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Articolo metodologico

Analisi della segnalazione lipidica nei fotorecettori di Drosophila mediante spettrometria di massa

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DOI:

10.3791/63516

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7 marzo 2022

 ,  ,  , 
1National Centre for Biological Sciences-TIFR, GKVK Campus, 2Department of Cell Biology, Yale University, 3Department of Neuroscience, Brown University

In questo articolo

Sommario

Il manoscritto presenta protocolli di spettrometria di massa versatili, robusti e sensibili per identificare e quantificare diverse classi di lipidi dai fotorecettori di Drosophila .

Abstract

L'attivazione della fosfolipasi Cβ (PLCβ) è un passaggio essenziale durante la trasduzione sensoriale nei fotorecettori della Drosophila . L'attività della PLCβ provoca l'idrolisi del fosfatidilinositolo 4,5 bisfosfato del lipide di membrana [PI(4,5)P2] che porta infine all'attivazione dei canali del potenziale recettoriale transitorio (TRP) e TRP like (TRPL). L'attività di PLCβ porta anche successivamente alla generazione di molte specie lipidiche, molte delle quali sono state proposte per svolgere un ruolo nell'attivazione di TRP e TRPL. Inoltre, è stato proposto che diverse classi di lipidi svolgano un ruolo chiave nell'organizzazione della biologia cellulare dei fotorecettori per ottimizzare le reazioni di segnalazione per una trasduzione sensoriale ottimale. Storicamente, queste scoperte sono state guidate dalla capacità di isolare i mutanti di Drosophila per gli enzimi che controllano i livelli di lipidi specifici ed eseguire analisi della fisiologia dei fotorecettori in questi mutanti. Più recentemente, sono stati sviluppati potenti metodi di spettrometria di massa per l'isolamento e l'analisi quantitativa di lipidi con elevata sensibilità e specificità. Questi sono particolarmente adatti per l'uso in Drosophila , dove l'analisi dei lipidi è ora possibile dai fotorecettori senza la necessità di marcatura con radionuclidi. In questo articolo, vengono trattate le considerazioni concettuali e pratiche nell'uso della spettrometria di massa lipidica per la valutazione quantitativa robusta, sensibile e accurata di vari lipidi di segnalazione nei fotorecettori di Drosophila . Insieme ai metodi esistenti nella genetica molecolare e nell'analisi fisiologica, è probabile che tali lipidi aumentino la potenza dei fotorecettori come sistema modello per le scoperte in biologia.

Introduzione

La fototrasduzione in Drosophila è mediata da una cascata di PLCβ accoppiata a proteine G che porta all'attivazione dei canali attivati dalla luce TRP e TRPL1. PLCβ idrolizza il fosfolipide legato alla membrana, il fosfatidilinositolo 4,5 bisfosfato [PI(4,5)P2] e genera diacilglicerolo (DAG) e inositolo 1,4,5 trisfosfato (IP3). Il DAG viene quindi fosforilato dalla DAG-chinasi per generare acido fosfatidico (PA). Successivamente, attraverso una serie di reazioni che coinvolgono la generazione di intermedi lipidici, PI(4,5)P2 viene rigenerato2. Diversi componenti di questo ciclo PI(4,5)P2 hanno funzioni nei fotorecettori della Drosophila . Il meccanismo attraverso il quale l'attivazione del PLC porta al gating dei canali TRP e TRPL rimane irrisolto. Tuttavia, diverse linee di evidenza suggeriscono che gli intermedi lipidici generati dall'idrolisi PI(4,5)P2 possono mediare questo processo3. Pertanto, è molto importante identificare e quantificare questi intermedi lipidici per far luce sul meccanismo di attivazione di TRP e TRPL nella fototrasduzione di Drosophila . Oltre al loro ruolo nella fototrasduzione di per sé, i lipidi svolgono anche diversi ruoli importanti nell'organizzazione cellulare dei fotorecettori (rivisti in3). La comprensione di questi ruoli funzionali dei lipidi è aiutata dalla capacità di rilevare e quantificare i loro livelli in vivo. Questo articolo fornisce una panoramica e i protocolli per la scelta e l'implementazione di metodi per quantificare i lipidi dei fotorecettori di Drosophila .

Storicamente, l'analisi dei lipidi consisteva nel frazionamento per classi chimiche seguito dall'analisi delle singole classi. Per identificare e quantificare con successo i lipidi, sono stati sviluppati molti metodi analitici che sono analisi lipidiche mirate o non mirate 4,5,6,7,8,9,10. L'analisi mirata si concentra su lipidi noti e utilizza un metodo specifico ad alta sensibilità per l'analisi quantitativa di questi lipidi specifici. L'analisi lipidica non mirata mira a rilevare contemporaneamente molte specie lipidiche in un campione. Questi metodi analitici includono la cromatografia su strato sottile (TLC)4, la gascromatografia (GC)5, la cromatografia liquida (LC)6, i saggi di immunoassorbimento enzimatico (ELISA)7, la risonanza magnetica nucleare (NMR)8, la marcatura di radionuclidi e la spettrometria di massa (MS)9,10. Sebbene la marcatura radioattiva sia un metodo sensibile per la rilevazione dei lipidi e possa essere utilizzata nel contesto di cellule in coltura, il suo utilizzo nell'analisi dei lipidi in organismi intatti come la Drosophila è impegnativo a causa di considerazioni di sicurezza della radiomarcatura di animali volanti vivi. L'altra sfida con la marcatura radioattiva è che dipende dalla marcatura di tutti i pool di precursori in prossimità dell'equilibrio e questo può essere difficile nel contesto dei modelli in vivo.

