Articolo metodologico

Un modello di roditore indotto da TNBS per studiare il ruolo patogeno dello stress meccanico nella malattia di Crohn

DOI:

10.3791/63499

⸱

1 marzo 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, the University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, the University of Texas Medical Branch

* These authors contributed equally

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Sommario

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Il presente protocollo descrive lo sviluppo di un modello di colite simile al Crohn nei roditori. L'infiammazione transmurale porta alla stenosi nel sito di instillazione del TNBS e l'allargamento meccanico è osservato nel segmento prossimale alla stenosi. Questi cambiamenti consentono di studiare lo stress meccanico nella colite.

Abstract

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Le malattie infiammatorie intestinali (IBD) come il morbo di Crohn (CD) sono disturbi infiammatori cronici del tratto gastrointestinale che colpiscono circa 20 per 1.00.000 in Europa e negli Stati Uniti. La CD è caratterizzata da infiammazione transmurale, fibrosi intestinale e stenosi luminale. Sebbene le terapie antinfiammatorie possano aiutare a controllare l'infiammazione, non hanno efficacia sulla fibrosi e sulla stenosi nella CD. La patogenesi della CD non è ben compresa. Gli studi attuali si concentrano principalmente sulla delineazione dei meccanismi di risposta immunitaria intestinale disregolati. Mentre l'infiammazione transmurale associata a CD, la fibrosi intestinale e la stenosi luminale rappresentano tutte uno stress meccanico alla parete intestinale, il ruolo dello stress meccanico nella CD non è ben definito. Per determinare se lo stress meccanico svolge un ruolo patogeno indipendente nella CD, è stato sviluppato un protocollo di colite CD-like indotta da TNBS nei roditori. Questo modello di infiammazione e fibrosi transmurale indotta da TNBS assomiglia ai segni patologici della CD nel colon. È indotta dall'instillazione intracolonica di TNBS nel colon distale di ratti adulti Sprague-Dawley. In questo modello, l'infiammazione transmurale porta alla stenosi nel sito di instillazione del TNBS (Sito I). La distensione meccanica si osserva nella porzione prossimale al sito di instillazione (Sito P), rappresentando lo stress meccanico ma non l'infiammazione visibile. La porzione del colon distale all'infiammazione (Sito D) non presenta né infiammazione né stress meccanico. Sono stati osservati cambiamenti distintivi dell'espressione genica, della risposta immunitaria, della fibrosi e della crescita muscolare liscia in diversi siti (P, I e D), evidenziando un profondo impatto dello stress meccanico. Pertanto, questo modello di colite simile alla CD ci aiuterà a comprendere meglio i meccanismi patogenetici della CD, in particolare il ruolo dello stress meccanico e dell'espressione genica indotta dallo stress meccanico nella disregolazione immunitaria, nella fibrosi intestinale e nel rimodellamento dei tessuti nella CD.

Introduzione

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La malattia infiammatoria intestinale (IBD), compresa la colite ulcerosa (UC) e il morbo di Crohn (CD), è caratterizzata da infiammazione cronica nel tratto gastrointestinale (GI). Colpisce ~ 1-2 milioni di americani1. I costi annuali stimati per l'assistenza IBD negli Stati Uniti sono di $ 11,8 miliardi. A differenza della UC, il CD è caratterizzato da infiammazione transmurale e formazione di stenosi 2,3. La formazione di stenosi (stenosi) si verifica fino al 70% dei pazienti con CD3 e può essere causata da infiammazione transmurale (stenosi infiammatoria) o fibrosi intestinale (stenosi fibrotica)4,5. La fibrosi intestinale è caratterizzata da un'eccessiva deposizione di collagene e da altre matrici extracellulari (ECM) con cellule muscolari lisce (SMC) come uno dei principali tipi di cellule mesenchimali coinvolte nel processo 3,4. L'iperplasia della muscolatura liscia associata all'ipertrofia è un altro cambiamento istologico significativo nella stenosi fibrotica nella CD6. Sebbene la formazione di stenosi nella CD sia associata a infiammazione cronica, nessun trattamento antinfiammatorio è efficace, ad eccezione del trattamento chirurgico 2,6. Tuttavia, le recidive post-chirurgiche sono quasi il 100%, dato il tempo sufficiente 2,7. Come risposta infiammatoria, la fibrosi e l'iperplasia SMC possono anche svilupparsi in condizioni non infiammatorie (cioè ostruzione intestinale) nell'intestino 8,9; si ritiene che sia i meccanismi dipendenti dall'infiammazione che quelli indipendenti siano coinvolti nella formazione dellastenosi 3,4. Dato che un'ampia ricerca sui meccanismi dipendenti dall'infiammazione non si è tradotta in alcuna terapia efficace per la formazione della stenosi, sono necessari studi sul possibile ruolo dei meccanismi indipendenti dall'infiammazione nella fibrosi intestinale.

