Il protocollo presenta le procedure generali in laboratorio richieste nei test genetici preimpianto per l'aneuploidia su una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione basata su semiconduttori. Qui presentiamo i passaggi dettagliati dell'amplificazione dell'intero genoma, della selezione dei frammenti di DNA, della costruzione della libreria, della preparazione del modello e del flusso di lavoro del sequenziamento con risultati rappresentativi.
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Articolo metodologico
Test genetici preimpianto per aneuploidia su una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione basata su semiconduttori
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il sequenziamento di nuova generazione ha acquisito un'importanza crescente nell'applicazione clinica nella determinazione delle varianti genetiche. Nel test genetico preimpianto, questa tecnica ha i suoi vantaggi unici in termini di scalabilità, produttività e costi. Per il test genetico preimpianto per l'analisi delle aneuploidie, il sistema di sequenziamento di nuova generazione (NGS) basato su semiconduttori qui presentato fornisce un approccio completo per determinare le varianti genetiche strutturali con una risoluzione minima di 8 Mb. Dall'acquisizione del campione al report finale, il processo di lavoro richiede più passaggi con una stretta aderenza ai protocolli. Poiché vari passaggi critici potrebbero determinare l'esito dell'amplificazione, la qualità della libreria, la copertura delle letture e l'output dei dati, le informazioni descrittive con dimostrazione visiva diversa dalle parole potrebbero offrire maggiori dettagli al funzionamento e alla manipolazione, che possono avere un grande impatto sui risultati di tutti i passaggi critici. I metodi qui presentati mostreranno le procedure coinvolte nell'amplificazione dell'intero genoma (WGA) delle cellule di Trophectoderm (TE) sottoposte a biopsia, nella costruzione della libreria genomica, nella gestione del sequenziatore e, infine, nella generazione di report sulle varianti del numero di copie.
Introduzione
L'aneuploidia è l'anomalia nel numero di cromosomi dovuta alla presenza di uno o più cromosomi extra o all'assenza di uno o più cromosomi. Gli embrioni che portano qualche tipo di aneuploidia, come la perdita di un cromosoma X (sindrome di Turner), copie extra di autosomi, come trisomie dell'autosoma 21 (sindrome di Down), 13 (sindrome di Patau) e 18 (sindrome di Edwards), o cromosomi sessuali extra come 47, XXY (sindrome di Klinefelter) e 47, XXX (sindrome Triple X), possono sopravvivere a termine con difetti alla nascita1. L'aneuploidia è la causa principale degli aborti spontanei del primo trimestre e del fallimento della fecondazione in....
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Protocollo
Tutti i protocolli e la biopsia del trofoectoderma (TE) (sezione 1.1.1.1) applicati in questo studio sono stati esaminati e approvati dal comitato etico di ricerca umana dell'ospedale n. 924 il 18 settembre 2017 (NO: PLA924-2017-59). I pazienti/partecipanti hanno fornito il loro consenso informato scritto per partecipare a questo studio.
1. Isolamento del DNA dalla biopsia dell'embrione umano e amplificazione genomica completa
- Protocollo per l'amplificazione dell'intero genoma 9,10
NOTA: Pico PLEX WGA Kit viene utilizzato per eseguire l'amplificazione d....
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Risultati
Al termine del piano delle sequenze dopo il processo di esecuzione nella macchina, il sistema del server di sequenza riporta il riepilogo con informazioni descrittive dei dati generati, dello stato del chip, della velocità di caricamento ISP e della qualità della libreria, come illustrato nella Figura 2. In questa dimostrazione dei risultati, sono stati ottenuti 17,6 G di dati nella base totale e il tasso di caricamento complessivo dell'ISP è stato dell'88% nei pozzi totali del chip; la mapp.......
