Questo manoscritto descrive un protocollo semplificato per l'isolamento delle cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) dagli occhi dei topi in modo graduale. Il protocollo include l'enucleazione e la dissezione degli occhi di topo, seguita dall'isolamento, dalla semina e dalla coltura delle cellule RPE.
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Articolo metodologico
Isolamento delle cellule primarie dell'epitelio pigmentato retinico del topo
In questo articolo
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Sommario
Abstract
Lo strato di epitelio pigmentato retinico (RPE) si trova immediatamente dietro i fotorecettori e ospita un complesso sistema metabolico che svolge diversi ruoli critici nel mantenimento della funzione dei fotorecettori. Pertanto, la struttura e la funzione RPE sono essenziali per sostenere la visione normale. Questo manoscritto presenta un protocollo stabilito per l'isolamento delle celle RPE primarie del topo. L'isolamento RPE è un ottimo strumento per studiare i meccanismi molecolari alla base della patologia RPE nei diversi modelli murini di disturbi oculari. Inoltre, l'isolamento RPE può aiutare a confrontare le cellule RPE primarie di topo isolate da topi wild-type e geneticamente modificati, oltre a testare farmaci che possono accelerare lo sviluppo della terapia per i disturbi visivi. Il manoscritto presenta un protocollo di isolamento RPE passo-passo; L'intera procedura, dall'enucleazione alla semina, richiede circa 4 ore. Il terreno non deve essere cambiato per 5-7 giorni dopo la semina, per consentire la crescita delle cellule isolate senza disturbi. Questo processo è seguito dalla caratterizzazione della morfologia, della pigmentazione e dei marcatori specifici nelle cellule tramite immunofluorescenza. Le celle possono essere fatte passare un massimo di tre o quattro volte.
Introduzione
Le cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) si trovano tra la coroide e la retina neurale, formando un semplice monostrato di cellule cuboidali che si trova dietro le cellule dei fotorecettori (PR)1. L'RPE svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento di un ambiente sano per le cellule PR, principalmente riducendo l'eccessivo accumulo di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e il conseguente danno ossidativo1. Le cellule RPE sovrintendono a molte funzioni, come la conversione e lo stoccaggio dei retinoidi, l'assorbimento della luce diffusa, il trasporto di fluidi e ioni e la fagocitosi della membrana del
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Protocollo
Gli animali sono stati utilizzati secondo le linee guida del protocollo animale IACUC dell'università di Oakland numero 21063 e le linee guida della dichiarazione ARVO per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva.
1. Preparazione della soluzione
- Preparare il terreno di coltura cellulare RPE completo integrando il mezzo di coltura Modified Eagle / Nutrient Mixture F-12 di Dulbecco (DMEM / F12) con il 25% di siero bovino fetale (FBS), l'1,5% di penicillina / streptomicina e lo 0,02% di gentamicina.
- Preparare l'enzima A integrando 741 μL di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) con 127 μL di s....
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Risultati
Validazione della specificità, purezza e funzione/formazione barriera di celle RPE isolate
Le cellule isolate sono state esaminate al microscopio ottico per verificarne la vitalità, la morfologia e la pigmentazione. Sono state catturate immagini da P0 e P1 (Figura 1A,B) e immagini da P0 e P4 (Figura 1C,D) per mostrare i cambiamenti nelle celle; forma, dimensione e pigmentazione man mano che i passaggi procedevano verso il quar.......
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Discussione
Il protocollo attuale è una procedura dettagliata segnalata, modificata e semplificata per l'isolamento RPE dagli occhi del mouse. Il protocollo include enucleazione, dissezione, raccolta, semina, coltura e caratterizzazione di cellule RPE isolate dagli occhi di topo.
Ci sono alcune limitazioni e passaggi critici che devono essere soddisfatti per un isolamento RPE di successo, come l'età dei topi, il numero di occhi sezionati, le dimensioni della piastra o del piatto di coltura tissutale e le .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse per dichiarare che sono rilevanti per il contenuto di questo articolo.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal fondo R01 EY029751-04 del National Eye Institute (NEI)
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Bicchiere : 100 ml di | KIMAX | 14000 | |
| da Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C7657-25MG | Per l'enzima funzionante, A |
| Pipette monouso a trasferimento graduato: 3,2 ml sterili | 13-711-20 | ||
| DMEM/F12 | gibco | 11330 | Terreni per la crescita di cellule RPE |
| Siero fetale bovino (FBS) | gibco | 26140079 | Per terreni di coltura cellulare RPE completi |
| Soluzione reagente gentamicina | gibco | 15750-060 | Per terreni di coltura cellulare RPE completi Soluzione |
| salina bilanciata di Hanks (HBSS) | Thermo Scientific | 88284 | Per enzimi funzionanti (A& B) |
| Heracell VISO 160i CO2 Incubatore | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Ialuronidasi da testicoli bovini | Sigma-Aldrich | H3506-500MG | Per lavorare l'enzima A |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Luer-Lok Siringa con ago inserito 21 G x 1 1/2 pollici, sterile, monouso, 3 mL | B-D | 309577 | |
| Micro Centrifuga Provetta: 2 mL | Grainger | 11L819 | |
| Anticorpo monoclonale di topo anti-RPE65 | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab78036 | Per la colorazione IF |
| Penna Strep | gibco | 15140-122 | Per terreni di coltura cellulare RPE completi |
| Pinzette ad azione positiva, Stile 5/45 | Dumont | 72703-DZ | |
| Forbici Iris Standard Dritto 11,5 cm | GARANA INDUSTRIES | 2595 | |
| Centrifuga Sorvall St8 | ThermoScientific | 75007200 | |
| Microscopio Stemi 305 | Zeiss | n/a | |
| Lama chirurgica, #11, acciaio inossidabile | Bard-Parker | 371211 | |
| Piastra per colture in sospensione 60 mm x 15 mm | Corning | 430589 | |
| 100x20 mm in stile | Corning | 353003 | |
| Tornado Tubes: 15 ml Midsci | C15B | ||
| Provette Tornado: 50 ml | Midsci | C50R | |
| Tripsina EDTA (1x) 0,25% | Gibco | 2186962 | Per il funzionamento enzimatico B |
| Pinzette 5MS, 8,2 cm, dritto, 0,09x0,05 mm Punte | Dumont | 501764 | |
| Pinzette ad azione positiva Stile 5, biologico, Dumostar, finitura lucida, 110 mm OAL | Microscopia elettronica Scienze Dumont | 50-241-57 | |
| Sottocuscinetti, moderato: 23" x 36" | McKesson | 4033 | |
| Vannas Forbici a molla - 2,5 mm Tagliente | FST | 15000-08 | |
| Zeiss AxioImager Z2 | Zeiss | n/a | |
| Zeiss Zen Blue 2.6 | Zeiss | n/a |
Riferimenti
- Young, R. W., Droz, B. The renewal of protein in retinal rods and cones. The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 80....
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells
Posted by JoVE Editors on 12/07/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. The Discussion and References sections were updated.
The third paragraph of the Discussion section was updated from:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
to:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
In the References section, a 24th reference was added:
- Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).