Come fattore non infiammatorio, lo stress meccanico (SM) associato a edema, infiltrazione di cellule infiammatorie, deformazione dei tessuti, fibrosi e stenosi 10,11,12,13 è comunemente riscontrato nell'IBD, in particolare nella CD, che è caratterizzata da infiammazione transmurale. Lo stress meccanico è più notevole nella CD stenotica, dove la stenosi (infiammatoria o fibrotica) nel sito di infiammazione presenta stress meccanico nel tessuto locale e porta alla distensione del lume nel segmento prossimale al sito di ostruzione10,14. Precedenti studi in vitro hanno dimostrato che lo stress meccanico altera l'espressione genica di specifici mediatori infiammatori (cioè COX-2, IL-6)8,14,15 e fattori di crescita (cioè TGF-β) nei tessuti gastrointestinali, in particolare nelle cellule muscolari lisce intestinali (SMC)16. Studi recenti hanno anche scoperto che l'espressione di specifici mediatori pro-fibrotici come il fattore di crescita del tessuto connettivo (CTGF) è altamente sensibile allo stress meccanico17,18. È stato ipotizzato che lo stress meccanico potrebbe svolgere un ruolo patogeno indipendente nell'infiammazione, nella fibrosi e nel rimodellamento dei tessuti associati a CD. Tuttavia, il significato patogeno dello stress meccanico nell'infiammazione intestinale, nella fibrosi e nell'iperplasia della muscolatura liscia nella CD rimane in gran parte inesplorato. Ciò può essere in parte dovuto al fatto che l'infiammazione è un processo più visibile e meglio studiato rispetto allo stress meccanico. Ancora più importante, non esiste un modello animale ben definito di IBD per distinguere l'effetto dello stress meccanico da quello dell'infiammazione.

Il lavoro attuale descrive un modello di roditore di colite simile al Crohn indotta dall'iniezione intracolonica del reagente apteno acido solfonico 2,4,6-trinitrobenzene (TNBS)19,20, che può servire allo scopo di studiare il ruolo dello stress meccanico nella CD. È stato riscontrato che l'instillazione di TNBS ha indotto un'infiammazione transmurale localizzata (~ 2 cm di lunghezza) con restringimento del lume (stenosi) nel colon distale. La stenosi porta a marcata distensione intestinale (stress meccanico)14,15 ma infiammazione non visibile nel segmento del colon prossimale al sito di instillazione. Al contrario, il segmento del colon distale al sito di stenosi non presenta né infiammazione né stress meccanico. Cambiamenti significativi sito-specifici nell'espressione genica, nell'infiammazione, nella fibrosi e nell'iperplasia SMC sono stati osservati nei tre diversi siti. I risultati suggeriscono che lo stress meccanico, in particolare l'espressione genica indotta dallo stress meccanico, può svolgere un ruolo fondamentale nello sviluppo della fibrosi e dell'iperplasia nella colite di Crohn.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo il comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Texas Medical Branch (#0907051C). Per lo studio sono stati utilizzati ratti Sprague-Dawley maschi o femmine, di circa 8-9 settimane.

1. Preparazione animale

  1. Ratti veloci per 24 ore e trattarli con lassativo (detergente intestinale, vedi Tabella dei materiali) durante la notte.
  2. Il giorno successivo, anestetizzare i ratti utilizzando un sistema di anestesia (vedi Tabella dei materiali) esponendoli al 2% di isoflurano insieme a 1 L / min di ossigeno durante la somministrazione di TNBS. Controllare i riflessi o le dita dei piedi per confermare l'anestesia.
  3. Preparare una soluzione TNBS fresca in base ai pesi corporei.
    NOTA: TNBS - Sono stati utilizzati 65 mg/kg di peso corporeo in 250 μL di etanolo al 40%.
  4. Metti i ratti in posizione supina sul tavolo dell'anestesia. Per indurre la colite, inserire attraverso l'ano un catetere in poliuretano aperto di grado medico per ~ 7-8 cm dal bordo anale e instillare delicatamente TNBS (preparato nel passaggio 1.3) nel colon19. Somministrare i ratti di controllo fittizi con 250 μL di sola soluzione salina.
  5. Dopo aver instillato TNBS o soluzione salina, mantenere i ratti in posizione supina e leggermente a testa in giù (~ 30 °), con l'ano chiuso per 2 minuti per aiutare la distribuzione TNBS ed evitare fuoriuscite.
  6. Fornire ai ratti cibo e acqua ad libitum per 7 giorni e osservare i ratti ogni giorno per il peso corporeo, l'assorbimento di cibo, le feci e le condizioni generali di salute.

