Articolo metodologico

Il modello di perno per frattura tibiale: un modello murino clinicamente rilevante di lesione ortopedica

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DOI:

10.3791/63590

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28 luglio 2022

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1Department of Anesthesiology, Perioperative and Pain Medicine, Stanford University School of Medicine, 2Neurosciences Graduate Program, Stanford University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Il modello di perno per frattura tibiale è un modello clinicamente rilevante di trauma ortopedico che comprende una frattura tibiale aperta unilaterale con fissazione interna del chiodo intramidollare e lesione simultanea al muscolo tibiale anteriore. La sensibilità termica in questo modello può essere misurata utilizzando un paradigma a piastra riscaldante a 45 s.

Abstract

Il modello di perno per frattura tibiale è un modello murino di traumatologia ortopedica e chirurgia che ricapitola il complesso danno muscolare, osseo, nervoso e del tessuto connettivo che si manifesta con questo tipo di lesione nell'uomo. Questo modello è stato sviluppato perché i precedenti modelli di trauma ortopedico non includevano lesioni simultanee a più tipi di tessuto (ossa, muscoli, nervi) e non erano veramente rappresentativi del trauma ortopedico complesso umano. Gli autori hanno quindi modificato i precedenti modelli di trauma ortopedico e sviluppato il modello di frattura tibiale-perno. Questo modello di frattura modificata consiste in una frattura tibiale aperta unilaterale con fissazione interna del chiodo intramidollare (IMN) e contemporanea lesione del muscolo tibiale anteriore (TA), con conseguente allodinia meccanica che dura fino a 5 settimane dopo l'infortunio. Questa serie di protocolli delinea i passaggi dettagliati per eseguire il modello di perno di frattura tibiale da trauma ortopedico clinicamente rilevante, seguito da un test su piastra riscaldante modificato per esaminare i cambiamenti nocicettivi dopo una lesione ortopedica. Nel loro insieme, questi protocolli dettagliati e riproducibili consentiranno ai ricercatori del dolore di espandere il loro kit di strumenti per lo studio del dolore indotto da traumi ortopedici.

Introduzione

I traumi ortopedici rappresentano il 25% di tutte le lesioni subite da quasi 500 milioni di persone ogni anno in tutto il mondo 1,2,3. Il trauma ortopedico può essere associato a danni complessi a muscoli, ossa, nervi e tessuto connettivo, che richiedono il ricovero in ospedale e la chirurgia per garantire un recupero adeguato 3,4. Il dolore acuto e cronico dopo un trauma ortopedico può comportare notevoli oneri fisici, psicologici e finanziari che influiscono sulla qualità della vita di un paziente 1,4. Inoltre, la chirurgia ortopedica per stabilizzare e riparare le fratture è anche associata a grave dolore post-chirurgico acuto e cronico 5,6,7,8,9.

I meccanismi alla base del dolore acuto e cronico correlato al trauma devono essere meglio compresi per sviluppare trattamenti migliori. Per raggiungere questo obiettivo, sono necessari modelli preclinici affidabili, riproducibili e clinicamente rilevanti. Poiché la maggior parte dei modelli animali di trauma ortopedico non comportava lesioni simultanee a più tipi di tessuto (ossa, muscoli, nervi), non erano veramente rappresentativi di traumi ortopedici complessi umani, ad esempio traumi dopo cadute, incidenti automobilistici o lesioni legate alla guerra 10,11. Pertanto, abbiamo sviluppato il modello murino di frattura tibiale per esaminare le principali manifestazioni di tale lesione, tra cui il danno osseo e muscolare e il dolore acuto e cronico11. Il modello a perno per frattura tibiale consiste in una frattura tibiale aperta unilaterale con fissazione interna IMN e contemporanea lesione muscolare TA. Le sezioni istologiche dell'AT mostrano una lesione al muscolo in cui si sviluppa una fibrosi densa con conseguente perdita di fibre muscolari grandi e mature già 2 settimane dopo l'infortunio. Inoltre, il callo fratturale è evidente alla tomografia microcomputerizzata (microCT) 4 settimane dopo l'infortunio e continua a subire un rimodellamento11.

Vari saggi comportamentali riflessi e non riflessivi possono essere utilizzati per valutare le componenti sensoriali e affettive del dolore nel modello di perno per frattura tibiale. Ad esempio, in questo modello è possibile utilizzare i filamenti Von Frey per dimostrare l'ipersensibilità meccanica. Infatti, i topi sviluppano un'ipersensibilità meccanica di lunga durata nella zampa posteriore omolaterale dopo l'intervento chirurgico di frattura tibiale11. Un altro paradigma comportamentale particolarmente utile è il saggio su piastra calda, che tradizionalmente misura la latenza del ritiro della zampa a uno stimolo termico. Sebbene questo test sia stato utilizzato per decenni12, davvero un gold standard nella ricerca preclinica sul dolore, la misurazione del comportamento riflessivo da sola ha i suoi limiti13. Di conseguenza, abbiamo sviluppato un paradigma di piastra riscaldante modificato in grado di catturare elementi di risposte sia riflessive che non riflessive nell'impostazione di uno stimolo termico14.

