Imaging tissutale altamente multiplexato con coloranti Raman

Sommario

L'imaging a diffusione Raman (epr-SRS) stimolato dalla pre-risonanza elettronica di coloranti Raman simili a arcobaleno è una nuova piattaforma per l'imaging proteico a base di epitopi altamente multiplexati. Qui, presentiamo una guida pratica che include la preparazione degli anticorpi, la colorazione del campione di tessuto, l'assemblaggio del microscopio SRS e l'imaging tissutale epr-SRS.

Abstract

La visualizzazione di una vasta gamma di biomarcatori specifici nei tessuti svolge un ruolo vitale nell'esplorazione delle intricate organizzazioni di sistemi biologici complessi. Pertanto, le tecnologie di imaging altamente multiplexed sono state sempre più apprezzate. Qui, descriviamo una piattaforma emergente di imaging vibrazionale altamente multiplexato di proteine specifiche con sensibilità comparabile all'immunofluorescenza standard tramite imaging a diffusione Raman (epr-SRS) stimolato dalla pre-risonanza elettronica di coloranti Raman simili all'arcobaleno. Questo metodo aggira il limite dei canali risolvibili spettralmente nell'immunofluorescenza convenzionale e fornisce un approccio ottico one-shot per interrogare più marcatori nei tessuti con risoluzione subcellulare. È generalmente compatibile con i preparati tissutali standard, compresi i tessuti fissati alla paraformaldeide, i tessuti congelati e i tessuti umani incorporati nella paraffina fissata alla formalina (FFPE). Prevediamo che questa piattaforma fornirà un quadro più completo delle interazioni proteiche dei campioni biologici, in particolare per i tessuti intatti spessi. Questo protocollo fornisce il flusso di lavoro dalla preparazione degli anticorpi alla colorazione del campione di tessuto, all'assemblaggio del microscopio SRS, all'imaging tissutale epr-SRS.

Introduzione

I sistemi tissutali complessi sono composti da distinte sottopopolazioni cellulari le cui posizioni spaziali e reti di interazione sono profondamente intrecciate con le loro funzioni e disfunzioni ^1,2. Per rivelare l'architettura del tessuto e interrogarne la complessità, è essenziale la conoscenza delle posizioni spaziali delle proteine a risoluzione monocellulare. Quindi, le tecnologie di imaging proteico altamente multiplexed sono state sempre più apprezzate e potrebbero diventare una pietra miliare per lo studio della biologia dei tessuti ^3,4,5. Gli attuali metodi comuni di imaging delle proteine multiplexate possono essere classificati in due categorie principali. Uno è l'imaging a immunofluorescenza seriale che si basa su più cicli di colorazione e imaging dei tessuti, e l'altro è la citometria di massa accoppiata con anticorpi marcati con metalli pesanti 6,7,8,9,10,11,12.

Qui viene introdotta una strategia alternativa per l'imaging proteico a base di anticorpi multiplexati. A differenza della modalità di imaging a fluorescenza prevalente, che può visualizzare solo 4-5 canali contemporaneamente a causa degli ampi spettri di eccitazione ed emissione (larghezza intera a metà massimo (FWHM) ~ 500 ^cm-1), la microscopia Raman presenta una larghezza di linea spettrale molto più stretta (FWHM ~ 10 ^cm-1) e quindi fornisce multiplextà scalabile. Recentemente, sfruttando lo spettro ristretto, è stato sviluppato un nuovo schema di microscopia Raman chiamato microscopia elettronica a dispersione Raman stimolata dalla pre-risonanza (epr-SRS), fornendo una potente strategia per l'imaging multiplexato¹³. Sondando le modalità vibrazionali accoppiate elettronicamente dei coloranti Raman, epr-SRS ottiene un drastico effetto di miglioramento di^{10 13} volte sulle sezioni trasversali Raman e supera il collo di bottiglia di sensibilità della microscopia Raman convenzionale (Figura 1A)13,14,15. Di conseguenza, il limite di rilevazione di epr-SRS è stato spinto al di sotto di μM, il che consente il rilevamento Raman di interessanti marcatori molecolari come proteine e organelli specifici all'interno delle cellule^13,16. In particolare, utilizzando anticorpi coniugati con colorante Raman, l'imaging epr-SRS di proteine specifiche in cellule e tessuti (chiamato immuno-eprSRS) è stato dimostrato con sensibilità comparabile all'immunofluorescenza standard (Figura 1B)^13,17. Regolando la lunghezza d'onda della pompa di soli 2 nm, il segnale epr-SRS sarà completamente spento (Figura 1B), che mostra un elevato contrasto vibrazionale.