L'analisi completa dei lipidi mediante MS è un recente progresso reso possibile dallo sviluppo delle moderne tecnologie MS11. L'analisi dei lipidi basata sulla MS offre diversi vantaggi, tra cui campioni di piccole dimensioni, applicabilità a campioni provenienti da modelli animali, elevata sensibilità, specificità e alta produttività. In particolare, l'uso estensivo della ionizzazione elettrospray ha portato ad un miglioramento delle prestazioni della MS per l'analisi dei lipidi. Il miglioramento degli analizzatori di massa negli spettrometri di massa, compresa la combinazione di diversi analizzatori di massa, ha aggiunto ulteriori vantaggi e lo sviluppo di un analizzatore di massa ad alta risoluzione ha rilanciato gli studi sui lipidi11. L'analisi basata sulla MS caratterizza le molecole lipidiche in due modi principali: (1) lipidomica top-down in cui gli esperimenti MS mirano a una rapida caratterizzazione quantitativa dei cambiamenti globali all'interno del lipidoma e si basano esclusivamente su masse accurate di precursori lipidici intatti12; (2) Lipidomica bottom-up, che quantifica le singole specie molecolari rilevando frammenti strutturali caratteristici di ioni utilizzando il tandem MS13,14.

Nel complesso, l'analisi dei lipidi nei fotorecettori di Drosophila consiste in due fasi: in primo luogo, l'estrazione dei lipidi dal tessuto oculare/cranico e in secondo luogo, l'analisi dei lipidi estratti mediante SM. Questo può essere eseguito utilizzando uno dei seguenti metodi: separazione dei lipidi mediante cromatografia liquida (LC) accoppiata a MS o senza separazione cromatografica utilizzando la lipidomica shotgun/MS per infusione diretta (DIMS). Entrambi gli approcci di profilazione lipidica si basano sull'uso di MS a ionizzazione elettrospray (ESI-MS) e si sono dimostrati sensibili, quantitativi ed efficienti10,15. Nell'analisi DIMS, l'identificazione dei lipidi si basa sulla massa degli ioni precursori, sulle scansioni di perdita neutra e sulle firme specifiche della classe lipidica 14,16,17,18. Sebbene questo approccio combini la velocità di analisi e la robustezza, la soppressione ionica dei lipidi a bassa abbondanza a causa della presenza di lipidi ad alta abbondanza e altamente polarizzabili nel campione non può essere evitata. Pertanto, i lipidi poco abbondanti come i fosfoinositidi e la PA spesso non vengono rilevati o vengono rilevati scarsamente dalle piattaforme DIMS standard, a causa della soppressione ionica tra le altre ragioni19,20. La separazione con cromatografia liquida prima della MS (LC-MS) può aiutare a superare la soppressione ionica e a focalizzare l'analisi di specifiche classi o specie di lipidi di interesse21.

In questo articolo vengono descritti i passaggi necessari per quantificare i principali lipidi di interesse nei fotorecettori della Drosophila. A questo proposito, sono stati ottimizzati tre diversi approcci MS: (1) DIMS utilizzando uno spettrometro di massa ad alta risoluzione, (2) cromatografia liquida in fase inversa post-derivatizzazione-MS (RPLC-MS) utilizzando uno spettrometro di massa triplo quadruplo e (3) cromatografia liquida in fase normale-monitoraggio di reazioni multiple-scansione ionica del prodotto potenziata (NPLC-MRM-EPI-MS) utilizzando uno spettrometro di massa triplo quadruplo con una funzione di scansione ionica del prodotto migliorata. La scelta tra questi metodi è dettata dalle specifiche domande di ricerca oggetto di indagine. Per una descrizione e un'analisi globale di tutti i tipi di glicerofosfolipidi coinvolti nella fototrasduzione, è necessario utilizzare DIMS. Tuttavia, va notato che in questo approccio è improbabile che vengano rilevati glicerofosfolipidi a bassa polarizzabilità e bassa abbondanza22. Per rilevare questi lipidi a bassa abbondanza, è necessario eseguire la RPLC-MS post-derivatizzazione. Utilizzando questo approccio, abbiamo rilevato e quantificato con successo l'acido fosfatidico (PA)23,24,25, il fosfatidilinositolo (PI), il fosfatidilinositolo 5 fosfato (PI5P)26, il fosfatidilinositolo 4 fosfato (PI4P) e il PI(4,5)P 2 27. I metodi DIMS e RPLC-MS post-derivatizzazione generano informazioni a livello di classe lipidica. Ad esempio, utilizzando questi due metodi si può quantificare PA (34:2) il cui m/z è coerente con molteplici specie molecolari tra cui: (i) PA (16:0/18:2), (ii) PA (18:2/16:0), (iii) PA (16:2/18:0), (iv) PA (18:0/16:2), (v) PA (16:1/18:1), (vi) PA (18:1/16:1), (vii) PA (14:2/20:0) e (viii) PA (20:0/14:2). Utilizzando questi metodi, non è possibile ottenere informazioni sulla composizione della catena acilica grassa del PA (34:2) presente nel campione. Questa sfida può essere superata con un metodo ibrido di SM che abbina la separazione LC, il monitoraggio delle reazioni multiple (MRM) e la scansione ionica avanzata del prodotto (EPI). Questo metodo è sia sensibile che quantitativo e consente: la misurazione diretta, cioè senza alcuna pre-etichettatura o post-elaborazione del campione, e stabilisce la specie molecolare con le informazioni esatte sulla catena acilica grassa25. Utilizzando questo metodo, abbiamo identificato un gran numero di specie molecolari di PA e determinato l'esatta composizione delle catene aciliche grasse a SN1 e SN2 della spina dorsale del glicerolo. Questo approccio sarà utile quando si analizza la funzione di specifiche specie molecolari di qualsiasi classe di lipidi nei fotorecettori. I protocolli dettagliati qui presentati per ciascuno di questi tipi di analisi possono essere adattati ad altri lipidi di segnalazione rilevanti per la funzione dei fotorecettori di Drosophila (per gli schemi vedere la Figura 1). Va notato che metodi dettagliati per l'analisi lipidomica di diverse altre classi di lipidi (non trattati in questo articolo), sono stati descritti altrove. Questi includono ceramidi 28,29, sfingolipidi30,31, lipidi neutri come digliceridi e trigliceridi32,33 e steroli15,33. In alcuni casi, sono stati descritti metodi per l'analisi di questi lipidi per i tessuti larvali di Drosophila e potrebbero essere adattati per l'uso nei fotorecettori.