Questo test su piastra calda modificato determina la latenza di risposta iniziale come nel test originale su piastra calda e un periodo di osservazione esteso per registrare ulteriori comportamenti nocifensivi. Classificando questi comportamenti estesi in categorie distinte (sussulto, leccamento, guardia, salto), è possibile catturare la risposta non riflessiva allo stimolo termico. Il sussulto è la rapida rimozione della zampa e/o l'apertura delle dita, ma l'arto viene rapidamente restituito alla piastra calda. Leccare e mordere le zampe posteriori e anteriori sono entrambi definiti come leccate per l'analisi. La guardia è il continuo sollevamento dell'arto oltre la fine dell'informazione nocicettiva afferente. Infine, il salto è la rimozione di tutti e quattro gli arti dalla superficie della piastra calda. Questi comportamenti possono essere analizzati singolarmente e raggruppati con particolare attenzione per annotare ancora la latenza della risposta iniziale.

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Protocollo

Tutti i metodi utilizzati durante la conduzione di questa ricerca sono stati eseguiti in conformità e con l'approvazione del Comitato amministrativo dell'Università di Stanford sulla cura degli animali da laboratorio (APLAC #33114) in conformità con le linee guida dell'American Veterinary Medical Association e dell'International Association for the Study of Pain. I topi (C57BL/6J, 9-11 settimane di età all'arrivo, 11-12 settimane di età all'inizio dello studio) sono stati alloggiati 2-5 per gabbia e mantenuti su un ciclo luce/buio di 12 ore in un ambiente a temperatura controllata con accesso ad libitum a cibo e acqua. I topi maschi pesavano circa 25 g all'inizio dello studio. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali utilizzati in questo studio.

1. Misurazioni del comportamento di base

  1. Poiché i topi imparano rapidamente con il test della piastra calda, non registrare una linea di base per i topi in questo test. Invece, confronta i topi con i controlli illesi.

2. Anestesia/preparazione

  1. Anestetizzare il topo con isoflurano per inalazione 2%-4%.
  2. Pizzicare l'alluce con una pinza e utilizzare la perdita del riflesso di pizzicamento dell'alluce per confermare la profondità dell'anestesia.
  3. Applicare generosamente il lubrificante per gli occhi sugli occhi del topo per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
  4. Metti un pezzo di garza sotto il mouse e usa un tagliacapelli per rimuovere i peli dalla gamba destra del mouse fino all'articolazione del ginocchio.
  5. Pulisci i capelli dalla zona chirurgica usando la garza, quindi scarta la garza.
  6. Disinfettare l'area chirurgica utilizzando un batuffolo di cotone imbevuto di soluzione di iodio.

3. Chirurgia

  1. Dopo aver pulito l'area chirurgica e confermato la profondità dell'anestesia, utilizzare un bisturi per praticare un'incisione cutanea sulla superficie mediale della gamba destra dalla tibia distale alla tibia prossimale, fermandosi a livello dell'articolazione inferiore del ginocchio (Figura 1A).
  2. Asciugare la zona con un batuffolo di cotone con particolare attenzione alla tibia prossimale.
  3. Utilizzando un trapano con una punta rotonda da 0,6 mm, praticare un foro all'estremità prossimale della tibia a livello della tuberosità tibiale, ~2 mm distalmente alla linea articolare (Figura 1B).
  4. Quindi, inserire un ago da 27 G attraverso questo foro/osteotomia lungo l'asse midollare dell'osso per stabilire un canale, quindi rimuovere l'ago (Figura 1B).
  5. Successivamente, utilizzare una sega per ossa per incidere la tibia all'incrocio dei terzi medio e distale (~5-6 mm distalmente al sito dell'osteotomia) dall'aspetto laterale causando un trauma al muscolo tibiale anteriore (Figura 1D).
    CRITICO: Un approccio mediale alla frattura non produrrà lesioni muscolari.
  6. Bloccare l'estremità prossimale della tibia, tenere l'estremità distale della tibia tra il pollice e l'indice e usare la contropressione per completare la frattura ossea (Figura 1C).
  7. Reinserire l'ago da 27 G nello spazio intramidollare, attraverso la tibia prossimale, e farlo avanzare attraverso il sito della frattura fino al segmento distale dell'osso per allineare la frattura.
    NOTA: Un impianto ceramico di dimensioni simili può essere inserito al posto di un ago da 27 G in applicazioni di imaging in cui il metallo è indesiderabile. Anche se non eseguito qui, un possibile impianto da considerare è una vite in ceramica (vedi la Tabella dei Materiali).
  8. Quindi, tagliare l'ago/impianto di plastica a filo con la corteccia tibiale utilizzando una pinza da taglio.
  9. Pulisci il sangue e verifica che l'emorragia si sia fermata prima di procedere.
  10. Una volta che l'emorragia si è fermata, chiudere la ferita utilizzando una sutura di seta 5-0 interrotta.
    CRITICO: Non lasciare l'animale incustodito in nessun momento dell'intervento. Osservare l'animale fino a quando non è in grado di mobilitarsi autonomamente e riportarlo ai suoi cagemati solo una volta che si è completamente ripreso.

