Ingegneria di agenti antivirali tramite risonanza plasmonica di superficie

L'attività antivirale associata alla terina è indotta dall'interferone-α e comprende legami a base di proteine, che portano alla ritenzione di virioni completamente formati sulle superfici cellulari infette¹. La necessità della glicosilazione della teterina nell'inibizione del rilascio del virus rimane incerta, il che implica l'importanza dei pattern di glicosilazione sui glicani espressi in modo ricombinante per gli studi in vitro ^1,2, che dipende dalla conformazione dell'emoagglutinina ^{HA 3,4} dell'influenza espressa in superficie (nel caso del virus dell'influenza) . È stato notato che la modifica dell'oligosaccaride legato alla glicosilazione legata all'N è sufficiente per la restrizione tetherin-mediata dell'HIV di tipo 1 rilascio², mentre la dimerizzazione svolge un ruolo essenziale nel prevenire il rilascio del virus, coinvolgendo così il dominio transmembrana o l'ancora glicosil-fosfatidil-inositolo (GPI) per legare i virioni in erba⁵ . Sono descritte caratteristiche uniche per il tetherin umano e murino per bloccare più virus, retrovirus e filovirus con involucro. BST-2/tetherin è una proteina antivirale inducibile dall'interferone dell'immunità innata^1,6, che agisce con attività antivirale ad ampio spettro ed è antagonizzata dalle glicoproteine dell'involucro⁵ per traslocare tetherin o interrompere la struttura della tetherin ⁶. Ad esempio, la glicoproteina HA dell'involucro espressa in superficie e la neuraminidasi sul virus dell'influenza A sono ben note per l'antagonismo delle teterine in modo specifico del ceppo 7, facilitando il riconoscimento dei siti di legame^del recettore ospite⁸. Gli anticorpi mirati ai glicani sono studiati nella stechiometria delle loro interazioni con gli scudi glicani in rapida personalizzazione sull'HA, con conseguente affinità di legame con l'influenza A H3N2 e H1N1 sottotipi⁴.

Per chiarire i meccanismi di legame tra agenti antivirali e picchi di involucro virale, cioè ligandi di carboidrati, e metodi immunologici e spettroscopici complementari, vengono sintetizzate chimicamente porzioni mono-, di- e tri-mannosio. I peptidi mannosilati sono creati tramite glicosilazione azidica dei glicosil {beta}-peracetati alla trasformazione 1,2-trans glicosil azide⁹, imitando la N-acetil glucosamina e gli oligosaccaridi ad alto mannosio sulla superficie di virus potenzialmente letali. I bioisosteri triazolici sono utilizzati per imitare i legami che formano il residuo mannosilato del peptide HA¹⁰ e facilitare le interazioni sito-specifiche con i derivati antivirali CV-N attorno al secondo punto di glicosilazione N-linked sul dominio di testa dell'HA (HA top con 4 glicani N-linked N54, N97, N181, N301)^8,11,12 . Le interazioni tra acido glutammico (Glu) e arginina (Arg) e il dipolo dell'elica risultante hanno manifestato una buona stabilità sia dei peptidi modello che delle proteine, ma sono visualizzate utilizzando SPR. Se confrontato con il riconoscimento di un singolo sito di glicosilazione sintetizzato chimicamente su HA¹⁰ inibendo direttamente il legame del recettore sulle porzioni dei glicani, una maggiore affinità di una struttura Fc mutata a quattro siti al suo recettore è mostrata per suscitare funzioni effettrici in vivo, rivelando la composizione non correlata dei glicani N-linked attaccati al mutante Fc da determinare meccanicamente¹³.

CV-N mostra attività antivirale contro l'HIV 14,15, l'influenza¹⁶ e il virus Ebola, che è mediata dal legame nanomolare alle modificazioni oligosaccaridiche ad alto mannosio sulle proteine spike dell'involucro^12,17,18,19. Il legame dell'influenza HA a un sito di legame dei carboidrati ad alta affinità (H) in CV-N o due H in CVN2 dimerico legato covalentemente è determinato per avere costanti di dissociazione all'equilibrio (K D) = 5,7 nM (Figura 1A) e K_D = 2,7 nM, rispettivamente. Sia CV-N che CVN2 ospitano altri uno o due siti di legame dei carboidrati a bassa affinità (L) 12,17,20,21. Ebola GP1,2 si lega a 2H di CVN2 con affinità nell'intervallo nanomolare inferiore (K_D = 26 nM). Il legame di CV-N WT a Ebola GP1,2 e HA mostra affinità da K D = 34 nM a K_D = 5,7 nM (A/New York/55/04)¹². Le lectine, come CV-N, che colpiscono specificamente i glicani ad alto mannosio sugli involucri virali, inibiscono ulteriormente la replicazione del virus dell'epatite C, SARS-CoV, herpesvirus, virus Marburg e virus del morbillo²².

La piccola molecola CV-N è stata studiata a fondo per più di 20 anni in quanto si funzionalizza per legare una vasta gamma di virus per inibire l'ingresso virale^16,18. Analisi strutturali e saggi di affinità di legame indicano il cross-linking di due L in un dimero CVN2 scambiato di dominio mediante legame bivalente nell'intervallo micromolare per aumentare l'avidità alle glicoproteine dell'involucro virale^10,19. Il legame selettivo di Manα1-2Manα sui bracci Man(8) D1D3 e Man(9) comprende due siti di legame di affinità diverse situati su protomeri proteici opposti²⁰, raggiungendo così affinità di legame nanomolare (Figura 1B). Pertanto, CVN2 è considerato uno pseudo-anticorpo per quanto riguarda la sua applicazione per legare epitopi su HIV gp120, simile agli anticorpi neutralizzanti il virus¹⁷. Qui, l'autore è interessato a studiare il potenziale legame di CVN2 al picco SARS-CoV-2 attraverso il suo dominio di legame del recettore (RBD). Le curve di legame dell'enzima di conversione dell'angiotensina umana immobilizzata (ACE)-2 con il SARS-CoV-2 RBD danno come risultato K_D = 4,7 nM per questa interazione di legame biologicamente rilevante²³.

