Microscopia a forza atomica per studiare le proprietà fisiche delle cellule epidermiche delle radici vive di Arabidopsis

Summary

Il protocollo di indentazione della microscopia a forza atomica offre la possibilità di sezionare il ruolo delle proprietà fisiche della parete cellulare di una particolare cellula di un tessuto o organo durante la crescita normale o limitata (cioè in deficit idrico).

Abstract

Un metodo è descritto qui per caratterizzare le proprietà fisiche della parete cellulare delle cellule epidermiche delle radici viventi di Arabidopsis attraverso nanoindentazioni con un microscopio a forza atomica (AFM) accoppiato con un microscopio ottico a fluorescenza invertita. Il metodo consiste nell'applicare forze controllate al campione misurandone la deformazione, consentendo di quantificare parametri come l'apparente modulo di Young delle pareti cellulari a risoluzioni subcellulari. Richiede un'attenta immobilizzazione meccanica del campione e una corretta selezione dei penetratori e delle profondità di indentazione. Sebbene possa essere utilizzato solo nei tessuti esterni, questo metodo consente di caratterizzare i cambiamenti meccanici nelle pareti cellulari delle piante durante lo sviluppo e consente la correlazione di questi cambiamenti microscopici con la crescita di un intero organo.

Introduction

Le cellule vegetali sono circondate da una parete cellulare che è una struttura complessa composta da reti interagenti di polisaccaridi, proteine, metaboliti e acqua che varia in spessore da 0,1 a diversi μm a seconda del tipo di cellula e della fase di crescita ^1,2. Le proprietà meccaniche della parete cellulare svolgono un ruolo essenziale nella crescita delle piante. Bassi valori di rigidità della parete cellulare sono stati proposti come precondizione per la crescita cellulare e l'espansione della parete cellulare, e vi è una crescente evidenza che tutte le cellule percepiscono le forze meccaniche per svolgere le loro funzioni. Tuttavia, è ancora dibattuto se i cambiamenti nelle proprietà fisiche della parete cellulare determinino il destino cellulare ^2,3,4. Poiché le cellule vegetali non si muovono durante lo sviluppo, la forma finale di un organo dipende da quanto lontano e in quale direzione una cellula si espande. Pertanto, la radice di Arabidopsis è un buon modello per studiare l'impatto delle proprietà fisiche della parete cellulare nell'espansione cellulare perché diversi tipi di espansione si verificano in diverse regioni della radice. Ad esempio, l'espansione anisotropa è evidente nella zona di allungamento e in particolare nelle cellule epidermiche⁵.

Il metodo qui descritto è stato utilizzato per caratterizzare le proprietà fisiche della parete cellulare delle cellule epidermiche su scala nanometrica delle radici viventi di Arabidopsis utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM) accoppiato con un microscopio a fase di fluorescenza invertita⁶. Per una revisione approfondita della tecnica AFM, leggere ^7,8,9.

Questo protocollo delinea un metodo di preparazione del campione di base e un metodo generale per le misurazioni dell'elasticità basate su AFM delle pareti cellulari delle piante.

Figura 1: Panoramica schematica dell'esperimento di indentazione della forza nelle radici di Arabidopsis utilizzando la microscopia a forza atomica (AFM). Lo schema fornisce una panoramica delle fasi di un esperimento di forza-indentazione dalla preparazione del substrato per immobilizzare saldamente il campione radicale (1-2), conferma della vitalità della radice attraverso colorazione con ioduro di propidio (3), posizionamento a sbalzo sulla superficie di una cellula epidermica allungata della radice primaria (4-5), misurazione delle curve di forza (6) e elaborazione della curva di forza per calcolare il modulo di Young apparente (7-8). EZ: zona di allungamento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Protocol

