplificazione

NOTA: i materiali utilizzati in questa sezione sono disponibili nel Kit di preparazione della biblioteca (Tabella dei materiali).

  1. Preparazione prima di iniziare
    1. Equilibrare le sfere magnetiche (n x 100 μL) per la purificazione a RT per 30 min.
    2. Ripristinare il prodotto WGA precedente su RT. Vortex il prodotto a RT per 30 s prima di centrifugarlo brevemente.
    3. Preparare etanolo fresco al 70%.
  2. Procedura di selezione dei frammenti
    1. Pipettare 25 μL dei prodotti WGA e trasferirli in una provetta da centrifuga da 1,5 mL con 25 μL di acqua priva di nucleasi precaricata.
    2. Vortice e mescolare bene le perle di purificazione del DNA. Aliquot 50 μL di esso in ogni provetta (campione originale: perle (volume) = 1:1), vortice e centrifuga brevemente (5 s). Impostare il tubo per 5 minuti su RT per il processo di legame del DNA.
    3. Inserire il tubo di centrifuga da 1,5 mL in un rack magnetico e attendere che tutte le sfere magnetiche siano attratte dalla parete laterale del tubo. Trasferire con cautela il surnatante in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 ml. Evitare di pipettare le perline.
    4. Secondo il volume del campione originale, pipettare brevemente 30 μL (campione originale: perline (volume) = 1:0.6) di sfere magnetiche, vortice e centrifuga (5 s). Impostare il tubo per 5 minuti su RT per il processo di legame del DNA.
    5. Inserire i tubi della centrifuga da 1,5 mL nel rack del magnete e attendere 5 minuti fino a quando tutte le sfere magnetiche sono attratte dalla parete laterale del tubo. Rimuovere con cautela e scartare il surnatante. Evitare di pipettare le perline.
    6. Pipettare 300 μL di etanolo al 70% nel tubo della centrifuga da 1,5 ml, ruotare delicatamente il tubo due volte con un angolo di 180° e spostare le perline lungo la parete del tubo per un lavaggio accurato. Pipettare ed eliminare il surnatante. Evitare di pipettare le perline.
    7. Ripetere la procedura di lavaggio una volta.
    8. Rimuovere il tubo della centrifuga da 1,5 mL dalla cremagliera magnetica e centrifugare brevemente (5 s). Inserire nuovamente i tubi nel rack magnetico e attendere che tutte le sfere magnetiche siano attratte dalla parete laterale del tubo.
    9. Pipettare con attenzione il liquido rimanente sul fondo. Tenere il tubo aperto per asciugare le perline a RT per 3-5 minuti. Tenere l'umidità fuori dalle perline.
      NOTA: Chiudere immediatamente il coperchio se emergono crepe sul pellet di perline.
    10. Rimuovere i tubi dal rack magnetico, pipettare 25-30 μL del tampone di eluizione del DNA in un tubo e chiudere il cappuccio e il vortice. Centrifugare brevemente (5 s) per portare il liquido torbido sul fondo del tubo e impostare il tubo su RT per 5 minuti.
    11. Inserire nuovamente i tubi nei rack magnetici e attendere che tutte le perline siano attratte dalla parete laterale del tubo e che il surnatante diventi trasparente. Trasferire con cautela la soluzione di DNA in nuove provette da centrifuga da 1,5 ml. Evitare di pipettare le perline.
    12. Quantificare la concentrazione di DNA dopo la selezione del frammento con un fluorometro11, conservarlo a -20°C. Tipicamente, la concentrazione del frammento di DNA selezionato varia da 1,5-2,4 ng/μL.

3. Preparazione della biblioteca del DNA12

NOTA: i materiali utilizzati in questa sezione sono disponibili nel Kit di preparazione della biblioteca (Tabella dei materiali).