Al contrario, classi di immunoglobuline selezionate riconoscono modelli proteici strutturali specifici e coerenti, che conferiscono un substrato per la maturazione dell'affinità nelle regioni HA ancorate alla membrana²⁴. CV-N mostra un'attività molto potente in quasi tutti i virus dell'influenza A e B¹⁶ ed è un agente antivirale ampiamente neutralizzante. Le nostre conoscenze sono incomplete sulla posizione di epitopi mirati sul gambo di HA1 e HA2 che potrebbero coinvolgere strutture epitopiche per il targeting dei glicani da anticorpi altamente neutralizzanti e rispetto al legame della lectina²⁵.

Figura 1: Rappresentazione schematica del saggio di legame SPR per CV-N ai picchi dell'involucro virale. (A) Saggio SPR per il legame CV-N al ligando: proteina a lunghezza intera HA (90 kDa). Set di dati cinetici (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2,5, 0 nM) che mostrano in tempo reale il doppio legame con l'influenza HA A/New-York/55/04 (H3N2). (B) CVN2L0 variante V2 che si lega al ligando immobilizzato DM entro un intervallo di concentrazione compreso tra 500 nM e 16 μM. Sequenza: i residui di L sono evidenziati in giallo. I residui di H sono evidenziati in grigio. E58 e R73 sono un sostituto delle cisteine nella proteina wildtype e rendono V2 una piega proteica stabile con tre invece di quattro legami disolfuro Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Mentre lo scudo glicano sulla parte superiore distale della membrana HA induce un legame ad alta affinità con CV-N 12, il legame CVN2 all'HA adiacente a un ponte disolfuro della parte superiore dell'HA è stato ulteriormente osservato nei suoi siti a bassa affinità^10,12. Varie interazioni polari e siti di interazione sono identificati nel legame dei carboidrati da CV-N. Queste interazioni sono verificate generando varianti knock-out nel sito di legame per correlare le affinità di legame alla glicosilazione 12 prevista in silico. Pertanto, il progetto mira a confrontare peptidi HA mannosilati chimicamente precedentemente testati in affinità e specificità di legame con brevi sequenze peptidiche da picchi di 2019-nCoV correlati al SARS e SARS-CoV-2, presenti in natura modificati da un piccolo numero di diversi siti di glicosilazione N-linked e glicosilazione O-linked. Utilizzando la microscopia crioelettronica e saggi di legame, Pinto e collaboratori riportano un anticorpo monoclonale, S309, che potenzialmente riconosce un epitopo sulla proteina spike SARS-CoV-2 contenente un glicano conservato all'interno del sottogenere Sarbecovirus, senza competere con l'attaccamento del recettore²⁶. Il protocollo di questo studio descrive come la progettazione, l'espressione e la caratterizzazione delle varianti di CV-N siano importanti per studiare come CV-N e CVN2 si legano alle proteine glicosilate e ai peptidi mannosilati sintetici utilizzando la tecnologia SPR^10,12.

Il dimero legato al tandem CVN2L0²⁷ e le varianti del sito di legame (V2-V5) sono espressi in modo ricombinante e le varianti sono con sostituzioni del legame disolfuro (C58E e C73R) (Figura 2A). Inoltre, un mutante con una mutazione a punto singolo E41A è preparato perché questa posizione è stata vista come un residuo intermolecolare cross-contact. Questo mutante è un'altra molecola interessante per le misure di legame SPR tra la lectina e gli oligosaccaridi ad alto mannosio che decifra i domini di legame e consente il confronto con la forma dimerica. La struttura cristallina di CVN2 mostra un linker flessibile, che si estende tra 49 e 54 residui. I due domini possono continuare a muoversi attorno alla cerniera come corpi rigidi, sviluppando un monomero attraverso interazioni intramolecolari (dominio A -residui 1-39;90-101- con dominio B -residui 40-89) o un dimero mediante scambio di dominio intermolecolare [dominio A (del primo monomero) con dominio B (del secondo) e dominio B (del primo monomero) con dominio A (della seconda copia)]. Non ci sono interazioni strette tra i domini A e B dei due protomeri, ad eccezione di Glu41²⁸. Il gene per CV-N può essere sviluppato utilizzando un metodo PCR ripetitivo con oligo sintetizzati 40-mer²⁹ e viene quindi subclonato nei siti NdeI e BamHI di pET11a per la trasformazione (elettroporazione) in cellule elettrocompetenti come descritto da Keeffe, J.R.27. La proteina, che viene utilizzata per ottenere la rispettiva struttura cristallina (PDB ID 3S3Y), include un tag di purificazione N-terminale 6-istidina seguito da un sito di scissione della proteasi del fattore Xa. La mutagenesi sito-diretta viene utilizzata per fare mutazioni puntiformi, cambiare codoni e inserire o eliminare basi o codoni singoli o multipli per lo scambio di amminoacidi. Queste trasformazioni forniscono informazioni preziose sulla funzione e la struttura delle proteine. CV-N, CVN2 e CVN3 espressi e purificati in modo ricombinante sono stati biofisicamente ben studiati^20,21,27, sono economici da produrre e quindi utilizzati per caratterizzare saggi di legame ai glicani immobilizzati su chip di sensori SPR. Il saggio di immunoassorbimento enzimatico convenzionale (ELISA) fornisce una minore riproducibilità per quanto riguarda la tecnica di immobilizzazione dei ligandi glicani e trasforma il legame in tempo reale di varie varianti del sito di legame, che viene mostrato per SPR, in saggi endpoint.