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Protocollo

1. Allevamento di mosche e preparazione di prodotti chimici

  1. Mosche posteriori (Drosophila melanogaster) su cibo standard per mosche in un'incubatrice con il 50% di umidità relativa a 25 °C senza illuminazione interna. Preparare il cibo per mosche aggiungendo 80 g/L di farina di mais, 20 g/L di D-glucosio, 40 g/L di saccarosio, 8 g/L di agar, 15 g/L di estratto di lievito, 4 mL di acido propionico, 0,7 g/L di TEGO (metil para idrossibenzoato) e 0,6 mL di acido ortofosforico come descritto in34 e sono disponibili anche a https:// bangalorefly.ncbs.res.in/drosophila-media-preparation. Coltiva una serie di mosche, post-eclosioni, in un'incubatrice raffreddata mantenuta a 25 °C con illuminazione continua a luce bianca di ~2.000 lux.
  2. Preparare il tampone di eluizione del fosfoinositide (PEB) aggiungendo cloroformio:metanolo:2,4 M di acido cloridrico in un rapporto di 250:500:200 (vol/vol/vol). Preparare il tampone di lavaggio a fase inferiore (LPWS) aggiungendo metanolo:1 M acido cloridrico:cloroformio in un rapporto di 235:245:15 (vol/vol/vol). Preparare la soluzione di lavaggio post-derivatizzazione aggiungendo cloroformio:metanolo:acqua in un rapporto 8:4:3 (vol/vol/vol).
    NOTA: Utilizzare solventi e prodotti chimici di grado MS. Non conservare il tampone PEB e LPWS per più di 3 mesi.
  3. Utilizzare la colonna C4 (1,7 μm x 1 mm x 100 mm) per i fosfoinositidi, PI4P e PI(4,5)P2 e la colonna C18 (1,0 mm x 100 mm x 1,7 mm) per PA, fosfatidilcolina (PC) e fosfatidilinositolo (PI). Per il metodo NPLC-MRM-EPI, utilizzare la colonna di silice (1 mm x 150 mm x 3 μm).
  4. Preparare l'eluente A aggiungendo esano:alcol isopropilico:100 mM acetato acquoso di ammonio in un rapporto 68:30:2 (vol/vol/vol) e l'eluente B aggiungendo esano:alcol isopropilico:100 mM acetato acquoso di ammonio in rapporto 70:20:10 (vol/vol/vol) per PA, PC e PI. Preparare il solvente A per i fosfoinositidi aggiungendo lo 0,1% di acido formico in acqua e il solvente B aggiungendo lo 0,1% di acido formico in acetonitrile.

2. Isolamento del tessuto

  1. Raccogli 10 mosche per campione usando l'anestesia con anidride carbonica (CO2) (le mosche si immobilizzano in pochi secondi) e decapita le mosche usando una lama affilata su una piastra anestetizzante CO2 .
  2. Raccogliere i moscerini scuri o chiari di età definita (12-24 ore) in provette da 1,5 ml e congelarli in azoto liquido. Disidratare i moscerini in acetone a -80 °C per 48 ore in un flaconcino di vetro35. Per il tessuto retinico, raccogliere 100 retine da mosche liofilizzate. Usando un bisturi, rimuovi gli occhi dal resto della testa e raccogli la retina.
  3. Per l'analisi dei fosfoinositidi PI4P e PI(4,5)P2 , quando si lavora con retine fresche, utilizzare 25 retine per campione da mosche cresciute in condizioni di illuminazione appropriata per misurare i livelli di lipidi durante l'illuminazione e da mosche cresciute senza luce per misurare i livelli di lipidi al buio. Conservare in 50 μl di 1x PBS in provette omogeneizzatrici su ghiaccio secco fino al momento dell'estrazione.

3. Estrazione dei lipidi

ATTENZIONE: Il cloroformio è un solvente tossico ed è di natura cancerogena. Colpisce il sistema riproduttivo ed è irritante per la pelle e gli occhi. È necessario prendere precauzioni nella manipolazione di questa sostanza chimica. Tutte le fasi che coinvolgono il cloroformio devono essere eseguite in una cappa chimica ben ventilata.