  1. Fine riparazione
    1. Equilibrare le sfere magnetiche a RT per 30 minuti.
    2. Equilibrare il prodotto del DNA della selezione del frammento nel punto 2.2.12 di RT. Controllare e registrare il tag su ciascun flaconcino contenente il DNA.
    3. Preparare il sistema di riparazione finale del DNA con 30 μL di prodotti a base di DNA, 10 μL di tampone riparatore finale, 0,5 μL di enzima riparatore finale e 9,5 μL di acqua priva di nucleasi in una provetta da centrifuga da 1,5 ml. Vortice il tubo per 30 s e centrifugare brevemente (5 s) a RT per ottenere tutto il liquido sul fondo del tubo.
    4. Incubare a 25 °C per 30 minuti e centrifugare brevemente (5 s) la provetta dopo l'incubazione.
    5. Vortice o miscelazione inversa delle sfere magnetiche e trasferire 75 μL delle sfere magnetiche in un tubo contenente campioni di DNA riparati alla fine (campione originale: perline (volume) = 1:1.5). Pipetta o vortice delicato per mescolare bene le perle e centrifugare brevemente (5 s) per far girare tutta la sospensione fino al fondo del tubo. Impostare il tubo per 5 minuti su RT per il processo di legame del DNA. Capovolgere delicatamente i tubi per mantenere le perle disperse.
    6. Inserire i tubi della centrifuga nel rack del magnete e attendere 5 minuti fino a quando tutte le sfere magnetiche sono attratte dalla parete laterale e il surnatante diventa trasparente. Rimuovere il surnatante ed evitare di pipettare le perline, mantenendo i tubi sul rack durante il pipettaggio.
    7. Trasferire 300 μL di etanolo al 70% appena preparato nei tubi, ruotare delicatamente i tubi due volte con un angolo di 180 ° e spostare le perline lungo la parete del tubo per un lavaggio accurato. Pipettare ed eliminare il surnatante. Evitare di pipettare le perline.
    8. Ripetere la procedura di lavaggio una volta.
    9. Rimuovere le provette da centrifuga da 1,5 mL dalla cremagliera magnetica e centrifugare brevemente (5 s). Inserire nuovamente i tubi nel rack magnetico e attendere 5 minuti fino a quando tutte le sfere magnetiche sono attratte dalla parete laterale del tubo.
    10. Pipettare con attenzione il liquido rimanente sul fondo. Aprire il tappo delle provette da centrifuga da 1,5 ml e asciugare le perline a RT per 3-5 minuti. Tenere l'umidità fuori dalle perline.
      NOTA: Chiudere immediatamente il coperchio se emergono crepe sul pellet di perline.
    11. Pipettare 33 μL di tampone di eluizione del DNA in un tubo, chiudere il tappo e il vortice. Centrifugare brevemente (5 s) per ottenere la sospensione torbida sul fondo del tubo e impostare il tubo su RT per 5 minuti.
    12. Inserire nuovamente i tubi nei rack magnetici e attendere che tutte le perline siano attratte dalla parete laterale e la soluzione diventi trasparente. Trasferire con cautela la soluzione di DNA in nuove provette da centrifuga da 1,5 ml con l'etichetta appropriata, evitando di pipettare le perle.
  2. Legatura dei codici a barre
    1. Posizionare i reagenti di legatura dei codici a barre al punto 3.2.2 sul ghiaccio per sciogliere tutti i reagenti congelati.
    2. Preparare il sistema di legatura con 32 μL di prodotti a base di DNA riparati alla fine, 10 μL di acqua priva di nucleasi, 5 μL di tampone ligasi, 1 μL di ligasi e 1 μL di P1 adattare in una provetta da centrifuga da 1,5 ml. Pipettare 1 μL di ciascun reagente del codice a barre nella miscela di soluzione nel tubo per un campione, vortice per 5 s e centrifugare brevemente (5 s) per ottenere tutto il liquido sul fondo del tubo.
      NOTA: quando si aggiungono i codici a barre, verificare che il numero di codici a barre e campioni corrisponda; aprire una sola fiala di codici a barre alla volta per evitare l'inquinamento misto dei codici a barre; Cambia i guanti per ogni cinque o sei codici a barre aggiunti.
    3. Incubare le provette a 25 °C per 30 min.
    4. Pipetta 75 μL (campione originale: perline (volume) = 1:1.5) delle sfere magnetiche in un tubo e pipetta o vortice delicato per mescolare bene le perle. Centrifugare brevemente (5 s) per far girare tutta la sospensione verso il basso, evitando l'aggregazione delle perline. Impostare il tubo per 5 minuti su RT per il processo di legame del DNA. Capovolgere delicatamente i tubi per mantenere le perle disperse.
    5. Inserire i tubi della centrifuga nel rack del magnete e attendere 5 minuti fino a quando tutte le sfere magnetiche sono attratte dalla parete laterale e il surnatante diventa trasparente. Rimuovere il surnatante ed evitare di pipettare le perline, mantenendo i tubi sul rack durante il pipettaggio.
