Il presente protocollo descrive lo sviluppo di un modello di colite simile al Crohn nei roditori. L'infiammazione transmurale porta alla stenosi nel sito di instillazione del TNBS e l'allargamento meccanico è osservato nel segmento prossimale alla stenosi. Questi cambiamenti consentono di studiare lo stress meccanico nella colite.
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Articolo metodologico
Un modello di roditore indotto da TNBS per studiare il ruolo patogeno dello stress meccanico nella malattia di Crohn
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Sommario
Abstract
Le malattie infiammatorie intestinali (IBD) come il morbo di Crohn (CD) sono disturbi infiammatori cronici del tratto gastrointestinale che colpiscono circa 20 per 1.00.000 in Europa e negli Stati Uniti. La CD è caratterizzata da infiammazione transmurale, fibrosi intestinale e stenosi luminale. Sebbene le terapie antinfiammatorie possano aiutare a controllare l'infiammazione, non hanno efficacia sulla fibrosi e sulla stenosi nella CD. La patogenesi della CD non è ben compresa. Gli studi attuali si concentrano principalmente sulla delineazione dei meccanismi di risposta immunitaria intestinale disregolati. Mentre l'infiammazione transmurale associata a CD, la fibrosi intestinale e la stenosi luminale rappresentano tutte uno stress meccanico alla parete intestinale, il ruolo dello stress meccanico nella CD non è ben definito. Per determinare se lo stress meccanico svolge un ruolo patogeno indipendente nella CD, è stato sviluppato un protocollo di colite CD-like indotta da TNBS nei roditori. Questo modello di infiammazione e fibrosi transmurale indotta da TNBS assomiglia ai segni patologici della CD nel colon. È indotta dall'instillazione intracolonica di TNBS nel colon distale di ratti adulti Sprague-Dawley. In questo modello, l'infiammazione transmurale porta alla stenosi nel sito di instillazione del TNBS (Sito I). La distensione meccanica si osserva nella porzione prossimale al sito di instillazione (Sito P), rappresentando lo stress meccanico ma non l'infiammazione visibile. La porzione del colon distale all'infiammazione (Sito D) non presenta né infiammazione né stress meccanico. Sono stati osservati cambiamenti distintivi dell'espressione genica, della risposta immunitaria, della fibrosi e della crescita muscolare liscia in diversi siti (P, I e D), evidenziando un profondo impatto dello stress meccanico. Pertanto, questo modello di colite simile alla CD ci aiuterà a comprendere meglio i meccanismi patogenetici della CD, in particolare il ruolo dello stress meccanico e dell'espressione genica indotta dallo stress meccanico nella disregolazione immunitaria, nella fibrosi intestinale e nel rimodellamento dei tessuti nella CD.
Introduzione
La malattia infiammatoria intestinale (IBD), compresa la colite ulcerosa (UC) e il morbo di Crohn (CD), è caratterizzata da infiammazione cronica nel tratto gastrointestinale (GI). Colpisce ~ 1-2 milioni di americani1. I costi annuali stimati per l'assistenza IBD negli Stati Uniti sono di $ 11,8 miliardi. A differenza della UC, il CD è caratterizzato da infiammazione transmurale e formazione di stenosi 2,3. La formazione di stenosi (stenosi) si verifica fino al 70% dei pazienti con CD3 e può essere causata da infiammazione transmurale (stenosi infiammatoria) o fi....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo il comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Texas Medical Branch (#0907051C). Per lo studio sono stati utilizzati ratti Sprague-Dawley maschi o femmine, di circa 8-9 settimane.
1. Preparazione animale
- Ratti veloci per 24 ore e trattarli con lassativo (detergente intestinale, vedi Tabella dei materiali) durante la notte.
- Il giorno successivo, anestetizzare i ratti utilizzando un sistema di anestesia (vedi Tabella dei materiali) esponendoli al 2% di isoflurano insieme a 1 L ....
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Risultati
Visione macroscopica della colite simile al Crohn indotta dall'instillazione intra-colon di TNBS
Come mostrato nella Figura 1, l'instillazione intracolonica di TNBS nei ratti ha indotto un'infiammazione transmurale localizzata (~ 2 cm di lunghezza) con parete intestinale ispessita e lume ristretto (stenosi) nel sito di instillazione nel colon distale (Figura 1A). Il sito di instillazione di TNBS è indicato come sito I. Come risultato dell'inf.......