  1. Per tutti i glicerofosfolipidi diversi da PI4P e PI(4,5)P2
    1. Per ogni campione, omogeneizzare 10 teste di mosca o 100 retine (raccolte come descritto al punto 2.2) in 0,1 mL di HCl metanolico ghiacciato 0,1 N e 30 μL di miscela standard interna (PA (17:0/14:1), PC (17:0/14:1), acido lisofosfatidico (LPA; 13:0), lisofosfatidilcolina (LPC; 13:0), LPC (17:1), PA (17:0/17:0), PA (16:0-D31/18:1), LPA (17:1), LPC (19:0), PI (12:0/13:0), PA (12:0/13:0) e PC (12:0/13:0)). Preparare gli standard in modo tale che la quantità finale di qualsiasi standard lipidico rientri nella curva di risposta lineare dello spettrometro di massa.
    2. Omogeneizzare i tessuti utilizzando un omogeneizzatore automatico che consente il trattamento rapido e simultaneo di tutti i campioni. Far girare brevemente le provette in una centrifuga da tavolo e assicurarsi che non si formi pellet: questo indica una completa omogeneizzazione. Trasferire l'omogeneizzato metanolico in una provetta da microcentrifuga da 2 mL con tappo.
    3. Aggiungere 0,2 mL di HCl metanolico 0,1 N ghiacciato per recuperare il materiale residuo nella provetta e combinare nella provetta da 2 mL. Aggiungere 0,1 mL di HCl metanolico ghiacciato 0,1 N seguito da 0,8 mL di cloroformio e mescolare accuratamente. Lasciare riposare la miscela, contenente omogeneizzato di tessuto, sul ghiaccio per 10 minuti, quindi aggiungere 0,4 mL di KCl allo 0,88% e vorticare per 30 s.
    4. Centrifugare la miscela a 1.000 x g per 10 minuti a 4 °C per separare la fase acquosa da quella organica. Estrarre con molta attenzione la fase organica inferiore contenente lipidi senza mescolarla con la fase acquosa e trasferirla in una provetta da microcentrifuga fresca da 2 mL.
      NOTA: Durante l'estrazione dei lipidi, trasferire la fase organica inferiore con la massima cura per evitare la miscelazione con la fase acquosa, che potrebbe ostacolare l'analisi dei lipidi a valle.
    5. Essiccare questa soluzione lipidica in un evaporatore sottovuoto a 4 °C, ispezionare visivamente il campione per garantire la completa asciugatura. Risospendere in 420 μl di miscela metanolo:cloroformio 2:1 per l'analisi. Analizza i campioni immediatamente senza conservarli.
  2. Per fosfoinositidi PI4P e PI(4,5)P2
    1. Omogeneizzare 25 retine in 950 μL di tampone di eluizione fosfoinositide (PEB; 250 mL di CHCl3, 500 mL di metanolo e 200 mL di 2,4 M HCl) e aggiungere standard interni (fosfatidiletanolammina (PE) 17:0/14:1; PI (17:0/14:1); PI4P (17:0/20:4); e miscela PI(4,5)P2 (16:0/16:0)) contenente 50 ng di PI, 25 ng di PI4P, 50 ng di PI(4,5)P2 e 0,2 ng di PE per campione.
    2. Aggiungere 250 μl ciascuno di cloroformio e 2,4 M di HCl, seguito da sonicazione per 2 minuti e centrifugazione a 1.000 x g per 5 minuti a 4 °C per la separazione di fase. Estrarre la fase organica inferiore in una provetta nuova, lavare con 900 μl di LPWS e centrifugare a 1.000 x g per 5 minuti a 4 °C.
    3. Estrarre i lipidi dalla fase acquosa rimanente eseguendo nuovamente una separazione di fase come al punto 3.2.2. Essiccare le fasi organiche raccolte in una centrifuga sottovuoto impostata a 4 °C, ispezionare visivamente i campioni per garantire la completa essiccazione.

4. Saggio del fosfato organico

  1. Preparare una soluzione madre di 7,34 mM KH2PO4. Effettuare le diluizioni standard, utilizzando acqua distillata, in provette da microcentrifuga come da Tabella 1. Agitare leggermente le provette e trasferire le diluizioni standard in provette di vetro prive di fosfati.
  2. Preparare una serie separata di provette di vetro contenenti i campioni lipidici. Ottimizzare il volume dei campioni lipidici in modo tale che l'assorbanza a 630 nm (dopo il completamento di questo protocollo) rientri nell'intervallo dello standard KH2PO4 (che è compreso tra 0 e 20x).
  3. Riscaldare i tubi di vetro contenenti diluizioni standard a 120 °C fino a completa essiccazione. Riscaldare le provette di vetro contenenti i campioni lipidici (prelevare 1/8 del volume totale del campione necessario per avere un'assorbanza nell'intervallo dello standard KH2PO4) a 90 °C per completare l'essiccazione.
  4. Aggiungere 50 μl di acido perclorico al 70% a tutte le provette e riscaldare a 180 °C per 30 minuti. Raffreddare i tubi a temperatura ambiente. Aggiungere 250 μl di acqua, 50 μl di molibdato di ammonio al 2,5% e 50 μl di acido ascorbico al 10% in ciascuna provetta.
    NOTA: Il 2,5% di molibdato di ammonio e il 10% di acido ascorbico sono concentrazioni peso/volume. Devono essere fatti al momento e possono essere conservati a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
  5. Conservare le provette in un'incubatrice agitata a 37 °C per 1 ora. Aliquotare 130 μL di campione in una piastra a 96 pozzetti e misurare l'assorbanza a 630 nm utilizzando uno spettrofotometro.

5. Derivatizzazione

ATTENZIONE: Si dice che il trimetilsilildiazometano (TMSD) abbia molti effetti tossicologici nell'uomo. Il TMSD in soluzione colpisce i reni, il fegato, il tratto gastrointestinale, i muscoli scheletrici, il sistema nervoso centrale e i sistemi respiratorio e riproduttivo. È necessario prendere le dovute precauzioni durante la manipolazione di questa sostanza chimica. L'intero processo deve essere eseguito in una cappa chimica ben ventilata.