    6. Trasferire 300 μL di etanolo al 70% appena preparato in tubi, ruotare delicatamente i tubi due volte con un angolo di 180 ° e spostare le perline lungo la parete del tubo per un lavaggio accurato. Pipettare ed eliminare il surnatante. Evitare di pipettare le perline.
    7. Ripetere la procedura di lavaggio una volta.
    8. Rimuovere le provette da centrifuga da 1,5 mL dalla cremagliera magnetica e centrifugare brevemente (5 s). Inserire nuovamente i tubi nel rack magnetico e attendere 5 minuti fino a quando tutte le sfere magnetiche non vengono attratte dalla parete laterale del tubo. Pipettare con attenzione il surnatante rimanente sul fondo.
    9. Tenere il tappo del tubo aperto per asciugare le perline a RT per 3-5 minuti. Tenere l'umidità fuori dalle perline.
      NOTA: Chiudere immediatamente il coperchio se emergono crepe sul pellet di perline.
    10. Pipettare 15 μL del tampone di eluizione del DNA nella provetta. Risciacquare il pellet delle perline fino al fondo del tubo, sigillare il tappo e il vortice. Centrifugare brevemente (5 s) per ottenere la sospensione torbida sul fondo del tubo e mantenere il tubo stabile a RT per 5 minuti.
  3. Amplificazione dei frammenti
    1. Mettere i reagenti di costruzione della libreria sul ghiaccio quando il reagente congelato si dissolve.
    2. Trasferire 47,5 μL della miscela enzimatica e 2,5 μL della miscela di primer nel tubo contenente DNA eluito e perline, vortice per 5 s e centrifugare brevemente (5 s) per ottenere tutto il liquido sul fondo del tubo.
    3. Impostare il tubo su RT per 5 minuti. Inserire nuovamente i tubi in rack magnetici e attendere che tutte le perline siano attratte dalla parete laterale e il surnatante diventi trasparente. Trasferire con cautela la soluzione di DNA in provette PCR da 0,2 ml con etichette contrassegnate chiaramente ed evitare di pipettare le perle.
    4. Incubare il campione in un termociclatore impostato con il seguente programma: 72°C, 20 min; 98 °C, 2 min; 98 °C, 15 s; 62 °C, 15 s; 70 °C, 1 min (6 cicli); 70 °C, 5 min. Centrifugare brevemente (5 s) il tubo al termine della reazione e conservare i prodotti a 4 °C.
    5. Trasferire i prodotti PCR in una provetta da centrifuga da 1,5 ml (attacco basso). Aggiungere 97,5 μL (volume originale del campione: perline (volume) = 1:1,5) di sfere magnetiche nel tubo al termine della reazione, pipettare o vortice delicatamente per mescolare bene le perle e centrifugare brevemente (5 s) per far girare tutto il liquido verso il basso. Evitare l'aggregazione delle perline. Impostare il tubo su RT per 5 minuti. Capovolgere delicatamente i tubi per mantenere le perle disperse.
    6. Inserire i tubi della centrifuga nel rack dei magneti e attendere 5 minuti fino a quando tutte le sfere magnetiche sono attratte dalla parete laterale e il surnatante diventa trasparente. Rimuovere il surnatante, evitare di pipettare le perline e mantenere i tubi fermi sul rack.
    7. Trasferire 300 μL di etanolo al 70% appena preparato in tubi, ruotare delicatamente i tubi due volte con un angolo di 180 ° e spostare le perline lungo la parete del tubo per un lavaggio accurato. Pipettare ed eliminare il surnatante. Evitare di pipettare le perline.
    8. Ripetere la procedura di lavaggio una volta.
    9. Rimuovere il tubo da centrifuga da 1,5 mL dalla cremagliera magnetica e centrifugare brevemente (5 s). Inserire nuovamente il tubo nel rack magnetico e attendere 5 minuti fino a quando tutte le sfere magnetiche sono attratte dalla parete laterale del tubo. Pipettare con attenzione il liquido rimanente sul fondo.
    10. Tenere il tappo del tubo aperto per asciugare le perline a RT per 3-5 minuti. Tenere l'umidità fuori dalle perline.
      NOTA: Chiudere immediatamente il coperchio se emergono delle crepe sul pellet delle perline.
    11. Pipettare 22 μL del tampone di eluizione del DNA nel tubo, sciacquare il pellet delle perle e chiudere il tappo e il vortice. Centrifugare brevemente (5 s) per portare il liquido torbido sul fondo del tubo e impostare il tubo su RT per 5 minuti.
    12. Quantificare la concentrazione della libreria di DNA costruita con un fluorometro11 e conservare la libreria di DNA costruita a -20 °C; la concentrazione del frammento di DNA selezionato varia da 0,6 a 10 ng/μL. Ricodificare le informazioni della libreria nel database della biblioteca e memorizzare i campioni di conseguenza.