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Discussione
L'aneuploidia cromosomica degli embrioni è la causa di gran parte della perdita di gravidanza, sia concepita naturalmente che in vitro (FIV). Nella pratica clinica della fecondazione in vitro, si propone che lo screening dell'aneuploidia embrionale e il trasferimento dell'embrione euploidia possano migliorare l'esito della fecondazione in vitro. L'ibridazione fluorescenza in situ è la prima tecnica adottata per la selezione del sesso e la PGT-A; Tuttavia, questa tecnica richiede più competenze tecniche .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il Dr. Zhangyong Ming e il Sig. Rongji Hou per i loro consigli sull'applicazione estesa LIMS. Questo studio è supportato da PLA Special Research Projects for Family Planning (17JS008, 20JSZ08), Fund of Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research (No.20-065-76) e Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,45 μ m Unità filtro siringa | Merkmillipore | Millex-HV | |
| 1,5 mL DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108051 | |
| 15 mL provette | Greiner Bio-One | 188261 | |
| 2,0 mLDNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108078 | |
| 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) | FAPON | ||
| Anstart Tap DNA polimerasi | FAPON | ||
| AMPure XP reagente (biglie magnetiche per il legame del DNA) | Beckman | A63881 | https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881 |
| Tampone per lisi cellulare | Southern Medical University | Tampone per lisi cellulare contenente 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM acido etilenglicole tetraacetico (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM di sodio pirofosfato, 2 mM β-glicerofosfato, 0,1% SDS | |
| ClinVar | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ | |
| tampone di eluizione del DNA | NEB | T1016L | |
| dNTP | Vazyme | P031-AA | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Alcool etilico | Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Reagenti per l'amplificazione dell'intero genoma sviluppati in modo indipendente | Southern Medical University | I reagenti sono costituiti dai seguenti componenti: 1. Lisi cellulare 2. Amplificazione Soluzione premiscelata 1) Primer WGA-P2 (10 μ M) 2) dNTP (10 mM) 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) 3. Enzima di amplificazione 1) Anstart Tap DNA polimerasi (5 U/μ Kit L) | |
| Ion PI Hi-Q OT2 200 | Thermo Fisher Scientific | A26434 | Kit menzionato al punto 4.2.8 |
| Kit Ion PI Hi-Q Sequencing 200 | Thermo Fisher Scientific | A26433 | |
| Sistema di protoni ionici | Life Technologies | 4476610 | |
| Ion Reporter Server | System Life Technologies | 4487118 | |
| isopropanolo | Guangzhou Chemical Reagent Factory | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Library Preparation Kit | Daan Gene Co., Ltd | 114 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-1KG | |
| Tecnologie per la vita | dell'acqua senza nucleasi | AM9932 | |
| Oligo WGA-P2 | Sangon Biotech | 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN NNNNATGTGG-3'OneTouch | |
| 2 Tecnologie | la vita | 4474779 | Modello sistema di amplificazione e arricchimento |
| Provette per PCR | Axygen | PCR-02D-C | |
| PicoPLEX WGA Kit | Takara Bio USA | R300671 | |
| Puntali per pipette | Qualità Prodotti scientifici | https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx | |
| Mini centrifuga portatile LX-300 | Qilinbeier | E0122 | |
| Qubit 3.0 Fluorimetro | Life Technologies | Q33216 | Fluorimetro |
| Qubit Provette per saggi | Life Technologies | Q32856 | |
| Kit per saggi Qubit dsDNA HS | Life Technologies | Q32851 | |
| Sistema server sequenziatore | Thermo Fisher Scientific | Torrent Suite Software | |
| Sequenziamento Reazioni Kit universale | Daan Gene Co., Ltd | 113 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html Questo kit contiene i seguenti componenti: 1. Kit di preparazione del modello Set 1.1 Kit di preparazione del modello: Emulsione PCR tampone Emulsione PCR miscela enzimatica Soluzione portamodello 1.2 Soluzioni per la preparazione del modello: Olio di reazione per la preparazione del modello I soluzione di rottura dell'emulsionante II Olio di reazione per la preparazione del modello II Acqua priva di nucleasi Tween soluzione Soluzione di demulsificazione I Soluzione di lavaggio del modello Soluzione di lavaggio delle perle C1 Soluzione di risospensione delle perle C1 Soluzione di risospensione del modello 1.3 Materiali per la preparazione del modello: Tubo reagente I connettore Tubo di raccolta Pipetta per tubo reagente I Piastra di amplificazione 8 pozzetti strip Punte dedicate Adattatore di lavaggio per preparazione dima Filtro preparazione dima 2. Kit di sequenziamento Set 2.1 Kit di sequenziamento: dGTP dCTP dATP dTTP Soluzione enzimatica di sequenziamento Primer di sequenziamento Modelli di controllo qualità 2.2 Soluzioni di sequenziamento: Soluzione di sequenziamento II Soluzione di sequenziamento IIII Tampone di ricottura Tampone di caricamento Agente schiumogeno Compresse di cloro Perlina C1 2.3 Materiali di sequenziamento: Tubo reagente II Tappo del tubo reagente Tubo reagente II Flacone per reagenti sipper Flaconi per reagenti 3. Chip |
| Soluzione di idrossido di sodio | Sigma | 72068-100ML | |
| Termociclatore | Life Technologies | 4375786 |
Riferimenti
- Driscoll, D. A., Gross, S. Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics....
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Ristampe e permessi