1. Preparazione del materiale vegetale e condizioni di crescita

1. Per generare il materiale vegetale necessario, sterilizzare i semi di Arabidopsis wild type e le linee mutanti di interesse.
   NOTA: In questo protocollo, abbiamo usato quanto segue: ttl1: linee di inserzione del T-DNA Salk_063943 (per TTL1; AT1G53300) - Columbia-0 (Col-0) wild-type; il mutante Procuste1 (prc1-1), che consiste in una mutazione knock-out (Q720stop) nel gene CESA6 (AT5G64740), come precedentemente descritto in^10,11; e TTL1 x PRC1-1 doppio mutante.
   1. Metti un volume approssimativo di 50 μL di semi in un microtubo. Aggiungere 500 μL di etanolo al 70% + soluzione Tween allo 0,01% a temperatura ambiente. Mescolare e incubare per 7 min.
   2. Versare la soluzione di etanolo e aggiungere 500 μL di ipoclorito di sodio al 20%. Mescolare e incubare per 7 min.
   3. Versare la soluzione di ipoclorito di sodio e lavare i semi tre o quattro volte con acqua sterile.
2. Placcatura
   1. Preparare in anticipo Murashige basale e Skoog (MS) terreno¹² + 1,5% saccarosio + 1% agar (pH 5,7) (vedi tabella dei materiali). Autoclave il mezzo. Preparare una cappa a flusso laminare per lavorare in un ambiente sterile ed etichettare le piastre di Petri quadrate necessarie per l'esperimento. Versare il mezzo nelle piastre di Petri e lasciare che il mezzo si solidifichi.
   2. Placcare i semi sterilizzati utilizzando punte sterili per pipette su piastre di Petri quadrate contenenti il mezzo. Distribuire uniformemente i semi su due file. Quando i semi sono asciutti, chiudere i coperchi e sigillare i piatti. Stratificare i semi a 4 °C al buio per 4 giorni.
      NOTA: La stratificazione è necessaria per sincronizzare la germinazione.
   3. Posizionare le piastre verticalmente nella camera di crescita in un regime di lunga giornata (16 ore di luce/8 ore di buio) con 25 μmol m² s⁻¹ di intensità luminosa e 23 °C (giorno/notte). Coltiva le piantine per 7 giorni.

2. Trattamento dello stress osmotico (opzionale)

NOTA: Questa sezione fornisce dettagli sulla crescita delle radici di Arabidopsis in potenziale osmotico di -1,2 MPa come stimato dall'osmometro crioscopico (Tabella dei materiali). Questa parte può essere omessa o modificata a seconda della domanda sperimentale in questione.

1. Preparare il terreno di SM basale + 1,5% di saccarosio + 400 mM di mannitolo + 1% di agar (pH 5,7). Autoclave il mezzo. Versare il mezzo in piastre di Petri quadrate nella cappa a flusso laminare e lasciare che il mezzo si solidifichi.
2. Con una pinzetta (Table of Materials), posizionare piantine di 5 giorni pre-coltivate in MS basale + 1,5% di saccarosio in piastre di Petri quadrate contenenti il mezzo integrato con 400 mM di mannitolo. Collocare verticalmente le piastre nella camera di crescita nelle stesse condizioni del punto 1.2.3. Coltiva le piantine in questa condizione di stress osmotico per 7 giorni.
   NOTA: Per valutare l'adattamento alla crescita radicale della radice primaria durante un grave stress osmotico, si consiglia di utilizzare piantine 5 giorni dopo la germinazione cresciute in condizioni controllate per garantire che la dimensione del meristema della radice sia già stabilita¹³. In alternativa, l'analisi può essere eseguita in ogni fase dello sviluppo per determinare l'effetto sullo sviluppo dell'azione dello stress osmotico.