2. Preparazioni tissutali

  1. Il giorno dell'eutanasia, l'eutanasia dei ratti usando l'inalazione di CO2 e confermare l'eutanasia con lussazione cervicale.
  2. Aprire l'addome del ratto usando forbici e pinze chirurgiche.
  3. Rimuovere con attenzione l'intero colon (sopra il canale anale) e trasferire immediatamente il colon al tampone HBSS 1x ghiacciato.
  4. Raddrizzare i due punti nel buffer e misurare la lunghezza del colon usando un righello. Prendi il filo di nylon e gira intorno al colon per misurare la circonferenza esterna dei segmenti del colon in controllo e dei ratti trattati con TNBS. Prendi tessuti a tutto spessore per l'istologia.
  5. Tagliare il colon lungo la tavola mesenterica e pulire bene il colon con il tampone HBSS. Valutare il colon per il punteggio di infiammazione macroscopica in base ai criteri precedentemente descritti19 con modifiche minime.
    NOTA: 0 = mucosa normale; 1 = iperemia localizzata ma senza erosioni o ulcere; 2 = ulcera e stenosi (area interessata < 5 mm); 3 = ulcera grave, cicatrice e stenosi (area interessata > 5 mm).
  6. Raccogliere campioni di tessuto del colon dal sito P (porzione 2-3 cm prima del margine orale del sito di infiammazione), dal sito I (sito di infiammazione, in genere 4-6 cm dalla fine del colon, dove viene instillato TNBS) e dal sito D (porzione distale di 1-2 cm al margine aborale del sito di infiammazione), rispettivamente da ratti trattati con TNBS.
    NOTA: Il tessuto del colon di circa 1-2 cm di lunghezza è stato prelevato da ciascun segmento. Inoltre, i tessuti del colon di 2 cm di lunghezza (~ 4-6 cm dalla fine del colon) dei ratti trattati con soluzione salina sono stati presi come controllo fittizio (S) (Figura 1).
  7. Prelevare campioni di tessuto da ciascun sito per la preparazione a tutto spessore e, se lo si desidera, rispettivamente gli strati di mucosa/sottomucosa e muscularis externa e21,22.
  8. Congelare i campioni di tessuto in azoto liquido prima di conservarli a -80 °C per la conservazione fino a un anno e per scopi futuri (ad esempio, preparati di RNA).

3. Valutazione istopatologica dell'infiammazione intestinale e della fibrosi

  1. Fissare i tessuti del colon a tutto spessore in formalina al 10% per 48 ore, quindi trasferire al 70% di etanolo per 24-48 ore.
  2. Utilizzare un microtomo per tagliare sezioni di paraffina di 5 μm di spessore rispettivamente per ematossilina ed eosina (H &E) e le macchie tricrome di Masson 6,19,23 (vedi Tabella dei materiali).
  3. Acquisire e visualizzare le immagini con un microscopio verticale dotato di una telecamera ad alta risoluzione con software compatibile (vedere Tabella dei materiali).
  4. Indici di infiammazione e fibrosi di grado da parte di due ricercatori indipendenti, tra cui un patologo chirurgico gastrointestinale secondo i criteri descritti in precedenza 6,23 con modifiche. Vedere il file supplementare 1 per i punteggi.
  5. Misurare lo spessore e il numero di cellule degli strati muscolari circolari e longitudinali per sezione trasversale in quattro viste di ciascun campione colorato H & E e prendere la media delle quattro misurazioni per ciascun campione.

4. Estrazione di RNA e RT-PCR quantitativa

  1. Omogeneizzare i tessuti del colon asportati ottenuti dal controllo fittizio e tre siti (P, I, D) di ratti colite TNBS nel reagente di estrazione di un kit di estrazione dell'RNA (vedi Tabella dei materiali).
  2. Isolare l'RNA da ciascun campione utilizzando il kit. Eluire il pellet di RNA in 30 μL di acqua priva di RNasi.
  3. Quantificare la concentrazione di RNA e verificarne la purezza utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis a microvolume (vedere Tabella dei materiali).
  4. Utilizzare 1 μg di RNA totale per sintetizzare il cDNA 21,22 utilizzando il kit di sintesi dell'RNA (vedere Tabella dei materiali).
  5. Analizzare e quantificare i livelli di espressione genica eseguendo la PCR in tempo reale con 50 ng di cDNA come modello, sonde di IL-6 e CTGF utilizzando un kit PCR commerciale per il sistema PCR in tempo reale (vedere Tabella dei materiali).
  6. Utilizzare il gene di controllo 18S rRNA per normalizzare i campioni e quantificare l'espressione genica relativa utilizzando i valori Cq ottenuti.