La variante di affinità di legame CVN2L0-V2 (una piega intatta di CV-N omodimerico con una sostituzione del ponte disolfuro¹⁰) è espressa con un His-tag in Escherichia coli (E. coli), purificata su colonna Ni-NTA applicando cromatografia di affinità e testata per il legame con HA (H3N2), peptide HA monomannosilato e peptide HA dimannosilato usando SPR. I peptidi mannosilati chimicamente, o proteine HA e S, sono tutti ligandi e ammina accoppiati alla superficie del chip idrofilo tramite esteri reattivi o ingegneria proteica biotina-streptavidina. La stessa procedura di esecuzione sequenziale viene applicata a questi ligandi, iniettando varie diluizioni di CV-N e varianti di CV-N (e CVN2) per ottenere informazioni cinetiche per le analisi di interazione molecolare come descritto di seguito³⁰. Il chip sensore SPR immobilizzato RBD viene utilizzato per studi di legame sui peptidi CV-N a S e le affinità vengono confrontate con il legame SARS-CoV-2 con l'ACE2 umano.

Per il presente studio, una proteina di fusione CVN-small ubiquitina-like modifier (SUMO) è stata utilizzata nei saggi di immunoassorbimento enzimatico invece di CV-N ed è adatta per saggi basati su cellule. La proteina H3 ricombinante a lunghezza intera del virus dell'influenza A HA è ottenuta commercialmente (vedi tabella dei materiali) o espressa in linee cellulari HEK293 di mammiferi e cellule di insetti infettate da baculovirus secondo i protocolli standard¹². La proteina spike Wuhan-1 è espressa nelle cellule HEK293 dei mammiferi. La sintesi del peptide monomannosilato (MM) e del peptide dimannosilato (DM) permette la rilevazione di ligandi omogenei a CVN2 e monomannosilata piccola molecola¹⁰.

1. Creazione di costrutti CV-N

1. Per ciascuna delle varianti di CVN2 e della proteina CVN2L0 (PDB ID 3S3Y), ottenere il costrutto genico con una sequenza leader pelB N-terminale e His-tag nel vettore pET27b(+) da fonti commerciali (vedi Tabella dei Materiali, File Supplementare 1).
2. Ottenere CVN2L0 e le sue varianti (V2, V3, V4 e V5; Figura 2A,C) sullo sfondo di un gene modello CVN2L0 costituito da due distinte sequenze di DNA per ogni ripetizione CV-N.
3. Sciogliere il DNA plasmidico liofilizzato in acqua distillata deionizzata sterile (ddH₂O) fino ad una concentrazione finale di 100 ng/μL.

2. Preparazione di piastre di agar LB con cellule trasformate di DNA plasmidico

1. Preparare il terreno di coltura LB-Lennox sciogliendo 10 g/L di peptone, 5 g/L di estratto di lievito e 5 g/L di NaCl in ddH₂O (vedere Tabella dei materiali) e regolare il pH a 7,4. Eseguire la trasformazione in E. coli BL21 competente (DE3) per ciascuna variante (V2-V5) con metodo chimico seguendo un rapporto precedentemente pubblicato¹⁰.
2. Dividere la soluzione (900 μL e 100 μL), trasferire 100 μL su piastre di agar LB (50 μg/mL di kanamicina) e utilizzare delicatamente uno spargitore di cellule sterili. Incubare le piastre di agar per una notte a 37 °C.

3. Clonazione

1. Subclonare il gene per CV-N nei siti NdeI e BamHI di pET11a (vedi Tabella dei Materiali) per la trasformazione (elettroporazione) in cellule elettrocompetenti seguendo il riferimento²⁷.

4. Mutagenesi sito-diretta

1. Generare CVN2L0²⁹ e CVN-E41A mutante sullo sfondo di un gene modello CVN2L0 contenente due sequenze di DNA distinte per ogni CV-N ripetere²⁷.
2. Effettuare mutazioni utilizzando un kit di mutagenesi sito-diretto (vedi Tabella dei materiali) e primer mutageni specifici 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' e 5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3' per l'esecuzione della PCR³¹.
   1. Avviare una serie di reazioni campione utilizzando concentrazioni multiple di DNA a doppio filamento (dsDNA) modello che vanno da 5-50 ng (ad esempio, 5, 10, 20 e 50 ng di modello di dsDNA). Mantenere costante la concentrazione del primer.
      NOTA: La miscela PCR e il protocollo di ciclo termico sono generalmente utilizzati come descritto nel manuale di istruzioni per il kit di mutagenesi sito-diretta³².
3. Aggiungere l'enzima di restrizione Dpn I (1 μL, 10 U/μL, vedere Tabella dei materiali) sotto il rivestimento dell'olio minerale. Mescolare accuratamente e delicatamente le reazioni, centrifugare in una microcentrifuga da tavolo per 1 minuto e incubare immediatamente a 37 °C per 1 ora per digerire il dsDNA superarrotolato parentale.