3. Esperimenti di nanoindentazione di microscopia a forza atomica (AFM)

1. Preparazione del campione per esperimenti di nanoindentazione
   NOTA: Questo è un passo cruciale per applicare l'AFM allo studio di campioni biologici vivi. Il campione deve essere saldamente fissato al substrato per essere meccanicamente stabile durante le misurazioni di indentazione. Allo stesso tempo, le qualità strutturali del campione dovrebbero essere preservate. Una strategia efficace per stabilizzare un grande campione per AFM è quella di utilizzare adesivi. L'adesivo deve asciugarsi rapidamente e non deve essere tossico o reattivo con il mezzo circostante. In questo protocollo, le piastre di Petri in polistirene sono state utilizzate come substrato e la colla siliconica non acida (Table of Materials) è stata utilizzata per legare le piantine di Arabidopsis.
   1. Stendere un sottile strato di colla siliconica nella capsula di Petri con un coprivetrino. Lasciare la colla in aria per 45 s.
   2. Con una pinzetta, posizionare la piantina sulla colla, orientandola in una direzione che eviti il contatto tra le parti sporgenti della piantina e il cantilever. Quindi, premere delicatamente la radice sullo strato di colla siliconica per legarlo saldamente. Lasciare la piantina a contatto con la colla per 45 secondi prima di continuare con i passaggi successivi del protocollo.
   3. Incubare le piantine attaccate con 2 μg/ml di ioduro di propidio (PI; Tabella dei materiali) per 5 minuti al buio e lavarli accuratamente tre volte con 1x soluzione salina tamponata fosfaticamente (PBS) (Table of Materials).
   4. Posizionare le piantine incubate da PI in un microscopio a fluorescenza invertita accoppiato con l'AFM. Per osservare la fluorescenza, impostare le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione rispettivamente a 572 nm e 617 nm. L'assenza di fluorescenza all'interno delle cellule epidermiche conferma la vitalità delle radici.
   5. Coprire la piantina con 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS).
2. Protocollo di indentazione
   NOTA: Eseguire tutte le misurazioni AFM entro 1 h dopo l'immobilizzazione del campione sul suo supporto a temperatura ambiente. La stanza in cui si trova l'AFM deve essere mantenuta a 25 °C con un condizionatore d'aria. La soluzione PBS deve essere alla stessa temperatura.
   1. Montare un cantilever standard in nitruro di silicio con una punta piramidale (vedi Tabella dei materiali) nel supporto della sonda AFM per fluido (Tabella dei materiali).
   2. Allineare il laser sul cantilever vicino alla posizione della punta. Quindi, spostare il fotodiodo per posizionare il punto laser al centro del rilevatore.
   3. Per calibrare la sensibilità di deflessione, posizionare una capsula di Petri in polistirene con 1x PBS sotto l'AFM.
      NOTA: questo passaggio è necessario per calcolare il rientro. Quando viene effettuata una misurazione della forza su una superficie dura, non vi è alcuna rientranza nella superficie, quindi qualsiasi modifica nello spostamento dello scanner z corrisponde alla deflessione a sbalzo. Pertanto, è molto importante calibrare la sensibilità alla deflessione su una superficie dura. L'utilizzo di una superficie morbida sovrasvaluterà la sensibilità di deflessione, il che si tradurrà in costanti di molla troppo basse.
   4. Regolare il fotorilevatore in modo che la deflessione senza contatto sia vicina a 0 V. Calibrare la sensibilità di deflessione eseguendo un'indentazione (curva di forza), con una dimensione della rampa di 3 μm, una velocità di indentazione e retrazione di 0,6 μm/s e una soglia di attivazione di 0,5 V.
   5. Per calibrare la costante della molla del cantilever, utilizzare l'utilità Thermal Tune del software AFM (Table of Materials) consigliato per sonde con costanti di molla inferiori a circa 5 N/m o utilizzare il metodo descritto nel riferimento¹⁴. Prima di attivare Thermal Tune nel software, assicurarsi che la sonda non interagisca con il campione.
      1. Immettere la temperatura a sbalzo. Fare clic su Calibra > Thermal Tune o sull'icona Thermal Tune nella barra degli strumenti NanoScope . Selezionare un intervallo di frequenza (1-100 Hz).
      2. Fare clic su Acquisisci dati nel pannello Thermal Tune. Attendere che l'AFM acquisisca i dati, quindi fare clic sul pulsante Simple Harmonic Oscillator (Fluid).
      3. Regolare la larghezza mediana del filtro su 3. Regola la larghezza del contenitore PSD per ridurre il rumore nei dati acquisiti mediante la media. Imposta i limiti di adattamento attorno al primo picco di risonanza.
      4. Fare clic su Calcola costante di primavera k, quindi fare clic su Sì nella finestra pop-up chiedendo se l'utente desidera utilizzare questo valore.
      5. Ripetere i passaggi descritti sopra tre volte e prendere manualmente una media dei valori costanti della molla. Immettete questo valore medio nella casella Costante molla (Spring Constant ) nell'elenco dei parametri Rampa (Ramp parameter) nella vista PicoForce . La calibrazione termina a questo punto.
   6. Utilizzando il microscopio ottico invertito con ingrandimento dell'oculare 10x, 20x e 40x, posizionare la sonda AFM sulla superficie della quarta cellula epidermica allungata della radice primaria, assicurandosi di posizionarla al centro della cellula.
   7. Con il valore calcolato della costante della molla (passo 3.2.5.5), ottenere curve di forza con una dimensione della rampa di 3 μm, una soglia di innesco di 11 nN e una velocità di indentazione e retrazione di 0,6 μm/s in punti selezionati.
      NOTA: Il lavoro precedente^15,16 ha scoperto che la bassa frequenza di indentazione e retrazione aiuta a ridurre al minimo l'isteresi e la forza di trascinamento.
   8. Ottenere curve di forza da tre cellule per radice per ogni trattamento (utilizzare tre repliche biologiche per trattamento). Cattura almeno 150 curve di forza per ogni radice.