Sul lato della sonda, è stata sviluppata una serie di sonde Raman arcobaleno chiamate coloranti Manhattan Raman scattering (MARS) per la coniugazione anticorpale 13,18,19,20. Questa tavolozza Raman unica è composta da nuovi coloranti con tripli legami coniugati π (materiale supplementare), ognuno dei quali mostra un picco epr-SRS singolo e stretto nell'intervallo spettrale Raman bioortogonale (Figura 1C). Modificando la struttura del cromoforo del nucleo e modificando isotopicamente entrambi gli atomi del triplo legame (Materiale Supplementare), sono state sviluppate sonde Raman separate spettralmente. Sfruttando la multiplexità scalabile, la microscopia epr-SRS abbinata alla tavolozza dei coloranti MARS offre una strategia ottica per l'imaging di proteine multiplex one-shot in cellule e tessuti.

Immuno-eprSRS fornisce una strategia alternativa agli attuali metodi di imaging delle proteine multiplex con punti di forza unici. Rispetto agli approcci di fluorescenza con colorazione ciclica, imaging e rimozione del segnale, questa piattaforma basata su Raman garantisce colorazione e imaging a singolo tondo. Pertanto, aggira la complessità pratica nelle procedure cicliche e semplifica in gran parte il protocollo, aprendo così nuovi territori di imaging di proteine multiplexate. Ad esempio, sfruttando un protocollo di compensazione dei tessuti su misura per il colorante Raman, l'immuno-eprSRS è stato esteso a tre dimensioni per la mappatura di proteine altamente multiplexate in tessuti intatti spessi¹⁷. Oltre 10 bersagli proteici sono stati visualizzati lungo tessuti cerebrali di topo spessi millimetri¹⁷. Più recentemente, l'accoppiamento di immuno-eprSRS con un protocollo di microscopia di espansione a ritenzione di biomolecole ottimizzato (ExM)^{protocollo 21}, è stato anche dimostrato l'imaging su scala nanometrica one-shot di più bersagli²². Rispetto alla spettroscopia di massa ^4,9, epr-SRS non è distruttivo e ha intrinsecamente capacità di sezionamento ottico. Inoltre, epr-SRS è più efficiente in termini di tempo nella scansione dei tessuti. In genere, una regione di tessuto di 0,25 mm² con una dimensione dei pixel di 0,5 μm richiede solo pochi minuti per l'immagine per un singolo canale epr-SRS. Ad esempio, il tempo totale di imaging di quattro canali SRS più quattro canali di fluorescenza nella Figura 4 è di circa 10 minuti.

Protocollo

Il protocollo è stato condotto in conformità con il protocollo sperimentale animale (AC-AABD1552) approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Columbia University.