5. Trasformazione delle cellule batteriche

1. Scongelare delicatamente le cellule supercompetenti XL1-Blue (vedi Tabella dei materiali) sul ghiaccio. Per trasformare ogni reazione di controllo e campione, aliquotare le celle supercompetenti (50 μL) in un tubo a fondo tondo di polipropilene prerefrigerato (14 ml).
   1. Trasferire 1 μL di DNA a singolo filamento trattato con Dpn I (ssDNA) da ciascuna reazione di controllo e campione (ssDNA mutato) in aliquote separate delle cellule supercompetenti, che sintetizzano il filamento complementare. Ruotare attentamente le reazioni di trasformazione per mescolare e incubare le reazioni sul ghiaccio per 30 minuti.
      NOTA: Prima di trasferire il DNA trattato con Dpn I alla reazione di trasformazione, si raccomanda di rimuovere con cautela l'olio minerale residuo dalla punta della pipetta. Come controllo opzionale, l'efficienza di trasformazione delle cellule supercompetenti XL1-Blue deve essere verificata miscelando 0,1 ng/μL del plasmide di controllo pUC18 (1 μL) con un'aliquota di 50 μL delle cellule supercompetenti.
2. Applicare un impulso termico alle reazioni di trasformazione a 42 °C per 45 s, quindi posizionare le reazioni sul ghiaccio per 2 minuti.
   NOTA: L'impulso termico applicato è già stato ottimizzato per le condizioni menzionate nei tubi a fondo tondo in polipropilene (14 ml).
3. Aggiungere 0,5 mL di brodo NZY+ (contenente per litro: 10 g di ammina NZ (idrolizzato di caseina), 5 g di estratto di lievito, 5 g di NaCl, 12,5 mL di 1 M MgCl 2, 12,5 mL di 1 M MgSO₄, 10 mL di₂ M glucosio, pH 7,5 e preriscaldato a 42 °C) e incubare le reazioni di trasformazione a 37 °C agitando a 225-250 rpm per 1 h. Placcare il volume corretto di ciascuna reazione di trasformazione (5 μL dalla trasformazione del plasmide di controllo; 250 μL dalla trasformazione del campione) su piastre di agar dell'ampicillina LB.
   NOTA: Per i controlli di trasformazione e la mutagenesi, diffondere cellule su piastre di agar LB-ampicillina contenenti 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattopirananoside (X-gal, 80 μg/ml) e isopropil-1-tio-β-D-galattopiranoside (IPTG, 20 mM) (vedere Tabella dei materiali). Inoculare 50 ml di colture cellulari con una singola colonia di E trasformato. cellule coli per purificare il DNA plasmidico mutato per le analisi. La mutagenesi è confermata dal sequenziamento del DNA in una struttura esterna.

6. Espressione e purificazione delle proteine

1. Per una coltura su larga scala, inoculare una piccola quantità di LB (contenente ampicillina) con una singola colonia dalla piastra trasformata.
2. Utilizzando la coltura durante la notte, inoculare la coltura di espressione con additivi, come 10 mM di MgCl₂, 10 mM di MgSO₄ e 20 mM di glucosio, diluendo la coltura di semi a 1/100.
   1. Coltivare cellule con agitazione vigorosa a 37 °C. Far crescere le cellule a un Abs 600 nm tra 0,4-0,6 (fase intermedia) prima di raffreddare le cellule a 20 °C. Indurre con 1 mM IPTG e crescere durante la notte.
   2. Quindi, raccogliere le cellule centrifugando a 4.000 x g per 15 minuti a 4 °C e scartare il surnatante con una pipetta.
3. Risospendere il pellet cellulare in tampone salino tamponato fosfato (PBS) e centrifugare nuovamente a 4.000 x g per 15 minuti a 4 °C. Quindi, scartare il surnatante con una pipetta. Risospendere il pellet rimanente in 10 mL di tampone di lisi e incubare la sospensione per 1 ora a 37 °C.
   NOTA: Composizione del tampone di lisi: (50 mM di NaH 2 PO₄, 300 mM di NaCl, 2% di Triton-X100, 500 ng/mL di lisozima, 1 mM di fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), 1 mM di ditiotreitolo, 1 mM di MgCl₂, pH 8, vedere Tabella dei materiali).
   1. Sottoporre la miscela a due cicli di gelo-disgelo (-80 °C). Separare le frazioni solubili e insolubili mediante centrifugazione a 4.000 x g per 15 minuti a 4 °C e analizzarle utilizzando l'elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE), in particolare il dodecilsolfato di sodio (SDS)-PAGE³³ (Figura 2B, C).
      NOTA: Le cellule possono essere lisate in diversi modi, come congelamento-disgelo, sonicazione, omogeneizzazione, lisi enzimatica o una combinazione di questi metodi. La purificazione dai corpi di inclusione è raccomandata per la raccolta di alte rese proteiche²⁶.
4. Purificare le proteine mediante cromatografia su colonna Ni-NTA (vedi Tabella dei materiali). Caricare la frazione solubile su una colonna di sfere Ni-NTA rigenerata (1 mL/min). Lavare il sistema con tampone TBS (50 mM di Tris, 150 mM di cloruro di sodio, pH 7,5) prima di iniziare un gradiente (0-100% 500 mM di imidazolo in TBS su 60 min) e raccogliere le frazioni (1 mL/min). Dializzare le proteine purificate per la caratterizzazione biochimica contro 100 mM PBS (Figura 2C,D).
5. In alternativa, utilizzare il gel di affinità His-Select Ni 2+ (vedere la tabella dei materiali) in provette da 14 mL per legare e risospendere il CV-N espresso in modo ricombinante marcato in soluzioni tampone rispettivamente con 20 mM di imidazolo e²⁵⁰ mM di imidazolo. Incubare in batch per almeno 30 min.
   NOTA: Applicare queste proteine semi-purificate a una colonna preconfezionata monouso per lo scambio tampone e la pulizia di campioni biologici, ad esempio carboidrati e proteine, che possono caricare 1-1,5 ml di eluato dalla cromatografia ad affinità metallica immobilizzata.
6. Trasferire le soluzioni proteiche in provette di centrifugazione con un filtro di intercettazione da 10 kDa (vedere Tabella dei materiali) e concentrarle centrifugando per 10 minuti a 4.500 x g e 4 °C. Per le misurazioni SPR, sostituire le soluzioni dell'analita con 10 mM HEPES, 150 mM di cloruro di sodio, 3 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e 0,05% Tween20, pH 7,4 (HBS-EP(+), vedere Tabella dei materiali).
   1. Aggiungere questo tampone di funzionamento SPR a un fattore di diluizione di 1:10 e centrifugare quattro volte al volume iniziale per 10 minuti a 4.500 x g e 4 °C.
7. Determinare la concentrazione della proteina a 280 nm utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis NanoDrop (vedi Tabella dei materiali) in base al coefficiente di estinzione calcolato (20.440 M-1 ^cm-1) per la proteina principale CVN2L0 che mostra una dimensione di 23.474 Da³⁴. Utilizzare PBS (100 mM, pH 7,0) o tampone SPR come bianco e misurare la concentrazione proteica in tre fasi di diluizione (1:1, 1:10 e 1:100).