4. Preparazione del modello di sequenziamento13,14

NOTA: i materiali utilizzati in questa sezione sono disponibili nel set di kit di preparazione del modello (Reagenti/Soluzioni/Materiali) del kit universale per le reazioni di sequenziamento (Tabella dei materiali).

  1. Mix di librerie
    1. Compilare il modulo di un foglio di record pre-esecuzione nel sistema server e contrassegnare la provetta con la concentrazione della libreria e il numero del codice a barre. Evitare di utilizzare gli stessi codici a barre su campioni diversi in un'unica esecuzione.
    2. Vortice e mescolare il campione della libreria, e centrifugare brevemente (5 s). Diluire tutti i campioni a 100 pM con acqua priva di nucleasi, vortice per 30 s e centrifugare brevemente il campione.
      NOTA: Dato che il DNA ha una lunghezza media di 260 bp e 1 bp è 660 g/mol, calcolare la conversione di ng/μL in pM usando la seguente equazione: 1 ng/μL = 5.827,5 pM/L.
    3. Pipettare 10 μL di 100 pM in una provetta da centrifuga da 1,5 mL, vortice per 30 s e centrifugare brevemente per 2 s. Mantieni la libreria mista sul ghiaccio.
  2. Preparazione del modello
    1. Avviare il sistema di amplificazione del modello e scegliere il programma pulito. Aggiungere l'olio di reazione a 1/2 del tubo e aggiungere la soluzione di rottura dell'emulsionante a 1/3 del tubo.
    2. Verificare che la piastra di amplificazione e l'adattatore di lavaggio siano posizionati in posizione ON . Pulire la bottiglia dei rifiuti e inserire un ago in una nuova provetta da centrifuga da 50 ml per raccogliere i rifiuti. Confermare i passaggi elaborati sullo schermo del sistema di amplificazione del modello. Premere AVANTI per avviare un programma pulito, che richiederà circa 15 minuti.
    3. Sostituire la piastra di amplificazione con una nuova dopo il programma pulito, inserire i tubi di raccolta contenenti 150 μL di soluzione di rottura II nel rotore e posizionare il ponte sui tubi di raccolta. Aggiungere l'olio di reazione a 1/2 del tubo e la soluzione di rottura dell'emulsionante a 1/3 del tubo.
    4. Emulsionare la preparazione del reagente PCR: equilibrare il tampone emulsionato per PCR a RT fino a quando non si dissolve, centrifugare brevemente (5 s) tutti i reagenti e metterli su ghiaccio prima dell'uso.
    5. Pipettare 120 μL della miscela enzimatica emulsionata PCR, 100 μL di tampone di particelle a sfera ionica (ISP), 170,5 μL di acqua priva di nucleasi e 9,5 μL della libreria mista (100 pM) in una provetta contenente 2.000 μL di tampone emulsionato per PCR. Mescolare bene la soluzione con pipettaggio ripetuto.
      NOTA: La soluzione mista deve essere caricata sul sistema di amplificazione della dima entro 15 minuti; eseguire tutte le procedure presso RT.
    6. Posizionare un nuovo filtro per la preparazione del modello stabile sul rack del tubo con il portale del campione verso l'alto. Vortice la soluzione per 5 s, centrifugare brevemente (5 s) e trasferire la soluzione nel portale del campione del filtro dopo aver ripetutamente pipettellato 800 μL tre volte. Centrifugare il tubo per diminuire le bolle prima dell'ultima iniezione. Evitare di iniettare aria nel filtro. Iniettare 200 μL di olio di reazione II dopo la soluzione miscelata.
    7. Ruotare il portale campione del filtro verso il basso e sostituire l'adattamento di lavaggio con il filtro. Inserire l'ago del campione nel foro centrale del coperchio del rotore e quindi premere l'ago verso il basso.
    8. Premere il pulsante RUN sullo schermo, scegliere il programma in base al kit corrispondente e premere ASSISTITO per controllare tutti i passaggi. Premere AVANTI fino all'avvio della corsa; Ci vogliono circa 4,5 ore per finire.
    9. Premere AVANTI al termine del programma; Il sistema avvierà una centrifugazione di 10 minuti. Quando la centrifugazione si interrompe, premere il pulsante Open Lid e spostare i tubi di raccolta nei rack. Se la procedura non passa al passaggio successivo entro 15 minuti, premere su Final Spin per centrifugare nuovamente.
    10. Rimuovere il surnatante nel tubo di raccolta, lasciando 100 μL di soluzione nella provetta. Miscelare il campione rimanente mediante pipettaggio e trasferire il campione nelle nuove provette da centrifuga da 1,5 mL contrassegnate OT (sistema One touch 2).
      NOTA: quando si pipetta il surnatante, evitare di toccare il fondo del tubo lungo il lato.
    11. Pipettare 100 μL di acqua priva di nucleasi in ciascuna delle provette di raccolta e trasferire la soluzione alla provetta OT lavata con pipettaggio ripetuto. Aggiungere 600 μL di acqua priva di nucleasi al tubo OT per rendere il volume totale 1 ml, vortice per 30 s, e centrifugare a 15.500 x g per 8 minuti.
    12. Rimuovere delicatamente il surnatante nel tubo OT con 100 μL rimanenti e utilizzare la punta per eliminare accuratamente lo strato di olio. Aggiungere 900 μL di acqua priva di nucleasi, vortice per 30 s e centrifugare a 15.500 x g per 8 minuti.
    13. Rimuovere il surnatante fino a quando non rimangono 20 μL, aggiungere la soluzione di sospensione del modello per rendere il volume 100 μL, vortice per 30 s e centrifugare brevemente per 2 s.
      NOTA: La soluzione ottenuta in questo passaggio deve procedere alla fase successiva in meno di 12 ore.
    14. Esegui il programma pulito sul sistema di amplificazione del modello prima di spegnerne l'alimentazione.
  3. Arricchimento del modello
    1. Preparare la miscela di fusione con 280 μL di interpolazione-80 e 40 μL di 1 M NaOH.
    2. Lavare le perline C1. Vortex la soluzione di perline C1 per 30 s. Trasferire 100 μL di perline in una provetta da centrifuga da 1,5 ml, inserire la provetta su una cremagliera magnetica per 2 minuti ed eliminare il surnatante.
    3. Trasferire 1 mL della soluzione di lavaggio delle perline C1 nel tubo e nel vortice per 30 s. Centrifugare brevemente (5 s), inserire il tubo nella cremagliera magnetica per 2 minuti ed eliminare il surnatante. Pipettare 130 μL di soluzione di risospensione del tallone C1 nel tubo e mescolare le perle mediante pipettaggio ripetuto. Evita di creare bolle.
    4. Caricare 100 μL della libreria diluita, 130 μL di perline C1, 300 μL x 3 di soluzione di lavaggio della diamante e 300 μL della soluzione di fusione sulle strisce a otto pozzetti, come mostrato nella Figura 1.
    5. Installare le strisce a otto pozzetti sul modulo di arricchimento, caricare la punta del pipettaggio e posizionare il tubo della centrifuga da 200 μL nella posizione di raccolta. Premere su START per eseguire il programma; Ci vogliono circa 35 min.
    6. Il campione verrà raccolto automaticamente nella provetta da centrifuga da 200 μL; Chiudere il coperchio e centrifugarlo a 15.500 x g per 5 minuti. Controllare il fondo del tubo per verificare se rimangono perline C1.
    7. Se rimangono perline C1, pipettare ripetutamente la soluzione del modello 10x e inserire il tubo sul rack magnetico per 4 minuti. Trasferire tutto il surnatante in una nuova provetta da centrifuga da 0,2 mL e centrifugare a 15.500 x g per 5 minuti.
    8. Se non rimangono sfere C1 visibili, scartare il surnatante fino a quando non rimangono 10 μL, aggiungere 200 μL di acqua priva di nucleasi e mescolare mediante pipettaggio 10x. Centrifugare a 15.500 x g per 5 min.
    9. Eliminare il surnatante con 10 μL rimanenti e aggiungere 90 μL di acqua priva di nucleasi per raggiungere un volume totale di 100 μL. Pipettare su e giù 10x per miscelare la soluzione, vortice per 5 s e centrifugare brevemente (5 s). La soluzione può essere conservata a 2-8 °C per meno di 3 giorni.