  1. Alla fase organica inferiore dei campioni ottenuti dalla fine del passaggio 3.2.3., aggiungere 50 μl di TMSD 2 M. Lasciare procedere la reazione a temperatura ambiente per 10 minuti agitando costantemente a 250 giri/min. Dopo 10 minuti, aggiungere 10 μL di acido acetico glaciale per estinguere la reazione, indicata dalla scomparsa del colore giallo nella soluzione.
  2. Picchiettare i tubi e aprirli con cautela per rimuovere l'N2 formatosi nella reazione di tempra. Dopo che il gas N2 è fuoriuscito, chiudere i tubi e farli girare verso il basso. Quindi, aggiungere 600 μL di soluzione di lavaggio post-derivatizzazione e agitare per 2 minuti in un miscelatore a 250 giri/min.
  3. Scartare ~400 μL dalla fase superiore che si formerà. Ripetere il passaggio 5.2. Scartare l'intera fase superiore e aggiungere 50 μl di metanolo al 90% alla fase inferiore e mescolare.
  4. Essiccare i campioni per 2 ore in un concentratore centrifugo a 800 x g funzionante sotto vuoto. Dopo l'essiccazione, le provette devono contenere ~20 μl del campione rimanente. Aggiungere 180 μl di metanolo al 100%, mescolare bene e conservare a 4 °C per un massimo di 2-3 giorni prima della LC-MS/MS.

6. Acquisizione e analisi dei dati

  1. Acquisizione dati in infusione diretta MS (DIMS)
    NOTA: La MS può essere eseguita mediante infusione diretta o cromatografia liquida MS (LC-MS). In questa sezione, descriviamo la SM basata sull'infusione diretta.
    1. Prima di iniziare l'esperimento, calibrare lo spettrometro di massa secondo le istruzioni del produttore.
    2. Generare una curva di risposta lineare per la serie di diluizioni di standard sintetici e, in base alla risposta lineare dello strumento, diluire il campione in modo che l'intensità dell'analita lipidico rientri nella linearità dello strumento. Diluire gli estratti lipidici totali o gli standard lipidici con una miscela di metanolo:cloroformio 2:1 (vol/vol). Selezionare la diluizione degli estratti lipidici totali e gli standard sintetici individualmente per ogni esperimento.
    3. Trasferire gli estratti e gli standard in fiale individuali. Evitare la formazione di bolle d'aria durante il trasferimento dei campioni nelle fiale di MS. Le bolle d'aria creano un'alta pressione nella colonna e ostacolano l'analisi dei lipidi.
    4. Prima dell'analisi, centrifugare i campioni per 9 minuti a 6.440 x g e caricarli in una piastra a 96 pozzetti e sigillare con un foglio di alluminio.
    5. Esecuzione di analisi MS su uno spettrometro di massa ad alta risoluzione utilizzando il metodo dell'infusione diretta. Ottenete una ionizzazione stabile dei glicerofosfolipidi basata su ESI utilizzando una sorgente ionica robotica a nanoflusso utilizzando chip con ugelli spruzzatori di diametro 4,1 μm.
    6. Controllare la sorgente di ioni utilizzando un software di spettrometro di massa personalizzato e impostare le tensioni di ionizzazione a +1,2 kV e -1 kV rispettivamente in modalità positiva e negativa; contropressione a 1 psi in entrambe le modalità; e temperatura del capillare di trasferimento ionico a 180 °C. Eseguire l'acquisizione a risoluzione di massa, Rm/z400 = 100.000. Vedere la Figura 2A per l'interfaccia software per impostare i parametri dello spettrometro di massa.
    7. Risciogliere gli estratti lipidici totali essiccati in 400 μl di cloroformio:metanolo (1:2). Per l'analisi, caricare 60 μL di campioni su una sorgente ionica a 96 pozzetti e sigillare con un foglio di alluminio. Analizza ogni campione per 20 minuti in modalità ioni positivi per rilevare PC, fosfatidilserina (PS), fosfatidiletanolammina (PE), PE-O (fosfatidiletanolammina legata all'etere), ceramide (Cer) e ceramide fosfato (Cer-P).
    8. Eseguire un'acquisizione indipendente in modalità ioni negativi per 20 minuti in cui sono stati rilevati PA e PI. Vedere la Figura 2B per dettagli specifici sulla configurazione dello strumento per l'acquisizione dei dati per la MS ad alta risoluzione e un elenco mirato di specie PA che è stato incluso nella configurazione dell'acquisizione dipendente dai dati (DDA).
      NOTA: L'interfaccia software per l'impostazione del metodo DDA è mostrata nella Figura 2C. L'elenco delle molecole PA bersaglio di questo approccio è riportato nella Tabella 2. Uno screenshot del risultato sperimentale nell'approccio DDA è mostrato nella Figura 2D.
  2. Analisi dei dati in MS per infusione diretta (DIMS)
    NOTA: L'analisi dei dati di massa generati da tutti i tipi di spettrometri di massa richiede una piattaforma automatizzata di analisi dei lipidi. LipidXplorer36 è un software non commerciale che supporta tutti i tipi di esperimenti sui lipidi DIMS. Questo software può essere trovato qui: https://www.mpi-cbg.de/research-groups/current-groups/andrej-shevchenko/projects/lipidxplorer/
    1. Una volta acquisiti i dati utilizzando i metodi descritti nel passaggio 6.1, identificare le specie lipidiche utilizzando una piattaforma di analisi lipidica confrontando m/z dei loro picchi monoisotopici con i corrispondenti vincoli di composizione elementare. L'esempio di importazione dei dati è illustrato nella Figura 3A. Impostare la tolleranza di massa a 10 ppm e la soglia di intensità in base al livello di rumore riportato dal software dello spettrometro di massa.
    2. Dopo l'importazione, compilare query MFQL (Molecular Fragmentation Query Language) per PA in base alla struttura chimica di PA, illustrata nella Figura 3B. Vedere la Figura 3C per la configurazione MFQL nella piattaforma di analisi dei lipidi.
    3. Utilizzando un approccio simile, compilare MFQL per altri glicerofosfolipidi nel software della piattaforma di analisi dei lipidi. Ogni query è destinata a una classe lipidica ed è possibile utilizzare molte query in una singola esecuzione.
    4. Esegui tutti gli MFQL facendo clic sul pulsante Esegui . Tutte le specie lipidiche identificate sono riportate in un unico file di risultati in formato file .csv con le abbondanze dei corrispondenti ioni precursori e/o frammenti per la successiva quantificazione dei lipidi. Un esempio dell'output è riportato nella Tabella 3.

