Articolo metodologico
* These authors contributed equally
Il protocollo di indentazione della microscopia a forza atomica offre la possibilità di sezionare il ruolo delle proprietà fisiche della parete cellulare di una particolare cellula di un tessuto o organo durante la crescita normale o limitata (cioè in deficit idrico).
Un metodo è descritto qui per caratterizzare le proprietà fisiche della parete cellulare delle cellule epidermiche delle radici viventi di Arabidopsis attraverso nanoindentazioni con un microscopio a forza atomica (AFM) accoppiato con un microscopio ottico a fluorescenza invertita. Il metodo consiste nell'applicare forze controllate al campione misurandone la deformazione, consentendo di quantificare parametri come l'apparente modulo di Young delle pareti cellulari a risoluzioni subcellulari. Richiede un'attenta immobilizzazione meccanica del campione e una corretta selezione dei penetratori e delle profondità di indentazione. Sebbene possa essere utilizzato solo nei tessuti esterni, questo metodo consente di caratterizzare i cambiamenti meccanici nelle pareti cellulari delle piante durante lo sviluppo e consente la correlazione di questi cambiamenti microscopici con la crescita di un intero organo.
Le cellule vegetali sono circondate da una parete cellulare che è una struttura complessa composta da reti interagenti di polisaccaridi, proteine, metaboliti e acqua che varia in spessore da 0,1 a diversi μm a seconda del tipo di cellula e della fase di crescita 1,2. Le proprietà meccaniche della parete cellulare svolgono un ruolo essenziale nella crescita delle piante. Bassi valori di rigidità della parete cellulare sono stati proposti come precondizione per la crescita cellulare e l'espansione della parete cellulare, e vi è una crescente evidenza che tutte le cellule percepiscono le forze meccaniche per svol....
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1. Preparazione del materiale vegetale e condizioni di crescita
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Esperimenti di forza-indentazione
Il testo seguente presenta alcuni risultati attesi quando viene condotto un esperimento di indentazione forzata per mostrare l'output tipico da aspettarsi quando il protocollo è ben eseguito.
Curve forza-spostamento
I grafici di indentazione della forza rappresentativa ottenuti indentando campioni vivi in una posizione posta al centro della cella della zona di allungamento della radice sono presentati nella
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La meccanica delle cellule e della parete cellulare sta diventando sempre più rilevante per ottenere informazioni su come la meccanica influisce sui processi di crescita. Poiché le forze fisiche si propagano su distanze considerevoli nei tessuti solidi, lo studio dei cambiamenti nelle proprietà fisiche della parete cellulare e di come vengono rilevati, controllati, sintonizzati e influenzano la crescita della pianta stanno diventando un importante campo di studio 2,3,8.......
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Gli autori non hanno conflitti di interesse. Lo script MATLAB utilizzato per l'adattamento dei dati è disponibile su richiesta personale scrivendo a J. C. B.
Questa ricerca è stata finanziata da CSIC I + D 2018, sovvenzione n. 95 (Mariana Sotelo Silveira). CSIC Grupos (Omar Borsani) e PEDECIBA.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1 x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Include cloruro di sodio e tampone fosfato ed è formulato per prevenire lo shock osmotico e mantenere l'equilibrio idrico nelle cellule viventi. | ||
| Software AFM | Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Microscopia a forza atomica (AFM) | BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Catalizzatore Supporto della sonda-fluido | Bruker, Billerica, MA, USA | CAT-FCH | Un supporto per sonda per il catalizzatore Bioscope, progettato per il funzionamento del fluido in contatto o in modalità di maschiatura. Compatibile anche con il funzionamento ad aria. |
| Osmometro crioscopico; modello OSMOMAT 030 | Gonotech, Berlino, Germania | ||
| Murashige & Skoog Medium | Duchess Biochemie | M0221 | Concentrazione originale, (1962) |
| Microscopio ottico invertito accoppiato all'AFM | Olympus IX81, Miami, FL, USA | ||
| PEGAMIL | ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina | 100429 | Colla siliconica neutra non acida |
| Piastre di Petri | Deltalab | 200201.B | Polistirene, 55 x 14 mm, radiazioni sterili. |
| Ioduro di propidio | Sigma | P4170 | Per test di vitalità radicolare. |
| Sonda in nitruro di silicio, DNP-10, cantilever A | Bruker, Billerica, MA, USA | DNP-10/A | Per microscopia a modulazione di forza in funzionamento liquido. Raggio della punta della sonda di 20-60 nm. 175-μ m-lungo cantilever triangolare, con una costante elastica di 0,35 N/m. |
| Pinzetta | Sigma | T4537 |
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