4. Dopo l'intervento chirurgico

  1. Dopo l'intervento chirurgico, somministrare buprenorfina 0,05 mg kg-1 per iniezione sottocutanea ai topi due volte al giorno per due giorni secondo i protocolli locali.
  2. Monitorare i topi nel periodo post-anestesia e per la durata dello studio come segue: due volte al giorno per i primi 2 giorni, e poi ogni giorno fino a 3 settimane, e successivamente settimanalmente.
  3. Valutare i topi per i cambiamenti comportamentali indicativi di grave stress o malattia come letargia, pelo arruffato o perdita di peso del >20%. Prendi nota di eventuali problemi relativi alla mobilità e all'accesso al cibo o all'acqua.
    NOTA: I registri chirurgici e post-cura devono essere compilati dopo l'intervento chirurgico e ad ogni controllo e conservati a tempo indeterminato per l'audit del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali.

5. Test della piastra riscaldante

NOTA: Le misurazioni post-infortunio possono iniziare 7 giorni dopo l'intervento chirurgico di frattura tibiale. Per evitare l'effetto dell'apprendimento in questo paradigma, eseguire il test una volta dopo l'intervento chirurgico e confrontarlo con i controlli illesi.

  1. Apparecchio
    1. Posizionare la piastra riscaldante in una configurazione in cui l'illuminazione è in alto e il cilindro di plastica è centrato sulla piastra.
    2. Impostare la temperatura a 50 °C e posizionare una telecamera davanti alla piastra con cura per mantenere in vista l'intera area racchiusa.
      CRITICO: In questo studio è stata utilizzata una telecamera industriale a colori standard a 8 bit, che registra fino a 76 fps.
  2. Saggio
    1. Posiziona i topi all'interno della sala prove per almeno 30 minuti per abituarsi.
      NOTA: Assicurarsi che la sala prove non sia troppo calda o fredda per evitare di distorcere i risultati.
    2. Posiziona il mouse nel cilindro e inizia a registrare.
    3. Registra i movimenti per 45 s dopo che i piedi del mouse sono entrati in contatto per la prima volta.
    4. Ripetere i passaggi 5.2.1-5.2.3 con il resto della coorte mantenendo la temperatura per ogni prova successiva.
    5. Misura la latenza (in secondi) alla prima risposta (di solito sussulto), che è il classico risultato della piastra calda.
      NOTA: Il seguente protocollo sviluppato in questo laboratorio assegna inoltre un punteggio sia riflessivo (sussulto) che non riflessivo (leccare, fare la guardia e saltare).
  3. Analisi
    1. Assegna un punteggio alle sessioni di piastra calda utilizzando un programma di visualizzazione che fornisce un timestamp in millisecondi.
      1. Prendi in considerazione l'utilizzo del software NCH Prism su Mac OS. Scarica questo software gratuitamente online (vedi Figura 2 e Tabella dei materiali).
      2. Una volta scaricato, apri il programma e fai clic sull'opzione Continua per utilizzare la versione demo. Quindi, fai clic sul grande segno più verde per caricare le registrazioni della piastra calda.
      3. Una volta caricato, fai doppio clic su un singolo file per aprirlo in formato video. Utilizza il cursore nella parte inferiore della finestra per trascinare lentamente la lunghezza del video e iniziare a segnare.
        CRITICO: Indipendentemente dal software utilizzato, assicurati di guardare i video nella finestra più grande possibile per evitare di perdere la risoluzione temporale quando trascini il cursore del timestamp sul video.
    2. Formatta un foglio di calcolo come segue.
      1. Per eseguire correttamente gli script R forniti, scrivere i titoli delle colonne esattamente come elencato di seguito, senza maiuscole o spazi e nell'ordine elencato: mouseid, behavior, start, end.
      2. Inserire i dati nelle colonne di inizio e fine in tempo in s a tre cifre decimali senza zeri iniziali o due punti (ad esempio: 2.001)
    3. Per ogni video, registra ogni istanza di un comportamento doloroso (a ms). Si noti che vengono registrati solo i casi di comportamento del dolore da parte delle due zampe posteriori. Non registrare il comportamento delle due zampe anteriori.
      1. Registra il sussulto/sfarfallio semplicemente come "sussulto", incluso il rapido ritiro della zampa e/o l'apertura delle dita, ma l'arto viene rapidamente restituito alla piastra calda, purché non stiano esplorando/camminando. Conta anche l'apertura delle dita senza sollevare effettivamente l'intera zampa come sussulto. Non registrare il comportamento di sussulto/sfarfallio per più di 500 ms. Se registrato come tale, trascinare il cursore attraverso questo comportamento il più lentamente possibile poiché è probabile che si siano verificati diversi sussulti e/o guardie in questo intervallo.
      2. Cerca l'elevazione/protezione prolungata di un arto oltre il momento in cui termina l'informazione nocicettiva afferente e registrala come guardia.
      3. Registra il leccare/mordere una zampa posteriore come leccare.
      4. Registra la rimozione di tutti e quattro gli arti dalla piastra calda contemporaneamente come salto.
        NOTA: Se un topo sussulta, e poi con la zampa alzata, continua a partecipare leccando/proteggendo, e poi divide il comportamento senza alcuna sovrapposizione di timestamp. Crea un foglio di calcolo separato per ogni gruppo sperimentale.
    4. Usare gli script R forniti per iniziare ad analizzare i dati.
      1. Usa "Behavior_Raster_v2. R" per generare un grafico raster (come mostrato di seguito) per visualizzare il comportamento complessivo.
      2. Usa "Behavior_duration. R" per scrivere un foglio di calcolo contenente cinque fogli nella directory di lavoro.
        NOTA: il primo foglio fornisce la durata totale di tutti i comportamenti del dolore, la latenza del primo comportamento del dolore e il numero totale di comportamenti del dolore. Ogni foglio successivo fornisce queste informazioni per i comportamenti individuali del dolore.
      3. Usa "Behavior_bins. R" per scrivere due fogli di calcolo; uno con contenitori da 500 ms che mostrano la durata cumulativa del comportamento in ogni punto temporale e l'altro con l'area sotto la curva per il profilo di comportamento della durata di ciascun mouse.
      4. Infine, usa "Cumulative_Sums.R" per scrivere due fogli di calcolo ma per la somma cumulativa di un comportamento.