Figura 2: Sequenze ed espressione di CV-N. (A) CVN2 senza un linker tra ogni ripetizione CV-N (101 amminoacidi ciascuno) e quattro ponti disolfuro è espresso nel vettore pET11a in E. coli. (B) Espressioni di due colonie indipendenti per CV-N (monomero) e CVN2 (dimero). (C) Le varianti del legame disolfuro sono purificate e analizzate su SDS-PAGE. Un marcatore a basso peso molecolare (6 μL) viene utilizzato come riferimento. WT = CVN2L0 recante quattro ponti disolfuro come indicato in (A). V2 è una variante con un legame disolfuro sostituito da residui polari nelle posizioni 58 e 73. V3-V5 sono varianti con due legami S-S rimanenti e amminoacidi polari (C58E-C73R) o non polari (C58W-C73M) sostitutivi o una combinazione di queste sostituzioni di coppie di residui. (D) I cromatogrammi HPLC di CVN2L0 purificato sono eluiti a una portata di 1 mL/min con un gradiente lineare dal 5% al 65% del tampone B nel tampone A oltre 30 min. Il tampone A è: 0,1% (v/v) di acido trifluoroacetico in ddH₂O, il tampone B è: 0,08% (v/v) di acido trifluoroacetico in acetonitrile. La proteina viene analizzata su una colonna di gel di silice ad alte prestazioni 300-5-C4 (150 x 4,6 mm) a 214 nm e 280 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

7. Spettroscopia SPR

1. Utilizzare il sistema SPR a doppio canale (vedere la tabella dei materiali) con tampone di corsa HBS-EP(+) e 10 mM di glicina HCl pH 1,5-1,6 come tampone di rigenerazione. Accendere lo strumento, il degasatore, l'autocampionatore, pompare e lavare l'intero sistema con ddH₂0 per 1 h. Posizionare il buffer di esecuzione pronto all'uso in una bottiglia separata.
2. Far cadere l'olio di emersione sul rivelatore e montare un chip sensore di vetro (vedi Tabella dei materiali) rivestito con una sottile pellicola dorata e sul lato superiore funzionalizzato con carbossimetildestrano idrogel direttamente sul rivelatore sotto la cella di flusso a tre porte. Fissare l'impostazione tirando verso il basso la gestione.
   NOTA: C19RBDHC30M 200 nm streptavidina derivatizzata carbossimetildextrane idrogel con una media densità di sindrome respiratoria acuta grave biotinilata coronavirus-2 proteina RBD, è un sensorchip pronto all'uso con il ligando pre-immobilizzato.