1. Preparazione di anticorpi coniugati con colorante Raman

1. Preparare il tampone di coniugazione come ~0,1 M NaHCO₃ in tampone PBS, pH = 8,3, conservare a 4 °C.
2. Preparare la soluzione di sonda MARS (materiale supplementare) con funzione estere N-idrossisuccinimidy (NHS) come 3 mM in DMSO anidro. La sintesi delle sonde MARS può essere riferita ai rapporti precedenti 13,17,18.
   NOTA: Ai fini della conservazione, la soluzione di estere colorante NHS deve essere protetta dalla luce e mantenuta a -20 °C.
3. Sciogliere i solidi anticorpali nel tampone di coniugazione ad una concentrazione di 2 mg/mL. Per gli anticorpi disciolti in altri tamponi, scambiarli nel tampone di coniugazione ad una concentrazione di 1-2 mg/mL con filtri centrifughi.
   NOTA: gli anticorpi secondari altamente adsorbiti sono preferiti per la colorazione multiplex per ridurre al minimo la reattività tra specie. Gli anticorpi secondari utilizzati sono elencati nella Tabella 1 e nella Tabella dei materiali.
4. Eseguire la reazione di coniugazione.
   1. Per gli anticorpi secondari, aggiungere 15 volte l'eccesso molare di soluzione di colorante alla soluzione anticorpale in un flaconcino di vetro lentamente mescolando. Ad esempio, in 0,5 mL 2 mg/mL di soluzione anticorpale, aggiungere 35 μL 3 mM di soluzione colorante.
   2. Incubare la miscela di reazione a temperatura ambiente (RT) con agitazione per 1 ora. Proteggere la reazione dalla luce.
5. Purificazione.
   1. Preparare il liquame di resina di filtrazione del gel (Tabella dei materiali) nel tampone PBS, seguendo i passaggi 1.5.2-1.5.4.
   2. Aggiungere 10 mL di polvere di resina filtrante gel in 40 mL di tampone PBS all'interno di un tubo da 50 mL.
   3. Conservare la soluzione a bagnomaria a 90 °C per 1 ora.
   4. Decantare il surnatante e riaggiungere PBS a 40 ml. Conservare il liquame a 4 °C.
   5. Imballare la colonna di esclusione delle dimensioni (diametro di 1 cm, colonne a flusso gravitazionale) con la soluzione di liquame all'altezza di 10-15 cm.
   6. Risciacquare e lavare la colonna con ~ 10 ml di tampone PBS per imballare ulteriormente la resina.
   7. Pipettare la miscela di reazione di coniugazione (~0,5 mL) alla colonna. Aggiungere immediatamente 1 mL di tampone PBS come tampone di eluizione quando viene caricata tutta la miscela di reazione. Riempire costantemente il buffer di eluizione (PBS) sulla colonna.
   8. Raccogliere l'eluato della soluzione coniugata osservando il colore sulla colonna (i coloranti MARS hanno colori da verde chiaro a blu) o misurando l'assorbanza a 280 nm (A280).
6. Concentrare la soluzione raccolta a 1-2 mg/mL con un filtro centrifugo.
7. Determinare la concentrazione e il grado medio di etichettatura (DOL, rapporto colorante-proteina) misurando lo spettro ultravioletto-visibile (UV-Vis) della soluzione coniugata con un lettore di piastre Nano.
   NOTA: il materiale supplementare fornisce le proprietà degli esteri NHS del colorante MARS per il calcolo. Il DOL normale per l'anticorpo secondario è di circa 3.