4. Misurare il modulo di Young apparente

1. Adattare ogni curva di forza al seguente modello per i penetratori piramidali¹⁷: , dove E è il modulo di Young apparente del campione, è il modulo di Poisson del campione e α è il semiangolo al vertice. Scartare gli attacchi con un coefficiente di correlazione (r²) < 0,99. Si consideri il rapporto di Poisson per materiale totalmente incomprimibile: = 0,5 e la geometria del penetratore data dai produttori.
   NOTA: Utilizzare i primi 100 nm dal punto di contatto della curva di carico affinché il raccordo sia il più sensibile possibile alla meccanica della parete cellulare e per ridurre l'impatto della pressione del turgore sui valori apparenti del modulo di Young⁸. Il fitting è stato realizzato utilizzando un programma MATLAB personalizzato (disponibile su richiesta personale scrivendo a J. C. B) che consente di impostare una profondità di indentazione specifica dal punto di contatto della curva di carico.
2. Creare un istogramma normalizzato con i dati apparenti del modulo di Young e adattarlo a una distribuzione gaussiana. Scartare i punti dati al di fuori dell'intervallo di confidenza del 95% e ricalcolare sia l'istogramma che l'adattamento gaussiano . Calcolare e riportare la media e la deviazione standard del modulo di Young apparente.
3. Determinare il significato dei confronti tra gruppi mediante più test di confronto come ANOVA.

Results

Esperimenti di forza-indentazione
Il testo seguente presenta alcuni risultati attesi quando viene condotto un esperimento di indentazione forzata per mostrare l'output tipico da aspettarsi quando il protocollo è ben eseguito.

Curve forza-spostamento
I grafici di indentazione della forza rappresentativa ottenuti indentando campioni vivi in una posizione posta al centro della cella della zona di allungamento della radice sono presentati nella

Discussion

La meccanica delle cellule e della parete cellulare sta diventando sempre più rilevante per ottenere informazioni su come la meccanica influisce sui processi di crescita. Poiché le forze fisiche si propagano su distanze considerevoli nei tessuti solidi, lo studio dei cambiamenti nelle proprietà fisiche della parete cellulare e di come vengono rilevati, controllati, sintonizzati e influenzano la crescita della pianta stanno diventando un importante campo di studio ^2,3,8...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)			Include cloruro di sodio e tampone fosfato ed è formulato per prevenire lo shock osmotico e mantenere l'equilibrio idrico nelle cellule viventi.
Software AFM	Bruker, Billerica, MA, USA
Microscopia a forza atomica (AFM)	BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA
Catalizzatore Supporto della sonda-fluido	Bruker, Billerica, MA, USA	CAT-FCH	Un supporto per sonda per il catalizzatore Bioscope, progettato per il funzionamento del fluido in contatto o in modalità di maschiatura. Compatibile anche con il funzionamento ad aria.
Osmometro crioscopico; modello OSMOMAT 030	Gonotech, Berlino, Germania
Murashige & Skoog Medium	Duchess Biochemie	M0221	Concentrazione originale, (1962)
Microscopio ottico invertito accoppiato all'AFM	Olympus IX81, Miami, FL, USA
PEGAMIL	ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina	100429	Colla siliconica neutra non acida
Piastre di Petri	Deltalab	200201.B	Polistirene, 55 x 14 mm, radiazioni sterili.
Ioduro di propidio	Sigma	P4170	Per test di vitalità radicolare.
Sonda in nitruro di silicio, DNP-10, cantilever A	Bruker, Billerica, MA, USA	DNP-10/A	Per microscopia a modulazione di forza in funzionamento liquido. Raggio della punta della sonda di 20-60 nm. 175-μ m-lungo cantilever triangolare,  con una costante elastica di 0,35 N/m.
Pinzetta	Sigma	T4537