Qui, presentiamo un protocollo per isolare e purificare la microglia primaria in modelli animali di malattie demielinizzanti, utilizzando lo smistamento cellulare magnetico-attivato colonnare.
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Articolo metodologico
Isolamento di microglia primarie di topo mediante smistamento cellulare ad attivazione magnetica in modelli animali di demielinizzazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le microglia, le cellule immunitarie innate residenti nel cervello, sono i principali rispondenti all'infiammazione o alle lesioni nel sistema nervoso centrale (SNC). La microglia può essere suddivisa in stato di riposo e stato attivato e può cambiare rapidamente stato in risposta al microambiente del cervello. Le microglia saranno attivate in diverse condizioni patologiche e presenteranno fenotipi diversi. Inoltre, ci sono molti sottogruppi diversi di microglia attivate e una grande eterogeneità tra diversi sottogruppi. L'eterogeneità dipende principalmente dalla specificità molecolare della microglia. Gli studi hanno rivelato che la microglia sarà attivata e svolgerà un ruolo importante nel processo patologico di demielinizzazione infiammatoria. Per comprendere meglio le caratteristiche della microglia nelle malattie infiammatorie demielinizzanti come la sclerosi multipla e il disturbo dello spettro della neuromielite ottica, proponiamo un protocollo di smistamento microgliale primario perilesionale. Questo protocollo utilizza il cartomanziamento cellulare attivato magneticamente colonnare (MACS) per ottenere microglia primarie altamente purificate e preservare le caratteristiche molecolari della microglia per studiare i potenziali effetti della microglia nelle malattie demielinizzanti infiammatorie.
Introduzione
Le microglia provengono da progenitori del sacco vitellino, che raggiungono il cervello embrionale molto presto e partecipano allo sviluppo del SNC 1,2. Ad esempio, sono coinvolti nella potatura sinaptica3 e nella regolazione della crescita assonale4. Secernono fattori che promuovono la sopravvivenza neuronale e aiutano la localizzazione neuronale5. Allo stesso tempo, sono coinvolti nella rimozione di cellule anormali e cellule apoptotiche per garantire il normale sviluppo del cervello6. Inoltr....
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Protocollo
Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dall'Institute of Animal Care Committee del Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Cina.
1. Materiali
- Preparare le soluzioni seguenti prima di iniziare il protocollo.
- Preparare il tampone di carico aggiungendo siero bovino fetale (FBS, 2%) alla soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Aggiungere colorante rosso neutro (NR) (finale 1%) al PBS.
- Preparare le seguenti soluzioni utilizzando il kit di dissociazione del cervello adulto disponibile in commercio (vedere la tabella dei....
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Risultati
Le microglia isolate con perline CD11b hanno un'elevata purezza
Le cellule microgliali intorno alle lesioni nei modelli murini di demielinizzazione sono state isolate utilizzando il protocollo sopra menzionato e testate mediante citometria a flusso. Le cellule sono etichettate fluorescentemente con ISOTIOCIANATO CD11b-Fluoresceina (FITC) e CD45-alloficocianina (APC) per determinare la microglia nella citometria a flusso secondo le istruzioni del produttore. Esistono diverse letterature che dimostrano .......
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Discussione
Il protocollo propone un metodo per isolare la microglia attorno alle lesioni demielinizzanti, che può aiutare a studiare le caratteristiche funzionali della microglia nelle malattie infiammatorie demielinizzanti. Le microglia catturate utilizzando perline CD11b mostrano un'elevata purezza e vitalità. I passaggi critici del protocollo includono la localizzazione precisa dei fuochi e la purificazione microgliale ottimale. Nella fase di protocollo 2.1, è necessario iniettare la soluzione NR 2 ore prima di sacrificare il mo.......
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Dichiarazioni
Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Lo studio è stato sostenuto dalla Tongji Hospital (HUST) Foundation for Excellent Young Scientist (Grant No. 2020YQ06).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette per microcentrifuga da 1,5 mL | BIOFIL | CFT001015 | |
| Provette per centrifuga da 15 mL | BIOFIL | CFT011150 | |
| Provette per centrifuga da 50 mL | BIOFIL | CFT011500 | |
| 70 &; m Filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Kit di dissociazione cerebrale adulta, topo e ratto | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
| C57BL/6J Topi | SJA Labs | ||
| CD11b (Microglia) Perline, umano e topo | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Siero fetale bovino | BOSTER | PYG0001 | |
| FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Separatore MiniMACS | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Colonne MS | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Citometro a | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
| NovoCyte | Agilent | Un sistema composto da NovoExpress | |
| Agilent | 1.4.1 | ||
| PBS | BOSTER | PYG0021 | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Stereomicroscopio | MshOt | MZ62 |
Riferimenti
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), New York, N.Y. 86-90 (2012).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is ....
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Ristampe e permessi