8. Saggio di legame SPR per il legame CV-N a HA, proteina S e RBD

1. Immobilizzare i ligandi proteici nei chip del sensore seguendo i passaggi seguenti.
   1. Aprire una tabella di esecuzione facendo clic su Form nella barra dei menu e su Run Table Editor nel software integrato SPRAutoLink (vedere Tabella dei materiali). Scegli e fai clic su BASIC_Immobilization dall'elenco delle tabelle di esecuzione disponibili e segui i passaggi della procedura sperimentale sullo schermo del computer. Il rispettivo editor di esempio utilizzato è mostrato nell'angolo in alto a destra.
   2. Fare clic su Sample Set Editor nella sezione Form per compilare l'elenco dei reagenti per due rack posizionati nell'autocampionatore per ulteriori analisi. Fare clic su Controllo diretto dell'autocampionatore come "Strumento" nella barra dei menu per portare i rack avanti o indietro a casa. Scegliere 4 °C come temperatura di esercizio.
      NOTA: Il software SPR consente "SPR Instrument Direct Control" e "Pump Direct Control" selezionando gli strumenti corrispondenti, nonché gestendo l'autocampionatore e facendo clic su Form; è inoltre possibile scegliere Run Table Editor, Data-Plot o Post-Processing per eseguire l'analisi dei dati. I file vengono salvati direttamente nella directory predefinita ed esportati come scrubber.files dalla finestra Post-elaborazione.
2. Avviare la pompa per infondere ddH₂0 facendo clic su Strumenti e Controllo diretto pompa e registrare i dati facendo clic su SPR Instrument Direct Control e ogni volta avviare nelle finestre appena visualizzate. Inserire i reagenti di accoppiamento (punto 8.3) in flaconcini da 300 μL, inserirli nei rack degli autocampionatori e avviare la tabella di esecuzione facendo clic su Esegui.
   NOTA: Le superfici dei chip sono condizionate con tampone glicina da 10 mM pH 9,0 o possono essere state lavate con cloruro di sodio 1 M, tampone borato di sodio 0,1 M pH 9,0 per condizionare la superficie del chip derivato carbossilico per il mix di attivazione EDC/NHS³⁰.
3. Per questa semplice interazione proteina-proteina, utilizzare il chip CMD500D (vedi Tabella dei materiali) per generare unità di indice di micro-rifrazione (μRIU) = 2500 - 3000 celle a flusso con HA immobilizzato e μRIU = 400 celle a flusso con proteina spike. A una velocità di flusso di infusione di 15 μL/min, iniettare una miscela acquosa e uniforme di 0,4 M N-etil-N'-(dimetilamminopropil) carbodiimmide cloridrato (EDC*HCl) e 0,1 M N-idrossisuccinimide (NHS) applicando i seguenti passaggi sequenziali.
   1. Riempire la pompa di ricarica a 25.000 μL/min, eseguire la regolazione basale per 30 s, iniettare 90 μL di soluzione di attivazione del campione (EDC/NHS) per un tempo di contatto di 6 minuti, quindi tenere premuto per altri 5 minuti.
   2. Ripetere questo ciclo dopo aver eseguito il basale per 1 minuto a 10 μL/min solo sulla cella di flusso sinistra (blu) per iniettare e immobilizzare i peptidi sintetizzati chimicamente 10, HA e la proteina spike a²⁰ μg/mL, e consentire il successivo aggiustamento basale con ddH₂O per 1,5 minuti prima di spegnere la superficie del chip attivato con 1 M etanolammina HCl pH 8,5.
4. Commutare le provette dal campionatore liquido al degasatore da ddH₂0 al flacone con HBS-EP(+) (figura supplementare 1).
5. Analizzare i sensorgrammi SPR.
   1. Per eseguire studi cinetici, utilizzare varie concentrazioni di analita (^10-5-10-8 M), con una fase di rigenerazione dopo ogni iniezione e misurazioni in bianco dopo diversi analiti. Modificare la portata a 10 μL/min e iniziare le iniezioni per un tempo di contatto di 4 minuti, quindi una generazione basale di 5 minuti e due fasi di rigenerazione di 2 minuti ciascuna con un intervallo di 30 s.
   2. Iniettare la soluzione tampone per misurazioni in bianco i cui sensogrammi vengono sottratti dalle corse dei campioni per normalizzare diverse concentrazioni proteiche.
6. Fare clic su Modulo, scorrere verso il basso e passare a "Post-elaborazione" facendo clic su questa modalità operativa. Fate clic su Aggiungi (Add ) per selezionare le curve di binding generate nel tempo nel modulo grafico dati per ciascuna cella di flusso ed esportare la sovrapposizione come file di scrubber (.ovr). Fare clic su File per aprire le opzioni di salvataggio dei file. Ottenere curve di risposta allineando le curve sinistra e destra e sottraendo i segnali del secondo canale di riferimento da quelli del canale ligando.
   NOTA: i dati vengono gestiti in "Post-Processing" definendo i sensorgramma computazionalmente. Viene inserito in una sovrapposizione di sensorgram dalle celle di flusso sinistra e destra o rappresentato come sensorgram dalla differenza di entrambi i canali.
7. Pulire l'intera fluidica con tampone glicina da 50-100 mM pH 9,5, acqua e etanolo al 20% prima e dopo le misurazioni di legame per rimuovere tracce di sale o qualsiasi contaminazione proteica, o più rigoroso, con SDS 0,5% e glicina.
   NOTA: Per evitare danni allo strumento, si consiglia di verificare la stabilità meccanica del chip di vetro prima di reinserire la cartuccia in chip nello strumento se i trucioli sono stati conservati sotto buffer o al 100% di umidità.

Una molecola CVN2L0 scambiata di dominio dimerico viene testata per il legame alla regione superiore dell'HA in tre esperimenti SPR separati e l'affinità di legame è presentata in valori KD. Si presume che il dominio B comprenda siti di legame H, che sono influenzati dalla sostituzione di un legame disolfuro in residui ionici, e il dominio A forma L10,18. Le singole iniezioni di CVN2L0 e delle varianti V2 (tre ponti disolfuro) e V5 (due ponti disolfuro) vengono prima testate per il legame al chip del sensore accoppiato HA per stimare le capacità di legame prima di impostare la misurazione cinetica utilizzando l'autocampionatore e l'editor della tabella di corsa (Figura 3A e Figura supplementare 2). Le iniezioni ripetute sono automatizzate per una serie di CVN2L0, V2 e V5 a varie concentrazioni nell'intervallo nanomolare e μ-molare nel sistema nel tempo (Figura 3B-D). Correlando il numero di legami Cys-Cys intatti, CVN2L0 lega l'HA immobilizzato a KD = 255 nM quando raggiunge una buona saturazione. In questo caso, entrambi i valori di KD, calcolati a partire da dati cinetici o adattando i dati di equilibrio all'isoterma di legame di Langmuir, sono in moderato accordo (Tabella 1 e Figura supplementare 3, Figura supplementare 4).