2. Preparazione del campione di tessuto

1. Paraformaldeide fissa tessuti cerebrali di topo.
   1. Anestetizzare i topi (C57BL/6J, Femmina, 25 d postnatale) con isoflurano. Valutare la corretta anestesia con un test del pizzico della punta.
   2. Uccidi i topi per spostamento cervicale. Perfondere immediatamente i topi con il 4% di paraformaldeide (PFA) in PBS transcardialmente.
   3. Raccogliere il cervello del topo, seguendo i passaggi 2.1.4-2.1.5
   4. Tagliare verso l'alto dal tronco cerebrale lungo la sutura sagittale. Sbuccia le due metà del cranio di lato e tira fuori il cervello con una pinzetta.
   5. Fissare il cervello raccolto in PFA al 4% in PBS a 4 °C per 24 ore. Quindi, lavare il cervello nel tampone PBS a 4 °C per 24 ore per rimuovere l'eccesso di PFA.
   6. Introdurre l'agarosio solido in acqua fino ad una concentrazione finale del 7% (p/v) in un becher, con un coperchio sciolto. Mescolare la soluzione con un'asta di agitazione del vetro. Riscaldare il liquame nel microonde fino a quando la soluzione è limpida.
   7. Lasciare raffreddare l'agarosio a 45-55 °C.
   8. Versare l'agarosio liquido in una piccola camera, quindi trasferire il cervello da PBS all'agarosio liquido e orientarlo con una spatola per incorporare il cervello. Attendere che il blocco tessuto-agarosio si indurisca.
   9. Sezionare il tessuto-agrose in fette coronali spesse 40 μm usando un vibratoma.
   10. Trasferire il tessuto in una piastra a 4 pozzetti per la successiva colorazione. Rimuovere l'agarosio con una pinzetta. Lavare il tessuto con 1 ml di PBS, tre volte.
2. Tessuti pancreatici di topo congelati fissi.
   1. Fissare la pancreata del mouse in PFA al 4% in PBS a 4 °C con oscillazione per 16-20 ore.
   2. Lavare il campione in 1 mL di PBS (4 °C) tre volte per rimuovere il PFA.
   3. Incorporare il campione (~ 0,3-0,5 cm di dimensione) in blocchi composti a temperatura di taglio ottimale (OCT). Metti 2 gocce di OCT in un criostampo di plastica. Posizionare il tessuto nel corretto orientamento e versare OCT sopra i tessuti fino a quando nessuno dei tessuti rimane esposto.
   4. Sezionare la pancreata a fette spesse 8 μm e immobilizzarle su un vetrino di vetro legante il tessuto, conservarle a -80 °C.
   5. Prima di colorare, equilibrare il campione a RT. Lavare il tessuto con PBS per rimuovere i blocchi OCT.
3. Campioni FFPE.
   1. Cuocere il vetrino ffpe a 60 °C per 10 min.
   2. Deparaffinazione e reidratazione: Posizionare i campioni in sequenza nelle seguenti soluzioni in un tubo da 50 ml a RT per 3 minuti ogni volta con lieve agitazione:
      xilene due volte,
      etanolo due volte,
      95% (vol/vol) di etanolo in acqua deionizzata due volte,
      70% (vol/vol) di etanolo in acqua deionizzata due volte,
      50% (vol/vol) di etanolo in acqua deionizzata una volta,
      acqua deionizzata una volta.
   3. Trasferire il campione in 20 mM di citrato di sodio (pH 8,0) a 100 °C in un barattolo di vetro. Assicurarsi che i tessuti siano immersi nella soluzione.
   4. Mettere il barattolo a bagnomaria a 60 °C per 45 min.
   5. Lavare il campione con acqua deionizzata a RT per 5 minuti.

3. Colorazione immuno-eprSRS tissutale

1. Utilizzare una penna idrofoba per disegnare un limite attorno alle sezioni di tessuto sul vetrino.
   NOTA: un barattolo di colorazione del vetrino viene utilizzato per seguire le fasi di incubazione del tessuto sul vetrino. I tessuti galleggianti (sezioni cerebrali di topo spesse 40 μm) sono macchiati in piastre di pozzo.
2. Incubare i tessuti con 0,3-0,5% PBST (Triton X-100 in PBS) per 10 min.
3. Incubare i tessuti con tampone bloccante (5% siero d'asino, 0,5% Triton X-100 in PBS) per 30 min.
4. Preparare la soluzione colorante primaria: aggiungere tutti gli anticorpi primari a 200-500 μL di tampone colorante (2% siero d'asino, 0,5% Triton X-100 in PBS) alle concentrazioni desiderate. Centrifugare la soluzione colorante primaria a 13.000 x g per 5 min. Utilizzare il surnatante solo se si formano precipitati.
5. Incubare il tessuto nella soluzione anticorpale primaria a 4 °C per 1-2 giorni.
   NOTA: per colorare le sezioni di tessuto sul vetrino, mettere il campione in una scatola di colorazione con una salvietta umidificata per mantenere l'umidità.
6. Lavare le diapositive tre volte con 0,3-0,5% PBST a RT per 5 minuti ciascuna. Utilizzare 1 mL PBST per tessuti galleggianti. Per i tessuti sul vetrino, lavare i vetrini in un barattolo di colorazione del vetrino e assicurarsi che i tessuti siano tutti immersi nella soluzione.
7. Incubare il tessuto in 200-500 μL di tampone bloccante per 30 min.
8. Preparare la soluzione colorante secondaria: aggiungere tutti gli anticorpi secondari (e le lectine se necessario) a 200-500 μL di tampone colorante con le concentrazioni desiderate (normalmente 10 μg/mL). Centrifugare la soluzione colorante secondaria a 13.000 x g per 5 min. Utilizzare il surnatante solo se si formano precipitati.
9. Incubare i tessuti in 200-500 μL di soluzione anticorpale secondaria a 4 °C per 1-2 giorni.
10. Lavare le diapositive due volte con 0,3-0,5% PBST a RT per 5 minuti ciascuna.
11. Incubare con 200-500 μL di soluzione DAPI per 30 min.
12. Lavare le diapositive tre volte con PBS a RT per 5 minuti ciascuna.
13. Per le sezioni di tessuto galleggianti, trasferirle su vetrini con una pipetta a goccia di vetro. Stendere il tessuto con una spazzola per tessuti e pulire l'ambiente circostante con salviette se necessario.
14. Montare il tessuto in una goccia di reagenti antideflagranti con un coperchio di vetro e fissarlo con lo smalto per unghie.