5. Analisi statistica

  1. Utilizzare un software di analisi statistica (vedere Tabella dei materiali) per confrontare il controllo fittizio e i ratti colite TNBS.
  2. Si consideri il valore p < 0,05 statisticamente significativo15,19.
  3. Per testare le differenze tra due gruppi, utilizzare l'analisi t-test dello studente ed eseguire un test ANOVA se i confronti sono più di due gruppi15,19.

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Risultati

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Visione macroscopica della colite simile al Crohn indotta dall'instillazione intra-colon di TNBS
Come mostrato nella Figura 1, l'instillazione intracolonica di TNBS nei ratti ha indotto un'infiammazione transmurale localizzata (~ 2 cm di lunghezza) con parete intestinale ispessita e lume ristretto (stenosi) nel sito di instillazione nel colon distale (Figura 1A). Il sito di instillazione di TNBS è indicato come sito I. Come risultato dell'inf...

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Discussione

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La colite indotta da TNBS è stata introdotta nel 1989 ed è stata utilizzata come modello sperimentale della malattia di Crohn da allora 19,20,23. Le caratteristiche significative di questo modello nei roditori includono lo sviluppo di un'infiammazione transmurale che assomiglia molto alle lesioni istopatologiche sviluppate nella malattia di Crohn umana19,20. Precedenti s...

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Dichiarazioni

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Gli autori non segnalano alcun conflitto di interessi e non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è supportato in parte da sovvenzioni di NIH (R01 DK124611 a XZS) e del Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti (W81XWH-20-1-0681 a XZS). Il lavoro di istologia è stato svolto con l'aiuto del laboratorio di patologia chirurgica utmb.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Software di controllo ACT-1 Ver2.63NikonDXM1200F
C1000 Touch Thermal Cycler con modulo di reazione rapida a 96 pozzettiModulo di reazione ottica BIO-RAD1851196
CFX96 per sistemi di PCR in tempo realeBIO-RAD1845097
Dako Agilent Artisan Link Pro Coloratore specialeDakoAR310
Dako-Agilent Masson's Kit tricromatico ref# AR173DakoAR173
DXM1200 Fotocamera digitale a colori HRNikonDXM1200
Eucariotico 18S rRNA Controllo endogenoThermoFisher Scientific4352930E
EZ AnesthesiaE-Z Systems Inc.EZ-155
GraphPad Prism 9GraphPad9.0.2 (161)
Piastre PCR a 96 pozzetti, basso profilo, parete sottile, bordatura, bianco/trasparenteBIO-RADHSP9601
HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x senza calcio e magnesio)CORNING21-021-CV
HM 325 MicrotomeThermo Scientific23-900-667
IsofluranoPiramalNDC 66794-017-10
LI-COR Odyssey Sistema di imaging digitaleLI-COR9120
Mastercycler epGradient Thermal Cycler con pannello di controllo 5340 Thermal CyclerEppendorf5341
Catetere in poliuretano aperto per uso medicoCovidien8890703013
NanoDrop 2000/2000c SpettrofotometriThermo Fisher ScientificND2000CLAPTOP
Nikon Eclipse E800 Microscopio verticaleNikonE800
Nitrocellulosa/carta da filtro Panini Confezione da 50, 0,45 μ m, 7 x 8,5 cmBIO-RAD1620215
Polietilenglicole 3350, Lassativo osmoticoMiralaxC8175Dose: 17 g in 226 mL di acqua
RNeasy Mini Kit (250)
250 RNeasy Mini Spin Columns, provette di raccolta (1,5 mL e 2 mL), reagenti e tamponi privi di RNasi		QIAGEN74106
SuperScript III Sistema di sintesi a primo filamentoThermoFisher Scientific18080051
Saggi di espressione genica TaqMan Rn00573960_g1 sonda CTGFThermoFisher Scientific4331182
Saggi di espressione genica TaqMan Rn99999011_m1 sonda IL6ThermoFisher Scientific4331182
TaqMan Fast Advanced Master MixThermoFisher Scientific4444557
Tissue-Tek Prisma H& E Stain Kit #1Sakura6190
Tissue-Tek Prisma Plus Coloratore automatico per vetriniSakura6171
TNBS (soluzione di acido picrilsolfonico)SIGMA-ALDRICH92822

Riferimenti

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Errata corrige

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Formal Correction: Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease
Posted by JoVE Editors on 5/20/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. The Introduction and Protocol were updated.

The first sentence of the Introduction was updated from:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

to:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

Step 1.3 in the Protocol was updated from:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol was used.

to:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol/saline was used.

Tag

Modello di colite da TNBSInfiammazione transmuraleFibrosi intestinaleStenosi luminaleDistensione colicaRimodellamento tissutaleEspressione genica

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