5. Sequenziamento di nuova generazione 9,15

NOTA: tutte le procedure descritte in questa sezione vengono eseguite sulla piattaforma di sequenziamento DA8600. I materiali utilizzati in questa sezione sono disponibili nel Set di kit di sequenziamento (Reagenti/Soluzioni/Materiali) del Kit universale per le reazioni di sequenziamento (Tabella dei materiali).

  1. Controllare tutti i reagenti e i materiali richiesti in una piattaforma di sequenziamento run-on.
    1. Reagente di sequenziamento: verificare la disponibilità della soluzione enzimatica di sequenziamento (6 μL), dei primer di sequenziamento (20 μL), della dima di controllo qualità (5 μL) e di dGTP/dCTP/dATP/dTTP (70 μL), conservati tra -30-10 °C.
    2. Soluzione di sequenziamento: verificare la disponibilità della soluzione di sequenziamento II (100 ml), della soluzione di sequenziamento III (50 ml), del tampone di ricottura (1.015 μL), del tampone di carico (10 μL), dell'agente schiumogeno (2 μL), della compressa di cloro (1 compressa) e delle perle di streptavidina (100 μL), conservate a 4 °C.
    3. Materiali: Verificare la disponibilità di 250 mL di tubo di reagenti (8), 250 reagenti tubo cap (8), sipper II (8), sipper (1), flacone di reagente da 2 litri (1) e chip di sequenziamento (1), conservati presso RT.
  2. Lavare il chip prima dell'uso.
    1. Fissare un chip fermo su una piastra di lavoro, iniettare 100 μL di acqua priva di nucleasi nel foro del campione, rimuovere la soluzione nel portale esterno e ripetere la procedura.
    2. Iniettare 100 μL di soluzione di NaOH 0,1 M nel chip e incubare per 1 minuto a RT.
    3. Iniettare 100 μL di isopropanolo nel foro del campione, rimuovere la soluzione extra nel portale esterno e ripetere nuovamente la procedura.
    4. Coprire il portale esterno con una carta da filtro, far scorrere l'azoto per asciugare l'isopropanolo rimanente nella cella di flusso del chip e mantenere il chip pronto all'uso in RT.
  3. Avvio del sequencer
    1. Accendere la valvola dell'azoto e regolare la pressione a 30 psi. Avviare il sequencer, premere CLEAN nella schermata principale e scegliere acqua o cloruro per lavare la macchina di conseguenza.
      NOTA: Lavare con acqua prima di ogni corsa, lavare con cloruro ogni settimana o il tempo in cui la macchina rimane con reagenti superiori a 48 ore.
    2. Lavaggio al cloruro: scegliere un flacone di reagente specificato per il lavaggio al cloruro, lavare il flacone due volte con acqua 18 MΩ e riempire il flacone con 1 L di acqua da 18 MΩ. Inserire una compressa di cloruro nel flacone, sciogliere la compressa per 10 minuti, aggiungere 1 ml di 1 M NaOH e quindi invertire il flacone per miscelare la soluzione. Utilizzare la soluzione di cloruro entro 3 ore dalla preparazione.
    3. Filtrare 100 ml di soluzione di cloruro con un filtro da 0,45 μm e raccogliere con due provette. Installare i due tubi di cloruro nelle posizioni C1 e C2. Premere CLEAN sulla schermata principale e dotare un chip per il lavaggio al cloruro.
    4. Premere su AVANTI e controllare tutti i passaggi sullo schermo per avviare il programma di lavaggio; Il programma terminerà tra 30 minuti. Iniziare un lavaggio con acqua dopo il lavaggio del cloruro.
    5. Lavaggio ad acqua: contrassegnare due tubi specifici per l'acqua con C1 e C2 e lavare i tubi con acqua 18 MΩ due volte. Aggiungere 100 ml di acqua da 18 MΩ a ciascuno dei tubi di lavaggio dell'acqua e impostarli rispettivamente nelle posizioni C1 e C2.
    6. Scegliere il programma CLEAN , installare il chip preparato per il lavaggio ad acqua, premere AVANTI, quindi controllare tutti i passaggi sullo schermo per avviare il programma di lavaggio.
  4. Inizializzazione
    1. Pulire il flacone con la soluzione di lavaggio II, contrassegnarlo come W2 e lavarlo tre volte con acqua 18 MΩ.
    2. Pulire il tubo di azoto con carta posata ad aria, inserirlo nel fondo del tubo e regolare il flusso d'aria a 0,5 L / min. Scaricare l'ossigeno nella bombola e riempire la bottiglia con 1.920 ml di acqua da 18 MΩ. Aggiungere la soluzione di sequenza II e 10 μL di 1 M NaOH al flacone, chiudere il tappo e invertire il flacone più volte per miscelare la soluzione.
    3. Contrassegnare due nuovi tubi come W1 e W3. Aggiungere 32 μL di 1 M NaOH a W1, aggiungere 40-50 mL di soluzione III di sequenza 1x a W3 e chiudere i tappi.
      NOTA: 1x soluzione di sequenza III deve essere in bagnomaria a 37 °C per 30 minuti al primo utilizzo. La soluzione di sequenza II deve essere protetta dalla luce e conservata a RT. Il flacone di lavaggio deve essere sostituito con uno nuovo dopo essere stato utilizzato 20 volte.