4. Assemblaggio del microscopio SRS

NOTA: un sistema di fluorescenza confocale commerciale viene utilizzato nell'imaging a fluorescenza SRS in tandem. Ulteriori descrizioni sono disponibili in un rapporto precedente¹⁷. Questo protocollo si concentrerà sul lato di imaging SRS utilizzando l'eccitazione a banda stretta.

1. Preparare un tavolo ottico isolato dalle vibrazioni in una stanza con controllo della temperatura.
2. Posizionare un sistema a doppio laser sincronizzato (pompa e Stokes) sul tavolo ottico (Figura 2A) con un refrigeratore collegato.
   NOTA: Il laser fondamentale nel sistema dual-laser fornisce un treno di impulsi di uscita a 1064 nm con larghezza di impulso di 6 ps e frequenza di ripetizione di 80 MHz. Il raggio di Stokes proviene dal laser fondamentale. L'intensità del fascio di Stokes è stata modulata sinusoidalemente da un modulatore di ampiezza elettro-ottica (EOM) incorporato a 8 MHz con una profondità di modulazione superiore al 90%. L'altra porzione del laser fondamentale è raddoppiata in frequenza a 532 nm, che viene ulteriormente utilizzata per seminare in modo sincrono un oscillatore ottico parametrico (OPO) a picosecondi per produrre un treno di impulsi bloccato in modalità con larghezza di impulso di 5-6 ps (il fascio inattivo dell'OPO è bloccato con un filtro interferometrico). La lunghezza d'onda di uscita dell'OPO è sintonizzabile da 720-950 nm, che funge da fascio della pompa.
3. Montare gli specchi (gamma di lunghezze d'onda: 750-1100 nm), gli splitter a fascio dicroico (DBS, filtro passa-lungo da 980 nm, rettangolare) e la lente (acromatico, rivestimento AR per 650-1050 nm) sui rispettivi supporti. Utilizzare supporti a specchio cinematici molto stabili per gli specchi e gli splitter a fascio dicroico.
4. Misurare l'altezza dell'uscita laser e le dimensioni del fascio della pompa e dei raggi Stokes. Regola l'altezza degli specchi e delle lenti per assicurarti che la luce colpisca il centro di tutti gli elementi ottici.
5. Posizionare lo specchio M1 sul tavolo ottico e renderlo ~ 45 ° all'uscita laser (Figura 2B). Utilizzare le manopole sul supporto cinematico per effettuare regolazioni di punta e inclinazione. Assicurarsi che la luce viaggi alla stessa altezza lungo la lunghezza del tavolo e una linea retta rispetto al tavolo.
6. Posizionare e allineare gli splitter a fascio dicroico (filtri long-pass da 980 nm) e gli specchi per dividere la pompa e le travi di Stokes (Figura 2A-B).
7. Posizionare e allineare le coppie di lenti (L1, L2 e L3, L4) su ciascuno dei percorsi del fascio per collimare i raggi ed espandere i diametri del fascio in modo che corrispondano alla pupilla posteriore dell'obiettivo (Figura 2A-B).
8. Utilizzare specchi M7 e M8 per allineare i raggi laser combinati al microscopio (Figura 2C). Allineare prima un raggio nel microscopio e utilizzare le coppie di specchi sull'altro raggio per garantire la sovrapposizione spaziale dei due fasci.
9. Impostare la parte di rilevamento.
   1. Indossare un condensatore di olio rivestito a infrarossi (1.4-NA) per raccogliere la pompa in avanti e le travi di Stokes dopo aver attraversato i campioni (Figura 2C).
   2. Montare un fotodiodo Si di grandi dimensioni su una scatola schermata con connettori BNC (Figura 2E). Aggiungere un alimentatore a 64 V CC al fotodiodo montato per aumentarne la soglia di saturazione e la larghezza di banda di risposta.
   3. Rifletti la luce in avanti con uno specchio da 2 pollici. Rifocalizzare la luce sul fotodiodo dopo un filtro ottico per bloccare il fascio di Stokes modulante (Figura 2D).
   4. Invia la corrente di uscita del fotodiodo a un amplificatore lock-in veloce terminato con 50 per la demodulazione del segnale. Invia un trigger a 8 MHz all'amplificatore lock-in come segnale di riferimento.
   5. Inviare il componente X in fase dell'amplificatore lock-in nella scatola di interfaccia analogica del microscopio.
10. Ottimizzare la sovrapposizione temporale con lo stadio di ritardo motorizzato integrato misurando il segnale SRS del liquido D₂O puro al microscopio.