Figura 3: Saggio di legame SPR per il legame del ligando tramite interazioni multivalenti. CVN2 (WT) e le varianti del sito di legame V2 e V5 con sostituzioni del disolfuro nella tasca di legame dei carboidrati ad alta affinità sono testati per legare l'HA immobilizzato covalentemente. (A) Le curve di legame delle celle di flusso sinistra e destra di CVN2, V2 e V5 possono essere estratte dal protocollo di esecuzione SPR e i sensorgram sono riassunti in una sovrapposizione. (B) Sensorgramma dell'esperimento SPR convenzionale mostrato come analisi cinetica per il legame di CVN2L0 all'HA, iniettando concentrazioni di analita da 10-4 a 10-8 M. CVN2L0 viene misurato fino alla concentrazione massima a 1,5 μM (linea superiore) e fino a 500 nM (linea inferiore), per la quale non si ottiene alcuna saturazione sulla superficie del chip né legame di equilibrio. UR = Unità di risposta. Viene utilizzato un chip sensore CMD500D. (C) Sensorgramma SPR per il legame V2 ad HA. (D) V5 che si lega a HA. La figura (B-D) è riprodotta con il permesso del riferimento10. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Affinità di legame di CVN2 e varianti con HA misurate tramite SPR. Scrubber 2.0 (un software BioLogic) viene utilizzato per adattare le curve di associazione e dissociazione SPR in tempo reale e per calcolare le costanti di dissociazione all'equilibrio (KD) dai dati cinetici e di equilibrio. Ka = costante del tasso di associazione. Kd = costante della velocità di dissociazione.

Mentre i valori di KD per il legame di CVN2L0 e V2 all'HA sono entrambi nell'intervallo nanomolare, V5 è diminuito nel legame (Tabella 1). In V5, due legami disolfuro sono sostituiti da residui di accoppiamento ionico che riqualificano potenziali interazioni ioniche tra residui mutati di Glu e Arg (Figura 2A,3D). I dati primari vengono analizzati seguendo le equazioni integrate di velocità di associazione e velocità di dissociazione, che descrivono la cinetica di legame dell'interazione di CV-N solubile con ligando immobilizzato e la dissociazione del complesso formato dalla superficie del chip. Vengono eseguite due misurazioni indipendenti e vengono analizzati i sensogrammi equivalenti a quelli ottenuti dalle repliche. KD è calcolato come quoziente di koff/ksu (tabella supplementare 1)10,35. Tuttavia, KD è correlato ai dati di equilibrio che si adattano all'isoterma di legame di Langmuir 36, dove la risposta di legame all'equilibrio è tracciata in funzione della concentrazione dell'analita (Figura supplementare 3A,4A,3B,4B). In modo dipendente dalla concentrazione, la costante del tasso di dissociazione kd viene determinata dopo analisi e incorporata nel fitting della fase di associazione (kon) per stimare la costante della velocità di associazione ka. (Tabella 1, figura supplementare 3C, figura supplementare 4C).

Successivamente, il legame di CV-N a HA viene confrontato con la sua interazione con RBD. Il legame di CV-N WT a SARS-CoV-2 RBD è misurato a un'affinità più debole (K D = 260 μM, Figura 4A) rispetto al legame con HA (K D = 5,7 nM)8,10,12 e al legame con la proteina S (KD = 18,6 μM, Figura 5). La concentrazione rispetto alla risposta viene tracciata per il legame di CV-N WT a RBD, assumendo un targeting specifico di carboidrati possibilmente conservati sulla subunità RBD S1 (Figura 4A). Lo stesso grafico di affinità è mostrato per il legame di CVN2L0-V4 al DM che non è più analizzabile a causa della sostituzione dei legami disolfuro che interferiscono con il legame ad alta affinità a piccoli peptidi glicosilati (Figura 4B).

CVN2L0-V4 (2 legami disolfuro opposti alla sostituzione asimmetrica dei residui di cisteina con residui di Glu-Arg o amminoacidi anfipatici Trp e Met) può formare reti di legami idrogeno non polari attorno al sito di legame dei carboidrati dello pseudo-dominio B10. Una maggiore densità di glicani sulla proteina HA raggiunge il legame con residui polari di Glu-Arg invece di cistine (Tabella supplementare 1) e un'associazione con peptidi mannosilati (KD = 10 μM per DM) tra CVN2L0 e le modifiche in Glu-Arg, ma mostra una dissociazione discontinua delle varianti da questo peptide monoglicosilato, in particolare quando H è modificato su entrambi i monomeri. Per l'interazione tra CVN2L0-V4 e DM, la risposta dell'iniezione di CVN2L0-V4 a 56 μM produce una risposta superiore a Rmax. (Figura 4B). V5 (2x Glu-Arg) fallisce nella dissociazione dal DM legato alla superficie (dati non mostrati). In sintesi, le curve di risposta delle concentrazioni più basse diminuiscono prima di terminare l'iniezione per tutti i sensorgrammi sul legame CVN2 al peptide senza H nativo e il legame del monomero a RBD.