    4. Premere INITIALIZE nella schermata principale, modificare il cursore sulle posizioni W1, W2 e W3, impostare i tubi nella posizione di conseguenza e sigillarli saldamente mediante rotazione. Installare un chip per l'inizializzazione e controllare i parametri di stato della macchina.
    5. Premere AVANTI per avviare il programma di inizializzazione; Ci vogliono 40 minuti nella prima sezione.
      NOTA: I guanti devono essere cambiati prima di cambiare il nuovo sipper per evitare di contaminare il corpo del sipper. Una volta utilizzati per il lavaggio con acqua e l'inizializzazione, i chip possono essere applicati all'inizializzazione, ma non utilizzare i chip utilizzati per i chip di lavaggio del cloruro per l'inizializzazione.
    6. Sciogliere dGTP, dCTP, dATP e dTTP sul ghiaccio e vortice per mescolare. Contrassegnare quattro nuovi tubi come G, C, A e T e pipettare 70 μL della soluzione in base all'etichetta del tubo.
  5. Preparare la libreria per l'esecuzione.
    1. Posizionare il modello di controllo qualità, i primer e la soluzione enzimatica sul ghiaccio.
    2. Preparare la libreria del DNA quando il programma di inizializzazione ha circa 20 minuti rimanenti. Vortice il modello di controllo qualità per 30 s da miscelare e centrifugare brevemente per 2 s. Trasferire 5 μL della dima di controllo qualità nella soluzione della maschera, vortice per 5 s, e centrifugare il tubo per 15.500 x g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante mediante pipettaggio con attenzione, evitare di toccare il pellet e lasciare un volume di 10 μL nel tubo.
    3. Aggiungere 15 μL di tampone di ricottura nel tubo; il volume totale della soluzione è di 25 μL.
    4. Vortice la sequenza si innesca quando si dissolve completamente sul ghiaccio e centrifugare brevemente per 2 s. Trasferire 20 μL dei primer di sequenza nel tubo dal passo precedente, vortice per 5 s, centrifugare brevemente per 2 s, quindi conservare a RT prima dell'uso.
  6. Caricamento del campione e sequenziamento
    1. Pipettare 55 μL della soluzione campione preparata nella fase precedente e iniettarla nel foro del campione del chip.
    2. Impostare il chip sulla centrifuga; Mantenere la tacca verso l'esterno e il portale del campione all'interno, bilanciandolo con un altro chip usato, e centrifugare per 10 minuti.
    3. Preparare la soluzione di carico.
      1. Mescolare 0,5 mL di tampone di ricottura e 0,5 mL di acqua esente da nucleasi in una provetta da centrifuga da 1,5 mL. Contrassegnarlo come tampone di ricottura al 50% e utilizzarlo entro 7 giorni.
      2. Mescolare 0,5 mL di soluzione di isopropanolo e 0,5 mL di tampone di ricottura. Contrassegnarlo come tampone di lavaggio al 50% e utilizzare entro 24 ore.
      3. Mescolare 6 μL di enzima di sequenza e 60 μL di tampone di ricottura al 50%. Contrassegnarlo come tampone di reazione enzimatica e posizionare la soluzione sul ghiaccio dopo la preparazione.
      4. Mescolare 49 μL di tampone di ricottura al 50% e 1 μL di agente schiumogeno e contrassegnarlo come soluzione schiumogena.
    4. Soffiare 100 μL di aria nella soluzione schiumogena, pipettare ripetutamente la soluzione fino a quando le bolle sono in uno stato schiumogeno denso e mantenere il volume di schiuma intorno a 250 μL.
    5. Posizionare il chip sul banco dopo la centrifuga, iniettare 100 μL di schiuma nel foro del campione e rimuovere la soluzione estrusa nel portale esterno. Rimettere il chip nella centrifuga e centrifugare brevemente per 30 s.
    6. Ripetere i passaggi 5.6.4-5.6.5.
    7. Iniettare due volte 100 μL di tampone di lavaggio al 50% e rimuovere la soluzione estrusa nel portale esterno dopo ogni iniezione.
    8. Iniettare tre volte 100 μL di tampone di ricottura al 50% e rimuovere la soluzione estrusa nel portale esterno dopo ogni iniezione.
    9. Iniettare 65 μL di tampone di reazione enzimatica al 50%, evitare la formazione di bolle e rimuovere la soluzione estrusa nel portale esterno.
    10. Stabilizzare il chip caricato su RT per 5 minuti e installare il chip sul portale del chip sequencer. Scegli il piano programmato al punto 6, controlla le informazioni e avvia la corsa; Ci vogliono circa 1,5 ore per finire.
    11. Eseguire il programma di lavaggio ad acqua entro 72 ore dalla fine della corsa. Eseguire il lavaggio al cloruro prima del lavaggio con acqua quando il tempo supera le 72 ore. Spegnere il sequenziatore e chiudere la valvola dell'azoto.