5. Acquisizione e analisi delle immagini

1. Esegui l'imaging epr-SRS multicanale con la regolazione sequenziale della lunghezza d'onda della pompa.
   1. Impostare la potenza del laser su _pompa P = 10-40 mW e P_Stokes = 40-80 mW sul pannello di controllo laser.
   2. Impostare il tempo di permanenza dei pixel a 2-4 μs e utilizzare più fotogrammi con una media di 10-20 fotogrammi sul software di microscopia.
      NOTA: Evitare un uso combinatorio di alta potenza laser (_pompa P> 40 mW, P_Stokes> 80 mW) e dimensioni ridotte dei pixel (<0,2 μm), che probabilmente causano "effetto sbiancamento" dei coloranti Raman a causa dell'eccitazione multifotonica.
   3. Impostare le costanti temporali dell'amplificatore lock-in su metà del tempo di permanenza dei pixel.
2. Unmixing spettrale lineare.
   NOTA: epr-SRS segue una rigorosa dipendenza lineare segnale-concentrazione sull'intero intervallo di concentrazione; pertanto, l'unmixing spettrale lineare è efficace per rimuovere qualsiasi potenziale cross-talk tra canali. Per la misura epr-SRS a canale N con sonde N MARS, i segnali misurati (S) possono essere espressi come S = MC, dove C è la concentrazione della sonda MARS e M è una matrice N x N determinata dalle sezioni trasversali Raman delle sonde MARS.
   1. Misurare la matrice M su campioni immuno-eprSRS monocolore etichettati con diverse sonde MARS.
   2. Usare l'equazione C = M−1· S per determinare la matrice di concentrazione della sonda MARS con la misurazione del segnale del campione multiplex S.

Risultati

La Figura 3 mostra immagini di esempio di epr-SRS in diversi campioni, tra cui cellule fisse (Figura 3A), tessuti di topo fissati per paraformaldeide (PFA) (Figura 3B) e campioni umani incorporati in paraffina fissa in formalina (FFPE) (Figura 3C). La risoluzione spaziale della microscopia SRS è limitata alla diffrazione, la risoluzione laterale tipica è di ~ 300 nm e la risoluzione assiale è di 1-2 μm ...