Figura 4: Analisi SPR del legame del monomero (A) CV-N WT a RBD. K D viene calcolato adattando i dati cinetici (lato sinistro, K D = 260 μM) e confrontato con i dati di affinità (lato destro) utilizzando un semplice modello biomolecolare per il legame 1:1 tra ligando e analita (KD equil = 274 μM). La risposta di legame all'equilibrio o la capacità di legame è tracciata in funzione della concentrazione rispetto alle curve di legame SPR (0-605 μM CVN). H = Sito di legame ad alta affinità. L = Sito di legame a bassa affinità. Entrambi si trovano su CV-N e CVN2L0. (B) Legame dimerico CVN2L0-V4 al DM, assumendo 2L senza KD analizzabile. Le concentrazioni di CVN2L0-V4 sono 56 μM, 28 μM, 14 μM, 7 μM, 3,5 μM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: CVN-E41A mutanti e CV-N WT si legano alla glicoproteina (A) S. Le frecce indicano l'inizio della fase di associazione e dissociazione. (B) CVN-E41A che si lega a RBD su SARS-CoV-2. I ligandi sono pre-immobilizzati su chip sensore HC policarbossilato e CMD500D. La subunità Covid-19 S1 [Pinto, D. et al.26; e Barnes, C. et al.37] viene utilizzata per l'immobilizzazione RBD. Portata: 30 μL/min, 25 °C; dati grezzi tracciati. In confronto, viene rappresentato il legame degli anticorpi sierici del sangue umano a RBD con un fattore di diluizione di 1:200. (C) Saggio SPR del legame di CV-N WT alla glicoproteina S che viene immobilizzato ad un livello di risposta di 400 μRIU per catturare CV-N. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

È stato dimostrato in precedenza che il CV-N monomerico con una singola L non può legare sufficientemente gp120, ma che la capacità di neutralizzazione di CV-N richiede il cross-linking di due siti di legame dei carboidrati ed è prevalentemente ripristinata dalla dimerizzazione per funzionalizzare con 2H12,19. Quindi, viene espresso un mutante monomerico CVN-E41A, che è sospettato di destabilizzare lo pseudo-dominio B o può interrompere la connettività con il secondo dominio A, come trovato in CV-N WT. Il monomero cvn-E41A rivela stabilità quando si lega alla proteina S simile al monomero CV-N. Sebbene la risposta SPR per concentrazioni di analita 605-680 μM si traduca in unità di risposta elevate e sensorigrammi SPR tipici per il legame CV-N WT e E41A, rispettivamente, il mutante è instabile quando diluito (Figura 5).

Figura supplementare 1: Sensorgramma SPR per catturare il mimetismo DM come parte della parte superiore dell'influenza HA. Screenshot: grafico dei dati SPR che mostra il protocollo SPR run per l'immobilizzazione del DM sul chip del sensore SPR CMD500D, rivestito con idrogel di carbossimetildestrano da 500 nm e adatto per analisi cinetiche di analiti a basso peso molecolare su alta densità di ligando. I chip sensore sono montati direttamente sul rivelatore con olio di emersione e fissati sotto una cella di flusso a tre porte. Dopo aver temprato la superficie del chip attivato con 1 M etanolammina HCl pH 8,5, CVN2 viene iniettato due volte (concentrazione = 1 μM e 2 μM, rispettivamente). Viola: differenza tra cella di flusso 1 e cella di flusso 2; la risposta viene registrata ad un intervallo di 0,2 s. Blu: cella di flusso 1: 3000-4000 unità di indice micro-refrattivo (μRIU) rivestite da una soluzione di 400 nM del ligando DM a una superficie carbossilata attivata. Rosso: cella di flusso di riferimento 2. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Esecuzione manuale su chip sensore CMD500D funzionalizzato HA che mostra il legame di CVN2L0-V5, V2 e CVN2L0 dimerici. A portate di infusione da 30-50 μL/min, CVN2L0 e le varianti di legame disolfuro espresse con un tag His-e purificate su Ni-NTA vengono iniettate nell'intervallo medio μM e testate per il legame all'HA con una fase di associazione di 3 min e una fase di dissociazione di 2 min. Le iniezioni sono V5 (15 μM), V2 (2,4 μM), 0 μM, CVN2L0 subclonato da una proteina di fusione SUMO (1 μM) e CVN2L0 (2 μM). Il tampone corrente a pH fisiologico viene utilizzato per tutti gli esperimenti a 25 °C. Tutte le soluzioni vengono degassate e filtrate (0,2 μm) prima dell'iniezione nel sistema. Viola: differenza tra cella di flusso 1 e cella di flusso 2; la risposta viene registrata ad un intervallo di 0,2 sec. Blu: cella di flusso 1: 2540 μRIU HA. Rosso: cella di flusso di riferimento 2. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3: CVN2 che si lega all'HA. Analisi dei sensorgrammi quando le curve sono auto-allineate. (A) Sensorigrammi azzerati e allineati utilizzando il software Scrubber (a sinistra) e l'isoterma di legame che mostra la curva di risposta dipendente dalla concentrazione agli analiti legati (a destra). (B) Isoterma di legame espressa in capacità percentuale. (C) Curve teoriche di associazione e dissociazione computazionalmente adattate. (D) Dati cinetici su sensorigrammi SPR senza curve adattate. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 4: CVN2 che si lega all'HA. Analisi dei sensorgrammi quando le curve sono allineate manualmente. (A) Sensorigrammi azzerati e allineati utilizzando il software Scrubber (a sinistra) e l'isoterma di legame che mostra la curva di risposta dipendente dalla concentrazione agli analiti legati (a destra). (B) Isoterma di legame espressa in capacità percentuale. (C) Curve teoriche di associazione e dissociazione computazionalmente adattate. (D) Dati cinetici su sensorigrammi SPR senza curve adattate. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 1: Dati cinetici ottenuti dai sensorgrammi SPR per il legame delle varianti di legame CVN2L0 e Cys-Cys V2, V4 e V5 all'HA utilizzando un modello di legame Langmuir 1:1. KD [M] = k off/k on  o kd/ka. Tutti i dati sono generati a 25 °C nel buffer HBS-EP(+).: Fare clic qui per scaricare questa tabella.

L'autore non ha nulla da rivelare.