6. Pianificare un'esecuzione di sequenziamento istruita nel sistema del server reporter16

NOTA: tutte le procedure descritte in questa sezione vengono eseguite su Ion Proton Sequencer con il sistema server reporter.

  1. Accedere al sistema server, selezionare la scheda Piano e fare clic su Esegui modello di piano. Scegliere il tipo di esecuzione Intero genoma e selezionare il modello appropriato dall'elenco dei modelli di esecuzione pianificati.
  2. Nella scheda Piano , immettere o effettuare le seguenti selezioni:
    1. Immettere un nuovo nome di piano di esecuzione in base al batch di esempi, selezionare hg19 (Homo sapiens) dall'elenco a discesa Libreria di riferimento e selezionare Nessuno dagli elenchi a discesa Regioni di destinazione e Regioni hotspot .
    2. Immettere il numero di codici a barre utilizzati nel set di campioni, selezionare un codice a barre dall'elenco a discesa per ciascun campione e immettere un nome descrittivo univoco, che può essere utile per raggruppare e tracciare il campione. Evitare l'utilizzo del campione predefinito 1 e così via.
    3. Selezionare Nessuno nella scheda Ion Reporter , fare clic su Avanti e selezionare DNA nell'applicazione e Intero genoma come tecnica di destinazione.
    4. Nella scheda Kit verificare le selezioni o apportare modifiche mentre è appropriato per un'esecuzione.
      1. Selezionare Ion Plus Fragment Library Kit dall'elenco a discesa Library Kit Type . Seleziona Kit Ion PI HI-Q OT2 200 nell'elenco a discesa Kit modello e scegli OneTouch come predefinito. Selezionare Ion PI HI-Q Sequencing 200 kit dall'elenco a discesa Sequencing Kit .
      2. Immettere 300 flussi, selezionare Ion PITM Chip dall'elenco a discesa Tipo di chip e selezionare IonXpress dall'elenco a discesa Set di codici a barre .
      3. Annullate la selezione di Segna come letture duplicate e la selezione di Abilita riallineamento.
    5. Scegliere il plug-in appropriato nella scheda Plug-in per eseguire l'analisi dei dati nel passaggio 7. Completare le selezioni nel passaggio progetti, fare clic su Avanti e fare clic su Pianifica esecuzione nell'angolo in basso a destra per elencare le esecuzioni pianificate.
    6. Nella scheda Esecuzioni pianificate , selezionare l'esecuzione appena creata e controllare tutte le impostazioni nella finestra di revisione.

7. Analisi dei dati

  1. Analizzare le varianti del numero di copia (CNV) utilizzando un flusso di lavoro bioinformatico.
    NOTA: Le CNV sono state analizzate nel flusso di lavoro bioinformatico con l'implementazione di un algoritmo basato su un modello di Markov nascosto (HMM)17; Il modello utilizza la copertura di lettura attraverso il genoma per prevedere il numero di copie o lo stato di ploidia del numero intero (cioè 0, 1, 2, 3, ecc.). La pipeline bioinformatica complessiva è stata costruita nel plug-in di un sistema server di sequenza, come illustrato nella Figura 2. La fase di analisi bioinformatica richiede in media 4 ore per essere completata.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Al termine del piano delle sequenze dopo il processo di esecuzione nella macchina, il sistema del server di sequenza riporta il riepilogo con informazioni descrittive dei dati generati, dello stato del chip, della velocità di caricamento ISP e della qualità della libreria, come illustrato nella Figura 2. In questa dimostrazione dei risultati, sono stati ottenuti 17,6 G di dati nella base totale e il tasso di caricamento complessivo dell'ISP è stato dell'88% nei pozzi totali del chip; la mapp...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'aneuploidia cromosomica degli embrioni è la causa di gran parte della perdita di gravidanza, sia concepita naturalmente che in vitro (FIV). Nella pratica clinica della fecondazione in vitro, si propone che lo screening dell'aneuploidia embrionale e il trasferimento dell'embrione euploidia possano migliorare l'esito della fecondazione in vitro. L'ibridazione fluorescenza in situ è la prima tecnica adottata per la selezione del sesso e la PGT-A; Tuttavia, questa tecnica richiede più competenze tecniche ...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vorremmo ringraziare il Dr. Zhangyong Ming e il Sig. Rongji Hou per i loro consigli sull'applicazione estesa LIMS. Questo studio è supportato da PLA Special Research Projects for Family Planning (17JS008, 20JSZ08), Fund of Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research (No.20-065-76) e Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,45 μ m Unità filtro siringaMerkmilliporeMillex-HV
1,5 mL DNA LoBind TubesEppendorf30108051
15 mL provetteGreiner Bio-One188261
2,0 mLDNA LoBind TubesEppendorf30108078
50 mLGreiner Bio-One227261
5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)FAPON
Anstart Tap DNA polimerasiFAPON
AMPure XP reagente (biglie magnetiche per il legame del DNA)BeckmanA63881https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881
Tampone per lisi cellulareSouthern Medical UniversityTampone per lisi cellulare contenente 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM acido etilenglicole tetraacetico (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM di sodio pirofosfato, 2 mM β-glicerofosfato, 0,1% SDS
ClinVarNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
tampone di eluizione del DNANEBT1016L
dNTPVazymeP031-AA
DynaMag-2 MagnetLife Technologies12321D
Alcool etilicoGuangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientifichttp://www.chemicalreagent.com/
Reagenti per l'amplificazione dell'intero genoma sviluppati in modo indipendenteSouthern Medical UniversityI reagenti sono costituiti dai seguenti componenti:
1. Lisi cellulare
2. Amplificazione Soluzione premiscelata
      1) Primer WGA-P2 (10 μ M)
      2) dNTP (10 mM)
      3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)
3. Enzima di amplificazione
      1) Anstart Tap DNA polimerasi (5 U/μ Kit L)
Ion PI Hi-Q OT2 200Thermo Fisher ScientificA26434Kit menzionato al punto 4.2.8
Kit Ion PI Hi-Q Sequencing 200   Thermo Fisher ScientificA26433
Sistema di protoni ioniciLife Technologies4476610
Ion Reporter ServerSystem Life Technologies4487118
isopropanoloGuangzhou Chemical Reagent Factoryhttp://www.chemicalreagent.com/
Library Preparation KitDaan Gene Co., Ltd114https://www.daangene.com/pt/certificate.html
NaOHSigma-AldrichS5881-1KG
Tecnologie per la vitadell'acqua senza nucleasiAM9932
Oligo WGA-P2Sangon Biotech5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN
NNNNATGTGG-3'OneTouch
2 Tecnologiela vita4474779  Modello sistema di amplificazione e arricchimento
Provette per PCRAxygenPCR-02D-C
PicoPLEX WGA KitTakara Bio USAR300671
Puntali per pipetteQualità Prodotti scientificihttps://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
Mini centrifuga portatile LX-300QilinbeierE0122
Qubit 3.0 FluorimetroLife TechnologiesQ33216Fluorimetro
Qubit Provette per saggiLife TechnologiesQ32856
Kit per saggi Qubit dsDNA HSLife TechnologiesQ32851
Sistema server sequenziatoreThermo Fisher ScientificTorrent Suite Software
Sequenziamento Reazioni Kit universaleDaan Gene Co., Ltd113https://www.daangene.com/pt/certificate.html
Questo kit contiene i seguenti componenti:
1. Kit di preparazione del modello Set