Discussione

Qui, presentiamo il protocollo immuno-eprSRS che è ampiamente applicabile ai tipi di tessuto comuni, compresi i tessuti di topo appena conservati, i tessuti umani FFPE e i tessuti di topo congelati. Immuno-eprSRS è stato convalidato per un pannello di epitopi in cellule e tessuti, come elencato nella Tabella 1. Questa piattaforma one-shot è particolarmente adatta per applicazioni in cui le strategie cicliche non funzionano bene. Ad esempio, la fluorescenza ciclica è impegnativa per i tessuti spessi poich...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
16% Paraformaldeide, Microscopia Elettronica di Grado EM		Scienze 15710
&alfa;-tubulina	Abcam	ab18251	Anticorpi primari
&alfa;-tubulina	BioLegend	625902	Anticorpi primari
β-III-tubulina	BioLegend	657402	Anticorpi primari
β-III-tubulina	Abcam	ab41489	Anticorpi primari
β-tubulina	Abcam	ab131205	Anticorpi primari
Agarosio, bassa temperatura gelificante	Sigma	Aldrich A9414	Per l'inclusione cerebrale
Anticorpo anti-a-tubulina prodotto nel coniglio (&alfa;-tubulina)	Abcam	ab52866	Anticorpi primari
Anticorpo anti-Calbindina prodotto nel topo (Calbindina)	Abcam	ab82812	Anticorpi primari
Anti-recettore B del GABA R2  anticorpo prodotto nella cavia (recettore GABA B R2)	Millipore Sigma	AB2255	Anticorpi primari Anticorpo
anti-GFAP prodotto nella capra (GFAP)	Thermo Scientific	PA5-18598	Anticorpi
primari Anticorpo anti-glucagone prodotto nel topo (Glucagone)	Santa Cruz Biotechnology	sc-514592	Anticorpi primari
Anticorpi anti-insulina prodotti in cavia (insulina)	DAKO	IR00261-2	Anticorpi primari
Anticorpi anti-MBP prodotti nel ratto (MBP)	Abcam	ab7349	Anticorpi primari Anticorpi
anti-NeuN prodotti nel coniglio (NeuN)	Thermo Scientific	PA5-78639	Anticorpi primari
Anticorpo anti-polipeptide pancreatico (PP) prodotto in capra- Polipeptide pancreatico (PP)	Sigma Aldrich	SAB2500747	Anticorpi primari
Anticorpo anti-Pdx1 prodotto nel coniglio (Pdx1)	Milipore	06-1379	Anticorpi
primari Anticorpo anti-somatostatina prodotto nel ratto (Somatostatina)	Abcam	ab30788	Anticorpi
primari Anticorpo anti-Vimentina prodotto nel pollo ( Vimentin)	Abcam	ab24525	Anticorpi primari
Filtro passa-banda	KR Electronics	KR2724	8 MHz
BNC 50 Ohm Terminator	Mini Circuits Cavo	STRM-50
BNC Cavo	Thorlabs	2249-C	, BNC Maschio / Maschio
Specchio dielettrico a banda larga	Thorlabs	BB1-E03	750 - 1100 nm
C57BL/6J mouse	Jackson Laboratory	000664
Centrifuga
Condensatore	Olympus		ad immersione in olio, 1.4 N.A.
Citocheratina 18	Abcam	ab7797	Anticorpi primari
Citocheratina 18	Abcam	ab24561	Anticorpi primari
Alimentazione CC	TopWard	6302D	La tensione di polarizzazione è di 64 V
Montatura dicroica	Thorlabs	KM100CL	Montaggio cinematico per ottiche rettangolari alte fino a 1,3" (33 mm),
asino mancino anti-pollo IgY (H+L)	Jackson ImmunoResearch	703-005-155	Anticorpi secondari per la coniugazione MARS
IgG anti-capra d'asino (H+L)	Jackson ImmunoResearch	705-005-147	Anticorpi secondari per la coniugazione MARS
IgG anti-cavia d'asino (H+L)	Jackson ImmunoResearch	706-005-148	Anticorpi secondari per la coniugazione MARS
IgG anti-topo d'asino (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-005-151	Anticorpi secondari per la coniugazione MARS
IgG anti-coniglio d'asino (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-005-152	Anticorpi secondari per la coniugazione MARS
IgG anti-ratto d'asino (H+L)	Jackson ImmunoResearch	712-005-153	Anticorpi secondari per la coniugazione MARS
IgG anti-pecora d'asino (H+L)	Jackson ImmunoResearch	713-005-147	Secondario anticorpi per la coniugazione MARS
DPBS	Fisher Scientific	14-190-250
EpCAM	Abcam	ab71916	Anticorpi primari