7. Cromatografia liquida e MS tandem di campioni derivatizzati

  1. Separare i campioni ottenuti dalla fase 5.4 mediante cromatografia liquida utilizzando un sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni. Nella scelta di questo sistema, assicurarsi che il suo software possa integrarsi con quello dello spettrometro di massa utilizzato per l'analisi.
  2. Collegare il sistema a uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo. Scegliere una colonna di separazione. Per la separazione di lipidi diversi da PI4P e PI(4,5)P2 scegliere una colonna C18 (1,0 mm x 100 mm x 1,7 mm). Per PI4P e PI(4,5)P2, scegliere una colonna C4 di dimensioni 300 Å (1,0 mm x 100 mm x 1,7 μm).
  3. Preparare la fase mobile che contiene formiato di ammonio sciogliendo prima il formiato di ammonio in acqua di spettrometria di massa e poi in solventi organici. Sonicare tutti i solventi utilizzati nella spettrometria di massa per 20 minuti per rimuovere le bolle d'aria.
  4. Equilibrare la colonna infondendo la soluzione A contenente acqua + 0,1% di acido formico e la soluzione B contenente acetonitrile + 0,1% di acido formico.
  5. Iniettare l'eluato dal sistema di cromatografia liquida (volume di iniezione nell'intervallo 1-20 μL) nello spettrometro di massa per l'analisi. Impostare la portata a 0,1 mL/min e la temperatura della colonna a temperatura ambiente. Iniettare l'intero volume di eluizione che esce dalla colonna nello spettrometro di massa.
  6. Nella sequenza di iniezione del campione, iniziare sempre con un'iniezione di solvente in bianco (metanolo) e mantenere i campioni standard puliti in modo intermittente tra i campioni biologici per eseguire controlli di qualità con spettrometria di massa (ogni sei cicli).
  7. Per la configurazione sperimentale dello spettrometro di massa ibrido a triplo quadrupolo iono-trappola, prima di iniziare l'esperimento, calibrare lo spettrometro di massa secondo le istruzioni del produttore. Per PA, PC e PI, utilizzare la ionizzazione elettrospray (ESI) per generare gli ioni e operare in modalità positiva per rilevare le specie lipidiche caricate positivamente. Acquisisci i dati e analizzali utilizzando il software di analisi dei dati installato con il sistema.
  8. Ottimizza i parametri per l'analisi in base allo standard interno corrispondente utilizzato. I parametri dello spettrometro di massa sono i seguenti: tempo di permanenza = 30 ms; CAD (dissociazione attivata da collisione) = 3 psi; GS1 (gas sorgente 1) = 24 psi e GS2 (gas sorgente 2) = 21 psi; CUR (gas per tende) = 30 psi; IS (tensione ESI) = 4,5 kV; e TEM (temperatura della sorgente) = 450 °C.
  9. Per PI4P e PI(4,5)P2, utilizzare lo spettrometro di massa in modalità positiva. I parametri dello spettrometro di massa sono i seguenti: tempo di permanenza = 65 ms; CAD (dissociazione attivata da collisione) = 2 psi; GS1 (gas sorgente 1) e GS2 (gas sorgente 2) =20 psi; CUR (gas a tendina) = 37 psi; IS (tensione ESI) = 5,2 kV; e TEM (temperatura della sorgente) = 350 °C.

8. Cromatografia liquida in fase normale - monitoraggio di reazioni multiple - scansione ionica del prodotto potenziata MS (NPLC-MRM-EPI MS)