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Risultati

Il modello di ortotrauma con perno per frattura tibiale riproduce i comportamenti ossei, muscolari e dolorifici osservati nelle lesioni umane complesse. Come mostrato nella Figura 1C, la frattura tibiale guarisce nel tempo, formando un callo nel sito della frattura che è ancora visibile a 4 settimane dopo la lesione. Come risultato dell'approccio laterale con la sega ossea descritto sopra (passaggio 3.5), il muscolo tibiale anteriore viene danneggiato, diventando ampiamente fibrotico, come s...

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Discussione

Passaggi critici all'interno del protocollo
È fondamentale mantenere condizioni sterili durante l'intervento chirurgico. Inoltre, un'adeguata cura degli animali prima, durante e dopo l'intervento chirurgico è fondamentale per il successo della generazione del modello. Come accennato in precedenza nel protocollo, quando si esegue l'intervento chirurgico, fratturare l'osso dal lato laterale per garantire lesioni muscolari. Fare attenzione a non fratturare la tibia tropp...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse rilevanti da rivelare.

Ringraziamenti

GM è supportata da una NDSEG Graduate Fellowship e da una Stanford Bio-X Honorary Graduate Fellowship. VLT è supportato dal NIH NIGMS grant #GM137906 e dalla Rita Allen Foundation.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
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Tamponi imbevuti di alcolAmazonB00VS4F91Whttps://www.amazon.com/Dynarex-Alcohol-Prep-Sterile-Medium/dp/B00VS4F91W
Punte alternativeRio Grande341602https://www.riogrande.com/product/BuschTungstenVanadiumRoundBur
Set0314mm/341602
Attacco per trapano per sega osseaAmazonB07DSXR3NYhttps://www.amazon.com/dp/B07DSXR3NY
BuprenorfinaFidelis Pharmaceuticalshttps://ethiqaxr.com/ordering/
Impianto ceramico (alternativa al perno)RISystemRIS.221.103https://risystem.com/platefixation/mousescrew
Chux (Underpad assorbente)Fisher NC0059881 scientificahttps://www.fishersci.com/shop/products/underpad-17x24-chux-300-cs/nc0059881#?keyword=true
Topi C57BL/6JThe Jackson LaboratoryJax #00664https://www.jax.org/strain/000664
Cotton fiocUlineS-18991https://www.uline.com/Product/Detail/S-18991/First-Aid/Cotton-Tipped-Applicators-Industrial-6
Pinzeda taglioAmazonB076XYVS6Yhttps://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y
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Riferimenti

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