Etanolo	Sigma Aldrich	443611
Amplificatore look-in ad alta velocità	Zurich Instruments	HF2LI	DC - 50 MHz
FFPE Campione di rene	USBiomax	HuFPT072
Fibrillarin	Abcam	ab5821	Anticorpi primari
Giantin	Abcam	ab24586	Anticorpi primari
Glucagone	Santa Cruz Biotechnology	sc-514592	Anticorpi primari
H2B	Abcam	ab1790	Anticorpi primari
HeLa	ATCC	ATCC CCL-2
Filtro passa-banda ad alto diametro esterno	Chroma Tecnologia	ET890/220m	Filtra il raggio di Stokes e trasmetti il raggio della pompa
Penna idrofobica	Fisher Scientific	NC1384846
Insulina	ThermoFisher	701265	Anticorpi primari
Sistema laser SRS integrato	Fisica applicata e ... Elettronica, Inc.	picoEMERALD	picoEMERALD fornisce un treno di impulsi di uscita a 1.064 nm con larghezza di impulso di 6 ps e frequenza di ripetizione di 80 MHz, che funge da fascio di Stokes. Il fascio raddoppiato in frequenza a 532 nm viene utilizzato per seminare in modo sincrono un oscillatore parametrico ottico (OPO) a picosecondi per produrre un treno di impulsi bloccato in modalità con un'ampiezza di impulso di cinque ~ 6 ps (il raggio idler dell'OPO è bloccato con un filtro interferometrico). La lunghezza d'onda di uscita dell'OPO è regolabile da 720– 950 nm, che funge da raggio della pompa. L'intensità del fascio di Stokes da 1.064 nm è modulata sinusoidalmente da una EOM integrata a 8 MHz con una profondità di modulazione superiore al 90%. Il fascio della pompa è sovrapposto spazialmente al fascio di Stokes utilizzando uno specchio dicroico all'interno di picoEMERALD. La sovrapposizione temporale tra la pompa e i treni di impulsi di Stokes è ottenuta con uno stadio di ritardo incorporato e ottimizzata dal segnale SRS di D2O puro al microscopio.
Microscopio a scansione laser invertito	Olympus	FV1200MPE
Montatura a specchio cinematico	Thorlabs	POLARIS-K1-2AH	2 Regolatori esagonali a basso profilo
Lectina da Triticum vulgaris (grano)	Sigma Aldrich	L0636-5 mg
Divisore di fascio dicroico passa-lungo	Semrock	Di02-R980-25x36	980 nm laser BrightLine  divisore di fascio dicroico piatto laser a bordo singolo
MAP2	BioLegend	801810	Anticorpi primari
Software di imaging per microscopia	Olympus	FluoView
NanoQuant Plate	Tecan		Per analisi di piccoli volumi basate sull'assorbanza in un lettore di piastre.
Siero d'asino normale	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)	Thermo Scientific	R37606
Nunc 4-Well Dishes	Fisher Scientific	12-566-300
Obiettivo	Olympus	XLPlan N	x25, 1.05-NA, MP, distanza di lavoro =  2&sottile; mm
Pennello
Periscopio assemblaggio	Thorlabs	RS99	include le unità superiore e inferiore, Ø Palo da 1" e forcella di serraggio.
Misuratore di
Lettore di piastre	Tecan	Infinite 200 PRO	Un lettore di piastre multimodale facile da usare. Capacità di misurazione dell'assorbanza su una gamma spettrale di 230– 1000 nm.
Reagente antisbiadimento ProLong Gold	Thermo Scientific	P36930
PSD95	Invitrogen	51-6900	Anticorpi primari
Sephadex G-25 Medium	GE Life Sciences	17-0033-01	resina filtrante in gel per la desalinizzazione e la sostituzione del tampone
Scatola schermata con connettori BNC	Pomona Electronics	2902	con coperchio, BNC femmina/femmina
Si fotodiodo	Thorlabs	FDS1010	350– 1100 nm, 10 mm x 10 mm Area attiva
Sinapsina 2	ThermoFisher	OSS00073G	Anticorpi primari
Percorso tissutale Superfrost Plus Gold Slides	Fisher Scientific	22-035813	Vetrino adesivo per attrarre e legare chimicamente sezioni di tessuto fresche o fissate in formalina saldamente alla superficie del vetrino (tiisue legare i vetrini)
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
Vibratomo	Leica	VT1000
Vimentin	Abcam	ab8069	Anticorpi primari
Xileni	Sigma Aldrich	214736