1.1 Kit di preparazione del modello:
Emulsione PCR tampone
Emulsione PCR miscela enzimatica
Soluzione portamodello

1.2 Soluzioni per la preparazione del modello:
Olio di reazione per la preparazione del modello I
soluzione di rottura dell'emulsionante II
Olio di reazione per la preparazione del modello II
Acqua priva di nucleasi
Tween soluzione
Soluzione di demulsificazione I
Soluzione di lavaggio del modello
Soluzione di lavaggio delle perle C1
Soluzione di risospensione delle perle C1
Soluzione di risospensione del modello

1.3 Materiali per la preparazione del modello:
Tubo reagente I
connettore
Tubo di raccolta
Pipetta per tubo reagente I
Piastra di amplificazione
8 pozzetti strip
Punte dedicate
Adattatore di lavaggio per preparazione dima
Filtro preparazione dima

2. Kit di sequenziamento Set

2.1 Kit di sequenziamento:
dGTP
dCTP
dATP
dTTP
Soluzione enzimatica di sequenziamento
Primer di sequenziamento
Modelli di controllo qualità

2.2  Soluzioni di sequenziamento:
Soluzione di sequenziamento II
Soluzione di sequenziamento IIII
Tampone di ricottura
Tampone di caricamento
Agente schiumogeno
Compresse di cloro
Perlina C1

2.3 Materiali di sequenziamento:
Tubo reagente II
Tappo del tubo reagente
Tubo reagente  II
Flacone per reagenti sipper
Flaconi per reagenti

3. Chip
Soluzione di idrossido di sodioSigma72068-100ML
TermociclatoreLife Technologies4375786
per del sistema

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Driscoll, D. A., Gross, S. Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).
  2. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
  3. Hong, K. H., et al. Embryonic aneuploidy rates are equivalent in natural cycles and gonadotropin-stimulated cycles. Fertility and Sterility. 112 (4), 670-676 (2019).
  4. Adams, D. R., Eng, C. M. Next-generation sequencing to diagnose suspected genetic disorders. The New England Journal of Medicine. 379 (14), 1353-1362 (2018).
  5. Merriman, B., Team, I. T., Rothberg, J. M. Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing. Electrophoresis. 33 (23), 3397-3417 (2012).
  6. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 341(2012).
  7. Kane, S. C., Willats, E., Bezerra Maia, E. H. M. S., Hyett, J., da Silva Costa, F. Pre-implantation genetic screening techniques: Implications for clinical prenatal diagnosis. Fetal Diagnosis and Therapy. 40 (4), 241-254 (2016).
  8. Dilliott, A. A., et al. Targeted next-generation sequencing and bioinformatics pipeline to evaluate genetic determinants of constitutional disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57266(2018).
  9. Ion ReproSeq™ PGS View Kits User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf (2017).
  10. PicoPLEX® Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA. , Available from: https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf (2019).
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