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Discussione
La colite indotta da TNBS è stata introdotta nel 1989 ed è stata utilizzata come modello sperimentale della malattia di Crohn da allora 19,20,23. Le caratteristiche significative di questo modello nei roditori includono lo sviluppo di un'infiammazione transmurale che assomiglia molto alle lesioni istopatologiche sviluppate nella malattia di Crohn umana19,20. Precedenti s.......
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Dichiarazioni
Gli autori non segnalano alcun conflitto di interessi e non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è supportato in parte da sovvenzioni di NIH (R01 DK124611 a XZS) e del Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti (W81XWH-20-1-0681 a XZS). Il lavoro di istologia è stato svolto con l'aiuto del laboratorio di patologia chirurgica utmb.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Software di controllo ACT-1 Ver2.63 | Nikon | DXM1200F | |
| C1000 Touch Thermal Cycler con modulo di reazione rapida a 96 pozzetti | Modulo di reazione ottica BIO-RAD | 1851196 | |
| CFX96 per sistemi di PCR in tempo reale | BIO-RAD | 1845097 | |
| Dako Agilent Artisan Link Pro Coloratore speciale | Dako | AR310 | |
| Dako-Agilent Masson's Kit tricromatico ref# AR173 | Dako | AR173 | |
| DXM1200 Fotocamera digitale a colori HR | Nikon | DXM1200 | |
| Eucariotico 18S rRNA Controllo endogeno | ThermoFisher Scientific | 4352930E | |
| EZ Anesthesia | E-Z Systems Inc. | EZ-155 | |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad | 9.0.2 (161) | |
| Piastre PCR a 96 pozzetti, basso profilo, parete sottile, bordatura, bianco/trasparente | BIO-RAD | HSP9601 | |
| HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x senza calcio e magnesio) | CORNING | 21-021-CV | |
| HM 325 Microtome | Thermo Scientific | 23-900-667 | |
| Isoflurano | Piramal | NDC 66794-017-10 | |
| LI-COR Odyssey Sistema di imaging digitale | LI-COR | 9120 | |
| Mastercycler epGradient Thermal Cycler con pannello di controllo 5340 Thermal Cycler | Eppendorf | 5341 | |
| Catetere in poliuretano aperto per uso medico | Covidien | 8890703013 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spettrofotometri | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Nikon Eclipse E800 Microscopio verticale | Nikon | E800 | |
| Nitrocellulosa/carta da filtro Panini Confezione da 50, 0,45 μ m, 7 x 8,5 cm | BIO-RAD | 1620215 | |
| Polietilenglicole 3350, Lassativo osmotico | Miralax | C8175 | Dose: 17 g in 226 mL di acqua |
| RNeasy Mini Kit (250) 250 RNeasy Mini Spin Columns, provette di raccolta (1,5 mL e 2 mL), reagenti e tamponi privi di RNasi | QIAGEN | 74106 | |
| SuperScript III Sistema di sintesi a primo filamento | ThermoFisher Scientific | 18080051 | |
| Saggi di espressione genica TaqMan Rn00573960_g1 sonda CTGF | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Saggi di espressione genica TaqMan Rn99999011_m1 sonda IL6 | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4444557 | |
| Tissue-Tek Prisma H& E Stain Kit #1 | Sakura | 6190 | |
| Tissue-Tek Prisma Plus Coloratore automatico per vetrini | Sakura | 6171 | |
| TNBS (soluzione di acido picrilsolfonico) | SIGMA-ALDRICH | 92822 |
Riferimenti
- Kappelman, M. D., et al. The prevalence and geographic distribution of Crohn's disease and ulcerative colitis in the United States. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).
- Hwang, J. M., Varma, M. G.
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease
Posted by JoVE Editors on 5/20/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. The Introduction and Protocol were updated.
The first sentence of the Introduction was updated from:
Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.
to:
Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.
Step 1.3 in the Protocol was updated from:
Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol was used.
to:
Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol/saline was used.