  1. Condizioni cromatografiche
    1. Utilizzare un metodo LC in fase normale utilizzando una colonna di silice, che è in grado di separare PA da altri fosfolipidi. Utilizzare esano:alcol isopropilico:100 mM acquoso NH4COOH nel rapporto 68:30:2 come fase mobile A e alcol isopropilico:esano:100 mM acquoso NH4COOH in un rapporto 70:20:10 come fase mobile B.
      NOTA: Questa combinazione ha fornito la migliore separazione e selettività di picco di diverse specie molecolari di PA.
    2. Utilizzare il comportamento cromatografico dei composti di riferimento (standard interni), in termini di risoluzione e forma del picco, per scegliere le condizioni ottimali.
    3. Eseguire la separazione cromatografica su una colonna di silice in fase normale (1 mm x 150 mm x 3 μm) a temperatura ambiente su una colonna per cromatografia liquida ad alte prestazioni. Impostare il volume di iniezione dell'autocampionatore su 6 μl e la velocità di flusso dell'eluente su 210 μl/min.
    4. Dopo 5 minuti di equilibrio con il 100% della fase mobile A, aumentare linearmente la fase mobile B al 30% in 5 minuti, ulteriormente all'80% in 5 minuti, quindi al 100% in 5 minuti e mantenerla costante al 100% per 5 minuti. Infine, riequilibrare la colonna per 9 min.
  2. Spettrometria
    1. Utilizza uno spettrometro di massa ibrido a triplo quadrupolo con trappola ionica che opera in modalità ESI negativa. Controllare il funzionamento del sistema e l'acquisizione dei dati utilizzando il software di analisi in dotazione. Prima di iniziare l'esperimento, calibrare lo spettrometro di massa secondo le istruzioni del produttore.
    2. Ottimizza i parametri della sorgente utilizzando l'analisi dell'iniezione di flusso della miscela standard interna. Di conseguenza, impostare la tensione di spruzzatura ionica = -4,5 kV, la temperatura della sorgente (TEM) = 450 °C, il gas di dissociazione attivato dalla collisione (CAD) = 3 psi. Utilizzare il gas azoto come gas di collisione e impostare il gas del nebulizzatore (GS1) = 24 psi, il gas ausiliario (GS2) = 21 psi e il gas a cortina (CUR) = 30 psi.
    3. Impostare i parametri del percorso ionico dipendenti dal composto come potenziale di declustering (DP) = -42 V, potenziale di ingresso (EP) = -6 V e potenziale di uscita della cella di collisione (CXP) = -12 V, ottimizzati utilizzando l'infusione continua di una soluzione di miscela standard interna. Registra gli spettri completi del prodotto insieme alle transizioni da precursore a MRM del prodotto con energia di collisione variabile (CE) a partire da 12 eV a 40 eV per l'analisi della frammentazione utilizzando la funzione di scansione EPI disponibile nello spettrometro di massa.
      NOTA: L'EPI basato su IDA attivato da MRM registra simultaneamente il prodotto ionico precursore, la scansione ionica e l'acquisizione MS/MS al volo. L'MRM ha ristretto l'intervallo di scansione ionica nel quadrupolo 1 (Q1) e la trappola ionica ha migliorato i frammenti ionici che passano attraverso Q2, migliorando così notevolmente la capacità qualitativa del quadrupolo MS/MS, in particolare per la cattura di tutti i frammenti derivanti dallo ione precursore. In modalità EPI, più ioni frammento derivanti dagli ioni precursori vengono rilevati in Q3 con un migliore rapporto segnale/rumore.
    4. Eseguire esperimenti MRM con CE di 39 eV per ottenere un'elevata sensibilità. Limitare il numero massimo di MRM a 75 e il tempo di permanenza a 30 ms per rilevare e registrare l'MRM di qualsiasi molecola specifica che eluisce dalla colonna cromatografica in qualsiasi momento durante la seduta. Ciò aumenta il ciclo di lavoro della macchina.
    5. Eseguire la sintonizzazione sperimentale per decidere i migliori parametri di ionizzazione per PA, come descritto sopra. Per questo esperimento, impostare la tensione di spruzzo ionico = -4,5 kV, la temperatura della sorgente (TEM) = 450 °C, il gas di dissociazione attivato dalla collisione (CAD) = 3 psi. Utilizzare l'azoto gassoso come gas di collisione. Impostare il gas del nebulizzatore (GS1) = 24 psi, il gas ausiliario (GS2) = 21 psi e il gas della cortina (CUR) = 30 psi.
    6. Esamina manualmente tutti i dati di sintonizzazione per garantire la corretta selezione dei parametri di ionizzazione e degli ioni del prodotto. Prendere in considerazione la riduzione al minimo della potenziale interferenza tra i canali MRM quando si seleziona lo ione del prodotto. I parametri sperimentali utilizzati per l'analisi di tutte le specie molecolari di PA sono riportati nella Tabella 4.
      NOTA: Lo spettrometro di massa ibrido a trappola ionica lineare a triplo quadrupolo ci consente di combinare la modalità di scansione MRM con la funzione di scansione a trappola ionica, consentendo così una scansione rapida e alta utilizzando metodi come la scansione EPI per registrare utili spettri di massa tandem di ciascun precursore rilevato. In questo studio, per identificare specie molecolari distinte di PA, abbiamo sfruttato questo approccio MS/MS basato su MRM-EPI basato sul percorso ionico convenzionale a triplo quadrupolo con la proprietà di scansione EPI della trappola ionica, controllata dal software di analisi.

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Risultati

Determinazione della linearità di misura in MS. La linearità è la capacità del metodo MS di fornire risultati direttamente proporzionali alla concentrazione dell'analita lipidico. La linearità dipende da (a) l'efficienza di ionizzazione dell'analita lipidico e (b) il comportamento di ionizzazione dell'analita lipidico a diverse concentrazioni dipende dalla sorgente ionica utilizzata. Nella ionizzazione elettrospray (ESI) utilizzata in questo studio, la linearità si mantiene a concentrazioni più basse a s...

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Discussione

Un certo numero di linee di evidenza convergono su molteplici ruoli dei lipidi di segnalazione nella regolazione dell'organizzazione e della funzione dei fotorecettori di Drosophila. Oltre al ruolo ben studiato dei lipidi nella regolazione della fototrasduzione3, i lipidi di segnalazione sono stati anche implicati nel traffico proteico e nell'organizzazione subcellulare 23,30,39,40,41.<...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Il lavoro descritto in questo manoscritto è stato sostenuto dal Dipartimento dell'Energia Atomica, Governo dell'India (Progetto di identificazione n. RTI 4006), il Dipartimento di Biotecnologia, Governo dell'India (BT/PR4833/MED/30/744/2012) e una borsa di studio senior dell'India Alliance (IA/S/14/2/501540) a PR. Ringraziamo la NCBS Mass Spectrometry Facility, in particolare il Dr. Dhananjay Shinde e i membri del laboratorio di pubbliche relazioni per il loro contributo allo sviluppo di questi metodi.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,1 N metanolico HCLPer l'isolamento totale dei lipidi
0,88% KClSigma AldrichP9541Per l'isolamento totale dei lipidi
1,5 ml / 2 ml di provette LoBind EppendorfEppendorf, Eppendorf,022431081/022431102Per l'isolamento totale dei lipidi
2,3.18 16:0/18:1 Diether PEAvanti lipidi polari999974Lipid Internal Standard
37% HCl puroSigma Aldrich320331 Per l'isolamentototale dei lipidi Piastra
a 96 pozzettiSaggio del fosfato organico totale
AcetoneFisher Scientific32005Per le dissezioni
MolibdatoSaggio del fosfato organico totale
AcidoSaggio del fosfato organico totale
Sonicatorea bagno
Colonna BEH300 C18 [1,0 mm x 100 mm x 1,7 mm]Waters India Pvt. Ltd.186002352LC
PortalamaFine Scientific Tools10052-11Per dissezioni
IncubatoreSaggio del fosfato organico totale
Lame frangibiliFine Scientific tools10050-00Per dissezioni
Carta burrosaGEhealthcare 10347671Per dissezioni
C4, 300 A0, [1.7 μ m x1 mm x 100 mm] colonnaWaters India Pvt. Ltd.Cromatografia LC 186004623
flaconi in vetro color ambra con insertiMerck27083-U
d18:1/17:0)Avanti lipidi polari860517Lipid Internal Standard
d5-Fosfatidilinositolo 3,5-bisfosfato [PI(3,5)P2]-16:0/16:0Lipidi polari Avanti850172Microscopi
da dissezione standard interni ai lipidiOlympusSZ51Per dissezioni
Bagno di calore secco.
Eluente AEsano:Alcool isopropilico:100 mM Acetato acquoso di ammonio (68:30:2) , per LC
Eluente BEsano:Alcool isopropilico:100 mM Acetato acquoso di ammonio (70:20:10), per LC
Carta da filtroIndica-HM274039Per dissezioni
PalloniBorosilPer dissezioni
MoscheNANARaghu Padinjat lab
Cibo per moscheNANANCBS lab kitchen, composizione: farina di mais 80 g/L, D-glucosio 20 g/L, saccarosio 40 g/L, agar 8 g/L, estratto di lievito 15 g/L, acido propionico 4 mL, TEGO (metil para idrossibenzoato) 0,7 g/L, acido ortofosforico 0,6 mL)
ForcepsFine Scientific Tools11254-20Per dissezioni
Cappa
aspiranteBorosilPer le dissezioni
Acido acetico glacialeFisher ScientificA35-500Per la derivatizzazione
Flaconi di vetro: colore trasparente e ambratoPer l'isolamento totale dei lipidi Provette
di vetro prive di fosfati resistenti alle alte temperature.Saggio del fosfato organico totale
Provette per omogeneizzazione con perle di ossido diPer l'isolamento totale dei lipidi
Strumento omogeneizzatorePrecellys
CO2sub umidificato collegato a fly padPer spingere le mosche
Incubatrici a illuminazione controllataPanasonic SanyoMIR-553Per le mosche Miscela
organica inizialemetanolo: cloroformio (2:1), Per l'isolamento lipidico totale
Cloroformio di grado LC-MSSigma Aldrich650498Per l'isolamento lipidico totale
Grado LC-MS MetanoloSigma Aldrich34860Per l'isolamento lipidico totale
Acqua di grado LC-MSSigma Aldrich34877Per l'isolamento lipidico totale
Light misuratoreHTC instrumentsLX-103
Punte a bassa ritenzioneEppendorf0030072006/72014/72022/72030Per l'isolamento totale dei lipidi
Strumento LTQ Orbitrap XLThermo Fisher Scientific, Brema, Germania
Acido lisofosfatidico (LPA) - 13:0Avanti lipidi polariLM-1700Lipidi standard interni
Acido lisofosfatidico (LPA) - 17:1Lipidi polari AvantiLM 1701Standard
Lisofosfatidilcolina (LPC) -13:0Lipidi polari AvantiLM-1600Standard interno lipidico
Lisofosfatidilcolina (LPC) -17:1Lipidi polari Avanti855677Standard
Lisofosfatidilcolina (LPC)- 19:0Lipidi polari Avanti855776Standard
Acido perclorico.Saggio del fosfato organico totale
Fosfato standard di potassio diidrogeno fosfatoSaggio del fosfato organico totale
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)NANAComposizione: 137mMNaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 e 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4
Acido fosfatidico (PA)- 12:0/13:0Lipidi polari avanti, LM-1400  Lipidi interni standard
Acido fosfatidico (PA) - 17:0/14:1Avanti lipidi polariLM-1404Lipidi interni standard Acido
fosfatidico (PA)-(17:0/17:0)Avanti lipidi polari830856Lipidi interni standard
Acido fosfatidico (PA)-16:0-D31/18:1Avanti lipidi polari860453Lipidi interni standard
Fosfatidilcolina (PC) -12:0/13:0Lipidi polari AvantiLM-1000Lipidi standard interni
Fosfatidilcolina (PC) - 17:0/14:1Lipidi polari AvantiLM-1004Lipidi interni standard
Fosfatidiletanolammina (PE) - 17:0/14:1Lipidi polari AvantiLM-110Lipidi standard interni
Fosfatidilinositolo (PI) - 17:0/14:1Lipidi polari AvantiLM-1504Standard interno lipidico
Fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato [PI(4,5)P2)]-17:0/20:4Lipidi polariAvanti LM-1904Lipid Internal
Standard Fosfatidilinositolo 4-fosfato (PI4P) - 17:0/20:4Lipidi polariAvanti ML-1901Lipid Internal Standard
Sorgente ionica robotica a nanoflussoTriVersa NanoMate (Advion BioSciences, Ithaca, NY, USA)
Rotospin strumentoTarsons3090X
CuscinettiPer dissezioni
solvente A0,1% acido formico in acqua, per solvente LC
B0,1% acido formico in acetonitrile, per LC
Centrifuga
Termomiscelatore
TMS-diazometanoAcrosAC385330050Per la derivatizzazione
Spettrometro di massa a triplo quadrupoloAB SciexQTRAP 6500
Sistema UPLCWaters Acquity
Concentratore centrifugo sottovuotoScanvac , Labogene
Vortex machine
di ammonio ascorbico BOD : zirconio interno lipidico lipidico interno interno lipidico in silicone da tavolo

Riferimenti

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